基于非洲豬瘟病毒截短p72蛋白的間接ELISA抗體檢測方法的建立

張文燕，王亞文，袁 晨，馮亞文，滕召劍，商佳亮，逯紀成，宋勤葉

(1.河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心，保定 071000；2.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050051；3.保定市動物疫病預防控制中心，保定 071001)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，病死率高達100%，以體溫升高、全身各組織和器官廣泛性出血、脾臟異常腫大為主要特征[1-2]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為法定報告動物疫病之一，中國將其列為一類動物傳染病。2018年8月3日，中國確診首例ASF，隨后該病在中國各個地區(qū)暴發(fā)和流行，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失[3-4]。2021年國內豬場出現(xiàn)基因突變或缺失的低毒力毒株[5-6]。該突變毒株感染豬的潛伏期和病程延長，感染豬排毒不規(guī)律，且排毒時間延長，致使ASF的防控難度加大。由于目前尚無預防和治療ASF的有效疫苗和藥物，故應用特異、敏感的病原和血清學檢測技術，準確檢測、排查和清除感染豬是控制本病的重要措施之一[4]。

ASFV是目前已知的唯一DNA蟲媒病毒，也是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的唯一成員。目前，已知的不同毒力的ASFV毒株分為8個血清群、24種基因型[7]。24種基因型在非洲均有流行，中國流行的主要為基因Ⅱ型，與格魯吉亞毒株為同一個分支。2021年在河南和山東有流行基因Ⅰ型的報道[8]。ASFV基因組長170～193 kb，包含151～167個開放閱讀框(ORFs)，編碼150～200種蛋白質(68個結構蛋白和100多個非結構蛋白)[9-10]。這些蛋白與病毒的復制、結構形態(tài)、入侵感染及誘導宿主抗感染免疫等有關。p72是ASFV二十面體的主要組成部分，對病毒衣殼的形成起著重要作用。該蛋白由B646L基因編碼，大小為73.2 ku，在病毒感染晚期表達，能誘導機體產生高效價的特異性抗體，并且在不同分離株之間高度保守，故p72是ASFV感染檢測與診斷的重要靶標[10-11]。ELISA是OIE推薦的ASF臨床血清學檢測技術，國內雖然有基于p72蛋白的ELISA抗體檢測技術的研究報告[12-14]，但目前尚缺乏理想的ASFV抗體檢測試劑盒。故本研究以p72為靶標，建立了ELISA抗體檢測方法，旨在為ASF的血清學檢測與臨床診斷提供重要技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，由河北農業(yè)大學傳染病實驗室保存。pET28a-p72s表達菌種[12]，由河北農業(yè)大學傳染病實驗室構建與保存。

1.2 材料和主要試劑

ASFV抗體標準陽性、陰性豬血清以及臨床采集的無疾病癥狀的豬的血清樣本，由保定市動物疫病預防控制中心提供；HRP-羊抗豬IgG購自北京索萊寶生物技術有限公司；ASFV多抗原(p32、p62和p72)間接ELISA試劑盒購自IDVET公司；豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗血清均購自IDEXX公司；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗血清由河北農業(yè)大學傳染病實驗室制備與保存。

1.3 重組p72s的制備

復蘇pET28a-p72s表達菌種，按照 1∶100的比例接種到新鮮Kana+/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下振搖培養(yǎng)至對數(shù)期(D600 nm值達到約0.6～0.8)時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，26 ℃誘導培養(yǎng)5 h；8 000 r/min離心7 min收集菌體沉淀，于4 ℃超聲裂解菌體35 min(超聲2 s、間歇2 s、振幅30%)；10 000 r/min離心15 min后，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，下同)，檢測蛋白的表達情況。進而用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化p72s蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測蛋白的純化結果。同時對蛋白進行Western blotting鑒定，即取p72s蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉印到醋酸纖維膜上；將膜置入5%脫脂奶粉的封閉液中，于4 ℃下孵育過夜；洗膜，加入1∶200倍稀釋的標準ASFV抗血清，室溫孵育2 h，同時設立標準ASFV陰性血清對照；洗膜，加入1∶4 000稀釋的HRP-羊抗豬IgG，室溫孵育1.5 h；洗膜，將膜置于DAB顯色液中顯色至條帶清晰。

