紫錐菊根中菊苣酸提取工藝及對(duì)氧化應(yīng)激腸道細(xì)胞的保護(hù)作用研究

李一鵬，張 虎，任 娟，任 欣，劉聚祥，王庚南

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

目前，中藥免疫增強(qiáng)劑成為畜牧養(yǎng)殖業(yè)研究熱點(diǎn)，其不但能夠提高機(jī)體的免疫水平，還能夠避免長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的毒副作用以及藥物殘留等問(wèn)題[1]。菊苣酸是一種可以從紫錐菊、菊苣等菊科植物中廣泛提取出來(lái)的咖啡酸衍生物，又名二咖啡酰酒石酸。研究顯示，菊苣酸作為一種中藥提取物具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、提高機(jī)體免疫力等藥理功效[2]。紫錐菊的地上部分及根中均含菊苣酸[3]，而根中菊苣酸含量最高。伏健[4]曾用乙醇回流法對(duì)紫錐菊頭狀花序進(jìn)行提取試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝得到了菊苣酸含量為0.45%。孟創(chuàng)鴿[5]用超聲波提取法提取了紫錐菊莖部的菊苣酸，菊苣酸得率為1.51 mg/g。也有學(xué)者利用加熱回流[6]及超聲波協(xié)同方法[7]對(duì)紫錐菊根部進(jìn)行了研究，但提取率相對(duì)較低。用更安全的提取溶劑更簡(jiǎn)便的提取方法，更能迎合工業(yè)化生產(chǎn)的需求，所以本研究以紫錐菊根為原料，乙醇為溶劑，超聲提取為手段，優(yōu)化菊苣酸的提取工藝。

氧化應(yīng)激是指動(dòng)物機(jī)體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量的氧化自由基和活性氧，可能會(huì)造成機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的失衡，造成一定程度的氧化損傷。在動(dòng)物的集約化養(yǎng)殖過(guò)程中，氧化應(yīng)激的危害已經(jīng)十分明顯，如心臟病、乳房炎、腎病、消化道炎癥等疾病都可能通過(guò)氧化應(yīng)激導(dǎo)致，很大程度上影響了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[8]。而造成動(dòng)物氧化應(yīng)激的原因多種多樣，如環(huán)境因素、自身狀態(tài)的改變、外源致病菌或病毒等[9]。在蛋雞的養(yǎng)殖中，氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期繁殖性能造成影響[10]，Tarin[11]首次提出蛋雞卵巢老化是由于胞內(nèi)活性氧的積聚和與衰老相關(guān)的細(xì)胞損傷造成的；仔豬的氧化應(yīng)激會(huì)造成采食量和平均日增重的下降[12]；更有研究顯示，母牛在高產(chǎn)期由于體內(nèi)大量的代謝活動(dòng)，造成活性氧的聚積，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量和乳制品的質(zhì)量有一定影響[13]。故抗氧化劑的研究和發(fā)展對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及對(duì)提高畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)品的質(zhì)量有著重大意義。

研究表明，菊苣酸可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛的積累、清除自由基、抑制氧化低密度脂蛋白等方式，發(fā)揮抗氧化損傷的藥理作用[14]。Liu等[15]通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)證明菊苣酸清除DPPH·、·OH和ABTS·+自由基的能力很強(qiáng)，高于咖啡酸和酒石酸的抗氧化能力。常小文[16]以人肝癌細(xì)胞(Hep G2)細(xì)胞為研究對(duì)象，證明了菊苣酸體內(nèi)甲基化代謝產(chǎn)物對(duì)該細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有較強(qiáng)的抗氧化活性，且菊苣酸甲基化的程度越高，其抗氧化活性就越強(qiáng)?？诜亲畛Ｓ们沂沁m應(yīng)性最佳的給藥方式，但目前菊苣酸對(duì)腸道細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷作用鮮有報(bào)道。本研究針對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)及豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)兩種腸道細(xì)胞，構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，進(jìn)一步證明菊苣酸在腸道細(xì)胞中的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和主要試劑 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞)購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞庫(kù)；豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)購(gòu)自北納生物科技有限公司。紫錐菊根粉末(80目)由上海源葉生物科技有限公司提供；菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；無(wú)水乙醇由天津北辰方正試劑廠生產(chǎn)；乙腈(色譜級(jí))和甲醇(色譜級(jí))均購(gòu)自德國(guó)默克股份兩合公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和HBSS溶液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 液相色譜儀(HPLC1525)產(chǎn)自Waters公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀產(chǎn)自昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)產(chǎn)自上海安亭科學(xué)儀器廠；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 二元溶劑泵(Waters1525)，自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters2487)，二極管陣列檢測(cè)器(PDA,Waters2998)，Waters Sunfire 反相C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液(A)和乙腈(B)，等度洗脫流動(dòng)相比例A∶B為7∶3，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱量1.0 mg菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于流動(dòng)相中，配制成1 mg/mL，再稀釋成500、200、100、50、20 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，以菊苣酸濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 檢測(cè)限及定量限 配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜檢測(cè)，當(dāng)信號(hào)和噪音的比值(S/N)為3時(shí)即為方法的檢測(cè)限，當(dāng)S/N=10，且將此時(shí)的濃度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，實(shí)測(cè)濃度和規(guī)定濃度偏差在±20%以內(nèi)時(shí)，所得濃度即為定量限。

