犬ANP32蛋白多態(tài)性及其對(duì)A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

張 媛,于萌萌,孫留克,郭 興,那 雷,劉荻萩,姜 騫,張海麗，2,王曉鈞

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150069；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130062)

A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一種單股、分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒，亞型多且在全球范圍內(nèi)廣泛傳播[1]。野生水禽被公認(rèn)為是A型流感病毒最大的天然儲(chǔ)存庫[2]。在特定條件下，A型流感病毒可突破種間屏障感染其他宿主，如感染人、家禽、豬、犬、馬等宿主[3-5]。近年來，養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)常出現(xiàn)馬/犬或犬/禽混合飼養(yǎng)，因此，當(dāng)有禽流感或馬流感暴發(fā)時(shí)，病毒經(jīng)不斷變異和重組，有可能跨種傳播到犬[6-7]，引起犬呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，威脅動(dòng)物的生命健康，造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失，甚至有潛在大流行風(fēng)險(xiǎn)。

RNA聚合酶的適應(yīng)性是影響A型流感病毒跨物種傳播的重要因素之一[8-10]。2016年，Long等[11]首次揭示了禽流感病毒RNA聚合酶在不同宿主細(xì)胞中的適應(yīng)性與雞酸性核磷蛋白32A(chicken acidic(leucine-rich)nuclear phosphoprotein 32 ku，chANP32A)種屬特異性相關(guān)。隨后有研究報(bào)道禽源ANP32A基因存在多態(tài)性，且不同的ANP32A剪接變體對(duì)禽流感病毒RNA聚合酶的適應(yīng)性和病毒進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力不同[12-13]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期已從眾多宿主因子中篩選并證明宿主因子ANP32A和ANP32B是A型流感病毒RNA聚合酶活性的決定性宿主蛋白，且存在種屬特異性[14-15]。犬腎傳代細(xì)胞系MDCK對(duì)不同物種來源的多種亞型的流感病毒株均易感，常用來進(jìn)行流感病毒的分離及疫苗的研發(fā)生產(chǎn)[16]。但目前關(guān)于犬ANP32(caANP32)蛋白對(duì)不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響報(bào)道較少。

本研究克隆并表達(dá)了caANP32家族成員caANP32A、caANP32B及caANP32E，初步分析了caANP32A、caANP32B及caANP32E蛋白組織分布及在MDCK細(xì)胞中的多態(tài)性。利用流感病毒RNA聚合酶雙熒光報(bào)告系統(tǒng)探索caANP32家族蛋白對(duì)不同物種來源的A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響，以期為開發(fā)應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)、病毒分離等高效犬腎細(xì)胞系MDCK提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 犬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、氣管、盲腸、大腦組織樣品均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所自然疫源性人獸共患病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存。

1.1.2 質(zhì)粒及毒株 雞ANP32A/B(chANP32A/B)、人ANP32A/B(huANP32A/B)、豬ANP32A/B(swANP32A/B)、馬ANP32A_X2/32B(eqANP32A_X2/32B)、犬ANP32A/B/E(caANP32A/B/E)的表達(dá)質(zhì)粒及人胚腎細(xì)胞(HEK293T，CRL-3216)、人胚腎細(xì)胞ANP32A/B雙基因敲除細(xì)胞系(DKO,CRL-3216)、犬腎細(xì)胞系MDCK(CCL-34)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存。

犬流感毒株A/canine/Guangdong/1/2011(H3N2GD11)聚合酶為廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；禽流感病毒A/chicken/Zhejiang/1/2012(H9N2ZJ12)聚合酶由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感與禽新發(fā)病毒病團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng)；馬流感毒株A/equine/Jilin/1/1989(H3N8JL89)聚合酶由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。上述流感病毒RNA聚合酶報(bào)告系統(tǒng)真核表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建于pCAGGS-Flag表達(dá)載體上。含有人Pol Ⅰ啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒pEZ-vLuc、含有海腎熒光素酶基因的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)制備并保存。