1.4 ELISA方法的建立

1.4.1 抗原包被濃度與待檢血清稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定法同時確定抗原包被濃度和待檢血清稀釋倍數(shù)。即將重組p72s稀釋為0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，100 μL/孔加入酶標板，每個濃度重復2孔；將酶標板置37 ℃孵育1 h，4 ℃過夜；次日棄去包被液，用PBST(含0.05% Tween-20的0.01 moL/L PBS，pH 7.4)洗滌3次，3 min/次；加入封閉液(含5%犢牛血清的PBST)于37 ℃封閉1 h；分別將1∶50～1∶1 600倍比稀釋的陽性、陰性血清加入到不同濃度抗原包被的相應孔內，組成方陣，每孔100 μL，于37 ℃條件下反應1 h；洗板3次(洗滌方法同前)，每孔加入100 μL HRP-羊抗豬 IgG(1∶2 500稀釋)，于37 ℃反應45 min；洗板，加入底物(TMB)顯色液，100 μL/孔，室溫避光顯色15 min；每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。在酶標檢測儀上測定樣本D450 nm值，并計算陽性血清(P)與陰性血清(N)D450 nm值的比值(P/N值)，以確定抗原最佳包被濃度和待檢血清的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.2 封閉液與酶標抗體工作濃度的確定 將4種封閉液(含5%犢牛血清、5%脫脂奶粉、1%明膠和2%BSA的PBST)分別與1∶500、1∶1 000、1∶2 500、1∶5 000倍比稀釋的HRP-羊抗豬IgG組成方陣，進行ELISA，每個組合重復2孔。操作過程同1.4.1。根據(jù)P/N值的大小，確立最佳封閉液和酶標抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.3 反應條件的確定 通過單一變量法優(yōu)化ELISA的反應條件，即將一定濃度的重組p72s加入到酶標板的相應孔內后，分別于37 ℃孵育2 h后4 ℃過夜、37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜及4 ℃過夜等條件下包被抗原，然后按照1.4.1所述的操作過程進行ELISA，根據(jù)P/N值確定最佳抗原包被條件。隨后依次對封閉條件(分別于37 ℃和室溫條件下封閉1和2 h)、待檢血清反應條件(37 ℃或室溫下反應30或60 min)、酶標抗體反應條件(37 ℃或室溫下反應30、45或60 min)及顯色條件(室溫避光顯色10、15、20、25和30 min)進行優(yōu)化，確定ELISA的最佳反應條件。每個反應條件均重復1次。

1.4.4 陰陽性臨界值的確定 通過ELISA檢測ASFV抗體標準陽性血清和陰性血清各100份，每份血清重復1孔。用GraphPad Prism5.0軟件繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計算判定特異抗體陰、陽性臨界值，并應用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對100份陰性血清D450 nm值進行正態(tài)分布分析，評價陰陽性臨界值劃分的準確性。

1.4.5 特異性試驗 以建立的ELISA檢測PRV-gE、PRV-gB、PCV2、CSFV、PRRSV抗體陽性血清，同時設立ASFV陽性對照與陰性對照，每份血清重復2孔。檢驗其他病毒抗體血清與p72s的交叉反應情況，評價建立方法的特異性。

1.4.6 敏感性檢測 分別用建立的ELISA和商品試劑盒檢測5份(1#～5#)1∶100～1∶12 800倍比稀釋的ASFV抗體標準陽性血清(每個稀釋度重復2孔)，分析建立方法與試劑盒檢測的血清抗體效價。同時用分光光度計(NanoDrop2000)測定所建立的ELISA方法和試劑盒可檢測的血清中的最低蛋白含量。根據(jù)上述結果綜合評價建立方法的檢測靈敏度。

1.4.7 重復性試驗 用同一批次或3個批次的p72s蛋白包被酶標板，檢測9份臨床血清樣品，根據(jù)檢測結果，分別計算ELISA的變異系數(shù)，評價ELISA的批內與批間重復性。