1.2.4 超聲輔助提取單因素試驗(yàn) 稱取10.0 g紫錐菊根粉末，放入250 mL圓底燒瓶中，以不同濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇作為提取劑，按照不同料液比(1∶12、1∶15、1∶18、1∶21)進(jìn)行混勻后，在不同溫度(40、50、60、70、80 ℃)下進(jìn)行最大功率的超聲提取(1、2、3次)，提取不同時(shí)間(1、2、3 h)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素所得提取液進(jìn)行冷凍干燥，稱重，取一定量樣品溶解進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，每個(gè)因素進(jìn)行3次平行試驗(yàn)計(jì)算菊苣酸得率。

1.2.5 超聲輔助提取正交試驗(yàn) 選取各個(gè)單因素最優(yōu)條件以及最優(yōu)條件相鄰的兩個(gè)條件，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，設(shè)置時(shí)間、溫度、料液比和乙醇濃度為影響因素，選取能夠提取出最高含量菊苣酸的提取工藝，各項(xiàng)參數(shù)如表1所示，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

表1 因素水平表

1.2.6 菊苣酸細(xì)胞毒性試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104/孔接種到96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將每孔中的培養(yǎng)基取出棄去，用PBS溶液沖洗3次，分別加入不同濃度的菊苣酸(100、200、400、600、1 000 μmol/L)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔中加入100 μL DMSO，避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值(D570 nm)。并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組D570 nm/對(duì)照組D570 nm)×100%。

1.2.7 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的構(gòu)建 將細(xì)胞接種到96孔板中，以H2O2為造模劑，加入不同濃度的H2O2(100、200、400、600、800、1 000 μmol/L)，培養(yǎng)4 h，用MTT法檢測(cè)各個(gè)孔的吸光度并計(jì)算各個(gè)濃度下細(xì)胞的存活率。當(dāng)細(xì)胞存活率處在50%～70%[17]時(shí)，即構(gòu)建氧化應(yīng)激模型成功。

1.2.8 菊苣酸對(duì)細(xì)胞氧化損傷保護(hù)效果試驗(yàn) 將細(xì)胞接種到96孔板中，加入不同濃度菊苣酸(100、200、400、600、800、1 000 μmol/L)，以抗壞血酸(200 μmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照，以等體積HBSS溶液為陰性對(duì)照，孵育24 h后除對(duì)照組外，其余組分別加入一定量的H2O2溶液(濃度通過(guò)1.2.7的結(jié)果確定)，孵育4 h后用MTT法檢測(cè)各個(gè)孔的吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)、藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.9 菊苣酸對(duì)氧化損傷應(yīng)激細(xì)胞的緩解效果試驗(yàn) 在構(gòu)建的氧化損傷細(xì)胞中加入不同濃度的菊苣酸(濃度同1.2.8)，以抗壞血酸(200 μmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照，以等體積HBSS溶液為陰性對(duì)照，孵育24 h后，用MTT法檢測(cè)各個(gè)孔的吸光度(D570 nm)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)HPLC的結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為：Y=105.4X-47225，R2>0.999。

2.2 檢測(cè)限和最低定量限

以信噪比(S/N)=3為檢測(cè)限，S/N=10為定量限，經(jīng)測(cè)定檢測(cè)限為50 ng/mL，最低定量限為100 ng/mL。

2.3 超聲輔助提取菊苣酸單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18料液比加入80%濃度乙醇，在60 ℃下分別超聲1、2、3 h，經(jīng)HPLC檢測(cè)后結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖1A可知超聲2 h之內(nèi)菊苣酸得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，但在2 h之后，菊苣酸得率無(wú)明顯變化，提取時(shí)間選用2 h為佳。

