新西蘭白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其對繁殖相關(guān)基因的影響

白少成，周 娟，靳榮帥，王 璠，盧婷婷，湯先偉，趙博昊，吳信生，陳 陽

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225000；2.江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，邳州 221300)

細(xì)胞色素P450家族成員11A1(CYP11A1)是一種膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)，負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞色素P450超家族的線粒體酶，可以催化膽固醇為孕烯醇酮，是類固醇激素合成的關(guān)鍵限速酶[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CYP11A1基因在人類孕期發(fā)生突變會影響胎兒的性別以及引發(fā)多囊卵巢綜合征、子宮癌等多種繁殖疾病[2]。CYP11A1基因在家禽卵泡發(fā)育過程中受激素的調(diào)控出現(xiàn)明顯的變化，Xu等[3]通過檢測鵝卵巢組織中CYP11A1基因的相對表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該基因在高產(chǎn)揚(yáng)州鵝的卵巢組織中極顯著高于低產(chǎn)的浙東鵝。張艷萍[4]研究表明，在低產(chǎn)蛋量雞品種中CYP11A1基因mRNA相對表達(dá)水平顯著高于高產(chǎn)蛋雞，這可能是因?yàn)槁殉步M織類固醇激素的增加，孕酮在卵巢中的積累抑制了CYP11A1基因的表達(dá)。綜上所述，推斷CYP11A1基因在動物的繁殖性能中發(fā)揮著重要作用。

顆粒細(xì)胞是卵泡中與卵母細(xì)胞相互作用的一類體細(xì)胞，其增殖與分化影響著卵泡的生長啟動、發(fā)育、黃體形成以及維持激素分泌的能力，是一種用來檢測卵巢功能的細(xì)胞[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP11A1基因在禽類卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)受激素調(diào)節(jié)而影響卵泡的發(fā)育[6]。羥基類固醇17-β脫氫酶1(HSD17B1)編碼的蛋白可以催化雌酮生成雌二醇，雌二醇作為雌激素中活性最高的激素，其含量的高低影響卵泡顆粒細(xì)胞的質(zhì)量。研究表明，HSD17B1基因在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子p53的調(diào)控[7]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)是一種卵母細(xì)胞分泌因子，Su等[8]發(fā)現(xiàn)，類固醇合成相關(guān)基因在BMP15基因敲除小鼠的卵丘顆粒細(xì)胞中異常降低，同時膽固醇合成減少，說明該基因可以調(diào)控卵泡類固醇激素的合成。促卵泡刺激素受體(FSHR)作為卵巢中調(diào)控促卵泡素(FSH)生成的關(guān)鍵因子，其在促進(jìn)卵泡成熟、調(diào)控性激素分泌、維持性腺正常發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要作用[9]。FSHR在雌性動物中的結(jié)合位點(diǎn)分布于顆粒細(xì)胞，且具有高度特異性，因此常被用于鑒定卵巢顆粒細(xì)胞[10]。因此，分析CYP11A1基因在卵巢顆粒細(xì)胞中對HSD17B1、BMP15、FSHR基因的調(diào)控作用，有助于揭示其在動物繁殖生理中的生物學(xué)功能。

CYP11A1基因作為卵泡類固醇合成過程中的重要因子，其在兔卵巢顆粒細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制鮮見報道。本研究通過克隆新西蘭白兔CYP11A1基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建pcDNA3.1-CYP11A1過表達(dá)重組載體和siRNA-CYP11A1，分離并鑒定兔卵巢顆粒細(xì)胞，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在兔卵巢顆粒細(xì)胞中過表達(dá)和干擾CYP11A1基因的表達(dá)，分析其與繁殖性能相關(guān)基因HSD17B1、BMP15和FSHR的關(guān)系，以驗(yàn)證該基因是否參與調(diào)控卵巢功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 3只體重(3.00±0.24)kg、健康的4～6月齡性成熟新西蘭白兔母兔，由江蘇省南京市金陵種兔場提供。