1.5 初步應用、符合率檢驗及Western blotting驗證

同時用建立的方法和試劑盒檢測124份血清樣本，比較兩者檢測結果的符合率。隨機選擇p72s-ELISA與試劑盒檢測均為陽性的血清5份，試劑盒檢測為陰性而p72s-ELISA檢測為陽性的血清5份，以及p72s-ELISA與試劑盒檢測均為陰性的血清5份，進一步用Western blotting驗證。Western blotting的主要步驟：將SDS-PAGE后的p72s蛋白轉印到PVDF膜上，于4 ℃下封閉過夜；洗膜，加入待檢豬血清(1∶100稀釋)，室溫孵育2 h；洗膜，加入HRP-羊抗豬IgG(1∶4 000稀釋)，室溫孵育1.5 h；洗膜，將膜置于DAB顯色液中于暗處顯色，觀察結果。

2 結 果

2.1 重組p72s蛋白的制備

收集IPTG誘導5 h后的pET28a-p72s表達菌，超聲波裂解后進行SDS-PAGE檢測，可見以包涵體形式表達的目的蛋白條帶，蛋白分子質量約42 ku(圖1A)，與預期大小相符。蛋白經(jīng)鎳柱純化后，電泳無肉眼可見雜蛋白(圖1B)。Western blotting鑒定結果顯示，重組p72s蛋白能夠與標準ASFV抗血清反應，在42 ku處顯示目的條帶，而與ASFV抗體陰性血清不發(fā)生反應(圖1C)。

A，重組p72s的表達及其表達形式：M，蛋白質分子質量標準；1、2，分別為細菌誘導前與誘導后的產物；3、4，分別為菌體裂解后的上清液與沉淀。B，重組p72s的純化：M，蛋白質分子質量標準；1，蛋白洗脫液；2～5，純化蛋白樣品。C，重組p72s的Western blotting鑒定：M，蛋白質分子質量標準；1，重組p72s與ASFV陽性血清反應；2，重組p72s與ASFV陰性血清反應

2.2 最佳抗原包被濃度和待檢血清的稀釋倍數(shù)

當重組p72s以0.5～4.0 μg/mL包被、待檢血清1∶50～1∶100稀釋時，陽性血清的D450 nm值在1.108～2.612之間，陰性血清的D450 nm值在0.166～0.366之間，此時的P/N值為5.363～8.448，高于其他組合的P/N值(表1)。但當血清1∶100稀釋，蛋白包被濃度為4.0 μg/mL時，陰性血清的D450 nm值高于0.5 μg/mL包被時的D450 nm值，故本試驗確定ELISA的最適抗原包被濃度為0.5 μg/mL，待檢血清的稀釋度為1∶100。

表1 最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定(D450 nm值)

2.3 最佳封閉液和酶標抗體的稀釋倍數(shù)

由表2可知，以1%明膠和2%BSA作為封閉液時，陰性血清的D450 nm值在0.188～1.242之間，特異性不好，故首先排除這兩種封閉液。比較5%犢牛血清和5%脫脂奶粉作為封閉液時的P/N值時發(fā)現(xiàn)，后者的P/N值明顯高于前者，且用5%脫脂奶粉作為封閉液、酶標抗體作1∶5 000稀釋時，陰性血清的D450 nm值最低，且P/N值(15.019)較高。故確定ELISA的封閉液為5%脫脂奶粉，酶標抗體稀釋度為1∶5 000。

表2 最佳封閉液和酶標抗體稀釋度的確定(D450 nm值)

2.4 最佳反應條件

通過比較不同反應條件下的P/N值，發(fā)現(xiàn)當抗原包被酶標板后于37 ℃孵育1 h，再于4 ℃吸附過夜，加入封閉液于37 ℃封閉1 h或者于室溫下封閉2 h，抗原與待檢血清在37 ℃反應60 min，待檢血清與酶標抗體在37 ℃反應45 min，底物于室溫避光顯色20 min時，ELISA的P/N值最大，分別為22.523、16.232或16.788、12.297、9.916和17.413，故確定上述條件為所建立的ELISA(p72s-ELISA)方法的最佳反應條件。