1.1.3 主要試劑及儀器 Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和KOD PCR酶試劑盒(TOYOBO公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Thermo Fisher公司)；鼠源抗Flag標(biāo)簽單克隆抗體和鼠源抗β-actin單克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司)；硝酸纖維素膜(NC膜)(Millipore公司)；In-Fusion連接酶試劑盒(Clontech公司)；Simply P總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)；雙熒光素酶試劑盒(Promega公司)；細(xì)胞消化胰酶(Gibco公司)；聚乙烯亞胺P轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞裂解液(150 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、1% Triton X-100)以及5×蛋白上樣buffer(0.25 mol/L Tris-base、50%甘油、10% SDS、0.5%溴酚藍(lán)、0.1 MDTT)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)配制及保存。

1.2 方法

1.2.1 組織、細(xì)胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 組織RNA提?。簩⑷呐K、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、氣管、盲腸及腦組織分別取約0.1 g剪成小塊，按照Trizol法RNA提取試劑盒說明書提取組織基因組RNA，以隨機(jī)引物按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。MDCK細(xì)胞RNA提取:按照Simple P總RNA提取試劑盒說明書提取1×106個(gè)MDCK細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 基于GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的caANP32家族基因序列caANP32A(NM_001003013)、caANP32B_X1(XM_022425638)、caANP32B_X2(XM_014117879)、caANP32B_X3(XM_005626854)、caANP32E_X1(XM_022404962)和caANP32E_X2(XM_003639621)，針對(duì)caANP32基因開放閱讀框分別設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(表1)和基因克隆所需的特異性引物(表2)。引物均由吉林庫美有限公司合成。

表1 caANP32基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物信息

表2 caANP32基因克隆引物信息

1.2.3caANP32A、caANP32B和caANP32E基因組織分布 以1.2.1獲得的組織cDNA為模板，采用表1基因特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)10 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。

1.2.4caANP32A、caANP32B和caANP32E基因克隆和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以1.2.1獲得的心臟組織cDNA和MDCK細(xì)胞cDNA分別作為模板，用表2特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增caANP32全長(zhǎng)目的基因。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR Buffer 25 μL，dNTPs 10 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，模板200 ng，KOD FX 酶 1 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表2)30 s，68 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶純化后，通過In-fusion試劑盒連接于真核表達(dá)載體pCAGGS-Flag，經(jīng)測(cè)序正確后進(jìn)行質(zhì)粒提取以獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HEK293T細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，將上述獲得的caANP32蛋白表達(dá)質(zhì)粒利用轉(zhuǎn)染試劑PEI轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，并分別設(shè)置pCAGGS-Flag空載體和pCAGGS-huANP32A-Flag質(zhì)粒為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。8 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，48 h后裂解細(xì)胞，12 000×g離心10 min后，取上清樣品加5×SDS上樣緩沖液處理后進(jìn)行SDS-PAGE，按照快速濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以鼠源抗Flag單克隆抗體(1∶10 000)和兔源抗β-actin單克隆抗體(1∶5 000)為一抗，DyLight80TM標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)和山羊抗兔IgG(1∶5 000)為二抗，經(jīng)Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.6 氨基酸序列比對(duì) 利用DNAMAN和Geneious軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.2.7 caANP32家族蛋白對(duì)不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響 將ANP32A/B敲除細(xì)胞系(DKO)鋪于24孔板中，恒溫培養(yǎng)約16 h待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，分別將不同種屬的ANP32蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-chANP32A-Flag、pCAGGS-chANP32B-Flag、pCAGGS-huANP32A-Flag、pCAGGS-huANP32B-Flag、pCAGGS-swANP32A-Flag、pCAGGS-swANP32B-Flag、pCAGGS-eqANP32A-Flag、pCAGGS-eqANP32B-Flag、pCAGGS-caANP32A-Flag、pCAGGS-caANP32B-Flag、pCAGGS-caANP32E-Flag與不同亞型流感病毒RNA聚合酶亞基和NP基因真核表達(dá)質(zhì)粒(分別為來源于犬流感病毒H3N2GD11、馬流感病毒H3N8JL89和禽流感病毒H9N2ZJ12的pCAGGS-NP/PA/PB1/PB2、pEZ-vLuc和pRL-TK)共轉(zhuǎn)染DKO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染體系如下：每孔分別加入NP(80 ng)、PA(20 ng)、PB1(40 ng)、PB2(40 ng)、vLuc(40 ng)和pRL-TK(1 ng)，當(dāng)研究不同物種ANP32蛋白對(duì)聚合酶活性的影響時(shí)，在上述體系中加入ANP32真核表達(dá)質(zhì)粒(20 ng)或pCAGGS-Flag空載體(20 ng),轉(zhuǎn)染24 h后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書裂解細(xì)胞和取樣，利用Centro XS LB 960 Luminometer儀器檢測(cè)Firefly和Renilla的熒光值，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值即為病毒RNA聚合酶的活性。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析，使用方差分析并配合Tukey檢驗(yàn)共同進(jìn)行組間比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 caANP32A、caANP32B和caANP32E基因mRNA的表達(dá)及其組織分布