1.1.2 主要試劑 動物組織總RNA提取試劑盒(DP431)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量(DP118)試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis(+gDNA wiper)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix、2×Phanta Max Master Mix以及ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit均購自諾唯贊生物科技有限公司；pcDNA3.1(+)載體為揚(yáng)州大學(xué)動物遺傳資源實(shí)驗(yàn)室保存；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone公司；雙抗(青霉素-鏈霉素混合液，100×)、4%多聚甲醛固定液、Triton X-100均購自北京索萊寶科技有限公司；Anti-FSHR一抗和羊抗兔IgG H&L(FITC)二抗分別購自Affinity和Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1CYP11A1基因克隆和pcDNA3.1-CYP11A1過表達(dá)重組載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中兔CYP11A1基因的序列，利用CE Design軟件設(shè)計(jì)含有NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的一步克隆引物CDS-CYP11A1(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以兔卵巢組織cDNA為模板，對CYP11A1基因CDS序列全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒回收純化。膠回收純化后，在同源重組酶Exane?Ⅱ的作用下37 ℃反應(yīng)30 min進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂勻在含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)14 h。次日，隨機(jī)挑選單克隆菌落，置于含氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩12 h，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，由北京擎科新業(yè)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 通過Mega 5.1軟件比對家兔(登錄號：XP_008251956.1)CYP11A1蛋白與雞(登錄號：NP_001001756.2)、豬(登錄號：NP_999592.1)、家鼠(登錄號：NP_001333716.1)、人(登錄號：ALQ33469.1)、牛(登錄號：AAI33390.1)、綿羊(登錄號：NP_001087258.1)、馬(登錄號：NP_001075990.1)、猩猩(登錄號：PNI37685.1)和犬(登錄號：XP_038298856.1)的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 CYP11A1生物信息學(xué)預(yù)測 用ProtParam在線軟件(https:∥web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)[11]分析CYP11A1蛋白的氨基酸組成；用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/cgi-bin/protscale/)[12]分析親/疏水性；用PSORT Ⅱ在線軟件(https:∥psort.hgc.jp/)[13]預(yù)測CYP11A1蛋白的亞細(xì)胞定位；用NetPhos在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[14]預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；用CDD database在線軟件(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[11]預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域；用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/)[15]預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)[16]預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)；用STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/cgi/input.pl)[17]進(jìn)行CYP11A1蛋白互作分析。

1.2.4 兔卵巢顆粒細(xì)胞的分離與鑒定 3只母兔每只大腿肌肉外側(cè)注射孕馬血清促性腺激素80 IU，6 h后以耳緣靜脈注射空氣法處死，立即采集卵巢組織并置于含雙抗的PBS中清洗。將卵巢置于含雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中，用1 mL注射器針頭刺破卵泡，37 ℃沉降15 min，收集細(xì)胞液，用200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM/F12(含15%胎牛血清、1%雙抗)培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞后接種到6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min；用PBS清洗3次，0.3% Trition X-100處理60 min；PBS洗3次，1% BSA室溫封閉60 min；PBS清洗3次，加入Anti-FSHR一抗(1∶250)4 ℃過夜孵育，用PBST清洗后加入山羊抗兔IgG(FITC，1∶2 000)，37 ℃孵育60 min；用PBST清洗，加入DAPI染色10 min，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 過表達(dá)和干擾兔顆粒細(xì)胞中CYP11A1基因的表達(dá) 根據(jù)兔CYP11A1基因的CDS序列，由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)并合成3對siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)及其陰性對照(NC)(表2)。待顆粒細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時接種到24孔板中，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行過表達(dá)和下調(diào)CYP11A1基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。用Opti-MEM稀釋pcDNA3.1-CYP11A1質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)、3對siRNA、NC，分別與轉(zhuǎn)染試劑混合孵育15 min后，加到DMEM/F12培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞備用。

表1 引物信息

表2 siRNA信息

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測基因的表達(dá) Trizol法提取兔卵巢組織以及各轉(zhuǎn)染組顆粒細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中家兔CYP11A1基因及繁殖相關(guān)基因HSD17B1、FSHR、BMP15的mRNA序列，利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。以GAPDH作為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物(0.5 μmol/L)各0.4 μL，50 × ROX Reference Dye 0.4 μL，2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在Excel中完成各類數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，以2-△△Ct法計(jì)算基因相對表達(dá)量，用SPSS 25.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CYP11A1基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，CYP11A1基因克隆片段大小為1 557 bp(圖1A)，與預(yù)期大小相符；將其克隆至pcDNA3.1(+)載體，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒后測序，所獲序列長1 557 bp。將兔CYP11A1與pCDNA3.1(+)載體連接，獲得pcDNA3.1-CYP11A1質(zhì)粒(圖1B)。通過BLAST比對測序結(jié)果與NCBI提供的CYP11A1基因序列，發(fā)現(xiàn)序列相似性達(dá)到100%。