2.5 陰陽性臨界值測定結果

應用ROC曲線分析p72s-ELISA檢測的100份抗ASFV標準陽性和100份標準陰性血清的D450 nm值，結果顯示曲線下面積(AUC)為0.999(95%CI=0.9954～1.0000)，以0.365為臨界值，約登指數(shù)(0.99)最大，靈敏度為0.99(95%CI=0.9455～0.9997)，特異性為1(95%CI=0.9638～1.0000)，故當D450 nm值≥0.365時，判定為陽性；當D450 nm值<0.365時，判定為陰性(圖2A)。進一步對上述100份陰性血清的D450 nm值進行的正態(tài)分布分析，結果顯示p72s-ELISA偏度系數(shù)為0.156，峰度系數(shù)—0.487，均<1，單樣本K-S檢驗結果顯示P=0.200(圖2B)。表明p72s-ELISA的檢測結果服從正態(tài)分布。

A，臨界值；B，正態(tài)分布分析

2.6 特異性試驗結果

用p72s-ELISA方法檢測PRV-gE、PRV-gB、PCV2、CSFV和PRRSV抗血清時，D450 nm值均低于臨界值(0.365)(圖3)，表明p72s-ELISA方法具有良好的特異性。

圖3 p72s-ELISA的特異性檢測

2.7 敏感性檢測結果

用p72s-ELISA和商品試劑盒同時檢測5份ASFV抗體標準陽性血清，結果p72s-ELISA檢測的血清抗體效價分別為1∶800、1∶1 600、1∶800、1∶800和1∶800，試劑盒檢測的抗體效價分別為：1∶200、1∶200、陰性、1∶800和1∶800(圖4)。p72s-ELISA和試劑盒可檢測到相應血清的總蛋白含量分別在0.091～0.153和0.110～0.554 mg/mL之間。上述結果表明，建立的p72s-ELISA方法具有很高的敏感性。

圖4 p72s-ELISA(A)與商品試劑盒(B)的敏感性比較

2.8 重復性試驗結果

分別用同一批次和不同批次的p72s-ELISA檢測9份血清，結果如表3與表4所示，批內重復性試驗的變異系數(shù)(CV)為0.736%～9.158%，批間重復性試驗的變異系數(shù)為2.944%～8.205%，均低于10%。該結果表明，建立的ELISA方法均具有良好的重復性。

表3 p72s-ELISA批內重復性試驗結果(D450 nm值)

表4 p72s-ELISA批間重復性試驗結果(D450 nm值)

2.9 初步臨床應用、符合率及驗證

分別用建立的p72s-ELISA和商品試劑盒檢測124份血清樣本，結果如表5所示，p72s-ELISA和商品試劑盒的ASF抗體陽性檢出率分別為75.81%(94/124)和32.26%(40/124)，ASF抗體陰性檢出率分別為24.19%(30/124)和67.74%(84/124)。p72s-ELISA與商品試劑盒的陽性符合率為100%，陰性符合率為35.71%，總符合率均為56.45%。進一步用Western blotting對p72s-ELISA與試劑盒檢測結果相符和不符的15份血清進行驗證，結果顯示，p72s-ELISA與試劑盒檢測結果同為陽性、試劑盒檢測為陰性而ELISA檢測為陽性的血清，Western blotting檢測均出現(xiàn)目的條帶；試劑盒和ELISA檢測均為陰性的血清無目的條帶出現(xiàn)(圖5)。上述結果表明，p72s-ELISA的檢測結果與Western blotting檢測結果完全一致，其ASFV抗體陽性檢出率高于商品試劑盒。

表5 p72s-ELISA與ELISA試劑盒的符合率

M，蛋白質分子質量標準；1～5，p72s-ELISA與試劑盒檢測均為抗體陽性的血清；6～10，p72s-ELISA檢測抗體陽性、試劑盒檢測為抗體陰性的血清；11～15，p72s-ELISA與試劑盒檢測均為陰性的血清；16，陽性對照；17，陰性對照