2.3.2 乙醇濃度對(duì)菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18料液比加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在60 ℃下超聲2 h，經(jīng)HPLC檢測(cè)所得結(jié)果見(jiàn)圖1B。由圖1B可知，當(dāng)乙醇濃度的小于40%時(shí)，隨著濃度的升高菊苣酸得率增大，到40%達(dá)到最大，但是繼續(xù)增大乙醇濃度其得率呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，因此選用40%濃度的乙醇溶液為正交試驗(yàn)的中間濃度。

2.3.3 溫度對(duì)菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18料液比加入80%濃度乙醇，分別在50、60、70、80 ℃下超聲2 h，經(jīng)HPLC檢測(cè)所得結(jié)果見(jiàn)圖1C。由圖1C可知，在60 ℃以下，隨著溫度的升高，菊苣酸得率逐漸升高，而60 ℃之后菊苣酸得率隨溫度的升高而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，因此在60 ℃左右對(duì)紫錐菊根粉末提取能夠得到較多的菊苣酸。

2.3.4 料液比對(duì)菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶12、1∶15、1∶18、1∶21料液比加入80%濃度乙醇，在60 ℃下超聲2 h，經(jīng)HPLC檢測(cè)所得結(jié)果見(jiàn)圖1D。由圖1D可知，在15倍體積提取溶劑之前隨著料液比的增加提取率有所提高，但繼續(xù)增大溶劑量，菊苣酸的提取率逐漸變小，故選用料液比為1∶15為宜。

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18的料液比在60 ℃下進(jìn)行超聲輔助提取2 h，取樣后進(jìn)行抽濾，將殘?jiān)占侔凑?∶18的料液比進(jìn)行提取，總共提取3次，測(cè)得結(jié)果如圖1E。由圖1E可知，提取1次時(shí)紫錐菊根粉末中菊苣酸絕大部分被提出，只是剩余一小部分殘存，出于經(jīng)濟(jì)、時(shí)間方面考慮，提取次數(shù)為1次。

圖1 超聲輔助提取菊苣酸單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4 超聲輔助提取菊苣酸正交試驗(yàn)

由表2可知，在所選擇的4個(gè)因素中溫度對(duì)菊苣酸提取率影響最大，溶劑濃度次之，料液比和時(shí)間對(duì)得率影響相對(duì)較小，主次順序?yàn)椋簻囟?溶劑濃度>料液比=時(shí)間，選擇最優(yōu)水平溫度為70 ℃，料液比為1∶18，超聲時(shí)間為2 h，溶劑濃度選擇50%，按照最優(yōu)組合，即50%乙醇濃度按照1∶18的料液比，在70 ℃下超聲2 h提取，菊苣酸提取得率為1.89 mg/g。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 菊苣酸的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

用不同濃度的菊苣酸孵育細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率如圖2所示，菊苣酸濃度在100～1 000 μmol/L的范圍下，Caco-2和IPEC-J2細(xì)胞的存活率均在90%以上，故菊苣酸在100～1 000 μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)Caco-2和IPEC-J2細(xì)胞均沒(méi)有毒性。

圖2 不同濃度的菊苣酸處理24 h對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.6 細(xì)胞氧化損傷應(yīng)激模型建立最佳濃度

由圖3可知，當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率為62.43%，處在50%～70%之間，可以作為Caco-2細(xì)胞氧化損傷應(yīng)激模型建立的最優(yōu)濃度。當(dāng)H2O2濃度為400 μmol/L時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞存活率為62.06%，處在50%～70%之間，可以作為IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷應(yīng)激模型建立的最優(yōu)濃度。

圖3 不同濃度H2O2處理4 h對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.7 菊苣酸對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果

如圖4所示，在用不同濃度菊苣酸處理細(xì)胞后，再用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化損傷，當(dāng)菊苣酸濃度為800 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率最高，為74%，與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)；當(dāng)菊苣酸濃度為100 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率為54.5%，與陰性對(duì)照組相當(dāng)；經(jīng)過(guò)計(jì)算，Caco-2細(xì)胞的IC50值為172.6 μmol/L。

圖4 不同濃度的菊苣酸對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果

當(dāng)菊苣酸濃度為600 μmol/L時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞的存活率最高，為67.53%；當(dāng)菊苣酸濃度為100 μmol/L時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞的存活率為51.8%，與陰性對(duì)照組相當(dāng)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，IPEC-J2細(xì)胞的IC50值為133.1 μmol/L。