M1，DL2000 DNA Marker；1，CYP11A1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；M2，DL5000 DNA Marker；2，pcDNA3.1-CYP11A1雙酶切鑒定

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

CYP11A1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，雞形成獨(dú)立分支，家兔與豬、鼠、人、牛、綿羊、馬、猩猩和犬構(gòu)成另外一個分支，并與家鼠、人和猩猩的分子進(jìn)化距離最近，表明親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖2 CYP11A1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 CYP11A1基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 基本理化性質(zhì) 利用ExPASy在線軟件對兔CYP11A1氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CYP11A1蛋白分子質(zhì)量為51 016.38 u，分子式為C2297H3546N636O648S18。應(yīng)用ProtParam在線軟件分析顯示，CYP11A1基因編碼518個氨基酸，其中含量最高的為亮氨酸(Leu，10.6%)，其次為精氨酸(Arg，7.6%)、纈氨酸(Val，7.4%)、丙氨酸(Ala，7.2%)(表3)。Protparam在線軟件預(yù)測顯示，CYP11A1蛋白理論等電點(diǎn)為7.40，正負(fù)電荷殘基總數(shù)均為50個，脂肪族氨基酸指數(shù)為82.16，不穩(wěn)定性指數(shù)為39.54，總平均親水性―0.339。氨基酸序列中親水性殘基的數(shù)量多于疏水性殘基(圖3)，說明CYP11A1蛋白為親水性蛋白。

表3 兔CYP11A1蛋白氨基酸組成

圖3 兔CYP11A1蛋白親水性分析

2.3.2 磷酸化位點(diǎn)和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測 NetPhos在線軟件預(yù)測顯示，CYP11A1蛋白有40個潛在磷酸化位點(diǎn)，包括22個絲氨酸(Serine)、13個蘇氨酸(Threonine)和5個酪氨酸(Tyrosine)(圖4)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，CYP11A1蛋白主要分布于線粒體(52.2%)，其次為細(xì)胞核(13.0%)和細(xì)胞質(zhì)(17.4%)(表4)。利用CDD工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CYP11A1蛋白含有1個P450家族的結(jié)構(gòu)域(圖5)。

圖4 兔CYP11A1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

表4 兔CYP11A1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

圖5 兔CYP11A1蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3.3 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用ExPASy軟件預(yù)測CYP11A1蛋白二級結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白包含α-螺旋(48.31%)、無規(guī)則卷曲(40.22%)、延伸鏈(7.42%)及β-轉(zhuǎn)角(4.04%)(圖6)。三級結(jié)構(gòu)為彎曲螺旋狀(圖7)，具體組成與二級結(jié)構(gòu)一致。

線條由長到短分別為α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲

圖7 兔CYP11A1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.4 蛋白互作分析 根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫分析得出，與CYP11A1蛋白互作的蛋白主要包括類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)、類固醇21-單加氧酶(CYP21A2)、類固醇17α單加氧酶(CYP17A1)和鐵氧化還原蛋白1(FDX1)等(圖8)。

圖8 兔CYP11A1蛋白互作分析

2.3 兔卵巢顆粒細(xì)胞的分離與鑒定

分離的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁并呈梭形(圖9A)，傳至第3代出現(xiàn)分化，細(xì)胞由梭形拉伸至多邊形，且單個細(xì)胞面積變大(圖9B)。免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)，兔顆粒細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光(圖10)，表明兔顆粒細(xì)胞表達(dá)FSHR，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖9 兔原代顆粒細(xì)胞(A)和第3代顆粒細(xì)胞(B)形態(tài)(40×)

A，明場圖；B，熒光圖；C，DAPI染色；D，合并圖

2.4 過表達(dá)和干擾CYP11A1基因?qū)Ψ敝诚嚓P(guān)基因表達(dá)的影響

與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-CYP11A1組CYP11A1、HSD17B1和FSHR基因的相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，BMP15基因的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)(圖11)；干擾CYP11A1基因的表達(dá)后，其在顆粒細(xì)胞中的相對表達(dá)水平顯著或極顯著降低(P<0.05；P<0.01)(圖12)，選取效果最為顯著的siRNA-1進(jìn)行后續(xù)處理。siRNA-1干擾CYP11A1基因的表達(dá)后，HSD17B1基因的相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，BMP15和FSHR基因的相對表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)(圖13)。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。圖13同