3 討 論

ASF在全球的流行區(qū)域不斷增加，快速檢測和及時確診感染豬或發(fā)病豬是有效控制該病的主要措施。已知隨著ASFV毒株的毒力、感染途徑、感染劑量及宿主的抵抗力不同，ASF的臨床經(jīng)過表現(xiàn)為最急性、急性、亞急性和慢性型等多種形式，致使該病的臨床癥狀與病理變化復雜多樣[1-2]，尤其是ASFV變異減毒株在中國豬場的出現(xiàn)，增加了非洲豬瘟流行的隱蔽性，同時給該病的臨床診斷和防控帶來了新的挑戰(zhàn)[5-6]。應用PCR檢測唾液和血液樣本中的病毒核酸是篩查ASFV感染豬的重要手段[1-2]，但由于ASFV慢性和亞臨床感染豬的排毒沒有規(guī)律，僅僅依靠PCR檢測，常出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，故需要結合抗體檢測結果，以保證篩檢的準確性[1-2]。鑒于此，不斷改進和完善診斷與監(jiān)測手段對于ASF的有效防控至關重要。

ELISA是廣泛用于快速檢測特異性抗體的常用檢測技術，其不僅敏感性和特異性高，而且適于樣本的批量檢測和商品化。用于ELISA的檢測抗原可以是完整的病原微生物，也可以是來自病原微生物或體外表達的蛋白。由于ASF是中國規(guī)定的一類動物疫病，培養(yǎng)和純化ASFV需要生物安全防護3級(P3)實驗室，培養(yǎng)與純化病毒成本高，并且在操作過程中存在散毒的安全隱患，而應用原核或真核表達系統(tǒng)表達的蛋白作為檢測抗原，具有特異、敏感、成本低、安全等優(yōu)勢。因此，現(xiàn)在常通過體外表達手段，制備目標蛋白作為ELISA用抗原[13-16]。相對于真核表達系統(tǒng)，原核表達系統(tǒng)操作簡單、成本低，所以本試驗采用原核表達系統(tǒng)來表達p72s蛋白。

ELISA結果的臨界值確定直接關系到檢測結果的準確性，臨界值過高或過低會導致檢測結果出現(xiàn)假陰性或假陽性。為了保證建立方法結果判定的客觀性，本研究采用ROC曲線分析方法確定陰陽性臨界值，同時對已知陰性樣本進行正態(tài)分布分析。已知進行ROC曲線分析時，常用約登指數(shù)來評判方法的準確性，約登指數(shù)越大說明所建立方法的靈敏度越高、特異性越強[17-18]。本試驗中約登指數(shù)的最大值為0.99，AUC為0.999，并且樣本檢測結果服從正態(tài)分布，說明所建立方法同時具有很高的靈敏度、特異性與客觀性。建立的p72s-ELISA方法與常見的CSFV、PRRSV、PRV等病毒無交叉反應，批內與批間重復試驗的變異系數(shù)均低于10%，說明所建立的方法的特異性高、重復性好，這些特征與文獻[13-15]報道的相似。但本研究不僅與商品試劑盒進行了比較，發(fā)現(xiàn)建立方法的敏感性和對血清樣本的陽性檢出率更高，而且為了確保檢測結果的準確性，還應用Western blotting對ELISA的結果進行驗證，其結果與ELISA的檢測結果完全一致，說明建立的ELISA方法具有更高的檢測敏感性與準確性。

4 結 論

本研究建立了基于ASFV截短p72蛋白的間接ELISA抗體檢測方法，該方法的抗原最佳包被濃度為0.5 μg/mL，待檢血清的稀釋度為1∶100；與PRV、PCV2、CSFV和PRRSV等病毒抗血清均無交叉反應；能檢測到ASFV抗血清中的總蛋白量為0.091～0.153 mg/mL，具有良好批內與批間重復性；對血清樣本的陽性檢出率高于商品試劑盒。建立的間接ELISA方法可以為ASF的血清學調查、臨床診斷及其綜合防控提供重要技術支撐，具有顯著的應用開發(fā)潛力。