2.8 菊苣酸對(duì)細(xì)胞氧化損傷的緩解效果

由圖5可知，當(dāng)菊苣酸濃度為400 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞的存活率最高，為70.2%；當(dāng)菊苣酸濃度為100 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞的存活率最低，為52.8%。經(jīng)過(guò)計(jì)算，其IC50值為207.5 μmol/L。

圖5 不同濃度的菊苣酸對(duì)細(xì)胞氧化損傷的緩解效果

當(dāng)菊苣酸濃度為100 μmol/L時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞的存活率最高，為75.92%；當(dāng)菊苣酸濃度為1 000 μmol/L時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞的存活率為57.33%，與陰性對(duì)照組相當(dāng)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，IPEC-J2細(xì)胞的IC50值為196.5 μmol/L。

3 討 論

菊苣酸的獲取途徑包括用化學(xué)方法合成[18]以及從植物體內(nèi)提取純化。但由于用化學(xué)合成法容易產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，造成一定程度的環(huán)境污染，且長(zhǎng)期服用容易產(chǎn)生耐藥性或造成肝腎損傷。所以天然植物中的菊苣酸提取工藝的優(yōu)化是重中之重。在有關(guān)菊苣酸提取的相關(guān)文獻(xiàn)中，多以紫錐菊全草或是地上部分為原料，而在相關(guān)研究中菊苣酸在紫錐菊的花和根中含量豐富，分別為1.2%～3.1%和0.6%～2.1%[19]，且根部含量最高，所以本研究選用紫錐菊根粉作為原材料。而較短的提取時(shí)間，較少的提取次數(shù)，簡(jiǎn)單的提取方法，安全的提取溶劑更能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)的回流提取[20]及超聲輔助提取法[5]，本提取工藝更加便捷，省時(shí)，且得率較高。

對(duì)于氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型的建立，應(yīng)激源的選擇多種多樣，前人通過(guò)很多試驗(yàn)證明了很多應(yīng)激源均可以成功構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。除H2O2[21]、MPP+[22]、6-OHDA[23]等化學(xué)類應(yīng)激源外，還包括一些物理類應(yīng)激源與生物類應(yīng)激源[24]。本試驗(yàn)選用H2O2為應(yīng)激源進(jìn)行細(xì)胞氧化損傷應(yīng)激模型的建立，其優(yōu)點(diǎn)在于H2O2性質(zhì)穩(wěn)定，易于獲得、成本較低且效果明顯。此外在建立細(xì)胞氧化損傷應(yīng)激模型的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，IPEC-J2與Caco-2細(xì)胞所需的H2O2溶液的濃度并不一致，說(shuō)明不同的細(xì)胞系對(duì)H2O2溶液的氧化應(yīng)激效果有所差異。

天然酚酸及多糖類藥物均有良好的抗氧化效果，而菊苣酸是從紫錐菊等菊科植物中提取出來(lái)的天然酚酸類化合物。在本研究中菊苣酸作用于兩種腸道細(xì)胞的氧化應(yīng)激保護(hù)和緩解作用的IC50值在133.1～207.5 μmol/L之間，均遠(yuǎn)小于文獻(xiàn)中用DPPH法測(cè)定的茶多酚的抗氧化IC50值(0.143 mg/mL)，與三七多糖的抗氧化IC50值(0.055 mg/mL)相接近[25]，同時(shí)在選定濃度下最強(qiáng)的抗氧化效果與所選定的陽(yáng)性藥物抗壞血酸相當(dāng)，且保護(hù)效果的IC50值小于緩解效果的IC50值，顯示菊苣酸在這兩種腸道細(xì)胞中具有很好的氧化損傷保護(hù)和緩解效果，且對(duì)氧化損傷的保護(hù)效果明顯優(yōu)于其緩解效果，在一定程度上證明了菊苣酸具有成為腸道細(xì)胞的天然抗氧劑的潛力。

4 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)了4個(gè)因素3個(gè)水平正交試驗(yàn)，對(duì)提取方案進(jìn)行優(yōu)化，最終得到了菊苣酸提取率最高的優(yōu)化方案為：50%乙醇濃度按照1∶18的料液比，在70 ℃下超聲2 h提取，最終菊苣酸提取得率為1.89 mg/g。并發(fā)現(xiàn)菊苣酸對(duì)Caco-2和IPEC-J2兩種腸道細(xì)胞均有很強(qiáng)的保護(hù)和緩解氧化損傷的效果，其保護(hù)作用的IC50值分別為172.6和133.1 μmol/L，緩解作用的IC50值分別為207.5和196.5 μmol/L。