與NC組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)

圖13 干擾CYP11A1基因?qū)Ψ敝诚嚓P(guān)基因的影響

3 討 論

CYP11A1基因編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶是一種線粒體酶，這種酶可以水解膽固醇側(cè)鏈生成孕烯醇酮，而孕烯醇酮會轉(zhuǎn)化成類固醇激素，從而影響性腺激素的合成[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，CYP11A1是1個相對穩(wěn)定的親水性蛋白，且磷酸化位點(diǎn)較為豐富，說明其可能與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞周期有關(guān)[19]。CDD軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CYP11A1包含1個亞鐵血紅素蛋白超家族結(jié)構(gòu)域P450，有研究報道該家族在生物合成和抗氧化方面具有重要作用[20]。蛋白互作分析顯示，CYP11A1與STAR、FDX1、CYP21A2以及CYP17A1蛋白聯(lián)系密切，而此類蛋白大多都與類固醇激素合成有關(guān)[21-22]。因此，CYP11A1作為類固醇合成激素中的第一個關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)量的高低可能會影響其他蛋白的表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析在一定程度上可以反映物種間的親緣關(guān)系，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兔CYP11A1蛋白與豬、鼠、人、牛、綿羊、馬、猩猩和狗構(gòu)成同一分支，說明該蛋白在這些物種進(jìn)化過程中相對保守。以上結(jié)果說明，CYP11A1是穩(wěn)定、親水、相對保守且具有抗氧化和類固醇激素合成功能的蛋白。

顆粒細(xì)胞是卵巢的重要功能細(xì)胞，它可以在FSH的作用下分泌雌激素，并通過卵巢縫隙向卵母細(xì)胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)[23]。本研究成功分離并鑒定了兔的卵巢顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞作為卵泡內(nèi)主要的類固醇激素分泌細(xì)胞，在卵泡發(fā)育過程中起著重要作用。已知HSD17B1基因負(fù)責(zé)調(diào)控人和嚙齒類動物體內(nèi)性激素的合成，其可以通過脫氫酶將3α轉(zhuǎn)化為雄激素，而雄激素可以影響哺乳動物卵泡的發(fā)育和閉鎖，在卵泡發(fā)育過程中起重要作用[24]。BMP家族可以誘導(dǎo)骨組織形成、控制動物生長發(fā)育，在生殖系統(tǒng)中具有十分重要的作用[25]。BMP15基因作為卵泡分泌生長因子，在卵泡早期發(fā)育過程扮演重要角色[26]。研究表明，在小鼠中敲除BMP15基因后，導(dǎo)致其繁殖力低下，排卵率和受精率顯著降低[27]。FSHR基因是FSH的受體，由于FSH無法直接穿透細(xì)胞膜，所以需要借助FSHR傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)[28]，表明FSHR基因的表達(dá)水平可以直接調(diào)控FSH的活性，進(jìn)而影響激素生成、刺激卵泡發(fā)育和成熟等。綜上所述，HSD17B1、BMP15和FSHR基因的表達(dá)影響著卵巢發(fā)育的過程。本研究結(jié)果表明，CYP11A1基因可以正向調(diào)控HSD17B1、BMP15和FSHR基因的表達(dá)，說明CYP11A1基因可以影響繁殖性能相關(guān)基因的表達(dá)水平。因此，CYP11A1基因可能為調(diào)控母兔卵巢繁殖性能的新靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究克隆了新西蘭白兔CYP11A1基因，其CDS全長為1 557 bp，編碼518個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，CYP11A1是穩(wěn)定、親水、相對保守且具有抗氧化和類固醇激素合成功能的蛋白。在兔卵巢顆粒細(xì)胞過表達(dá)CYP11A1基因后，HSD17B1、BMP15和FSHR基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而干擾CYP11A1基因可顯著下調(diào)這些基因的表達(dá)。說明CYP11A1基因可以影響繁殖相關(guān)基因的表達(dá)，提示其在母兔的繁殖過程中可能發(fā)揮作用。