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)不同組織中caANP32家族基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示，在犬不同組織中均可檢測(cè)到caANP32A、caANP32B和caANP32E基因mRNA的表達(dá)，且在各組織中caANP32家族基因mRNA表達(dá)均不同，caANP32B基因mRNA表達(dá)豐度均顯著或極顯著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05；P<0.01)。caANP32A基因mRNA表達(dá)最低。在氣管、肺臟、盲腸和大腦中caANP32B基因豐度極顯著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.01)，在腎臟和脾臟中caANP32B基因豐度顯著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05)；在犬心臟中caANP32E基因組織豐度極顯著高于caANP32A基因(P<0.01)，在盲腸和大腦中caANP32E基因組織豐度顯著高于caANP32A基因(P<0.05)；在肝臟、腎臟、肺臟、腎臟和氣管中caANP32E與caANP32A基因豐度無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.2 caANP32A、caANP32B和caANP32E基因克隆和鑒定

2.2.1caANP32A、caANP32B和caANP32E基因克隆 經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，獲得大小分別為747、903、798、729、768和789 bp的目的條帶(圖2、3)，與caANP32A、caANP32B_X1、caANP32B_X2、caANP32B_X3、caANP32E_X1及caANP32E_X2基因大小一一對(duì)應(yīng)。目的條帶經(jīng)純化后連接于pCAGGS-Flag真核表達(dá)載體，進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序鑒定正確，分別命名為pCAGGS-caANP32A-Flag、pCAGGS-caANP32B_X1-Flag、pCA-GGS-caANP32B_X2-Flag、pCAGGS-caANP32B_X3-Flag、pCAGGS-caANP32E_X1-Flag和 pCAGGS-caANP 32E_X2-Flag。以上結(jié)果表明caANP32家族基因在MDCK細(xì)胞和犬組織中均確切存在，且caANP32A有1種轉(zhuǎn)錄形式，caANP32B有3種轉(zhuǎn)錄形式(剪接變異體)，caANP32E有2種轉(zhuǎn)錄形式。

M，DL2000 DNA Marker;1～6，分別為caANP32A、caANP32B_X1、caANP32B_X2、caANP32B_X3、caANP32E_X1和caANP32E_X2基因。圖3同

圖3 犬心臟組織caANP32家族基因的克隆

2.2.2 caANP32A、caANP32B和caANP32E蛋白的表達(dá) 經(jīng)轉(zhuǎn)染和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，空載體未見陽性反應(yīng)條帶，同pCAGGS-huANP32A-Flag相比，在30和40 ku之間出現(xiàn)與預(yù)期相符的特異性條帶，證明pCAGGS-caANP32A-Flag、pCAGGS-caANP32B_X1-Flag、pCAGGS-caANP32B_X2-Flag、pCAGGS-caANP32B_X3-Flag、pCAGGS-caANP32E_X1-Flag、pCAGGS-caANP32E_X2-Flag和pCAGGS-huANP32A-Flag蛋白在HEK293T細(xì)胞中成功獲得表達(dá)，caANP32B_X1和caANP32E_X1因分子質(zhì)量較大而導(dǎo)致其特異性條帶稍高于其他蛋白(圖4)。

1,空載體;2～8，分別為caANP32A、caANP32B_X1、caANP32B_X2、caANP32B_X3、caANP32E_X1、caANP32E_X2和huANP32A蛋白

2.2.3 caANP32A、caANP32B和caANP32E氨基酸序列比對(duì) 基于基因克隆結(jié)果發(fā)現(xiàn)，caANP32基因存在序列多態(tài)性。對(duì)caANP32家族蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，caANP32家族基因在其亮氨酸重復(fù)區(qū)域(leucinerich repeat domain,LRR)較為保守，在低復(fù)雜酸性區(qū)域C-端區(qū)域(low-complexity acidic region,LCAR)具有較大差異。caANP32家族全長(zhǎng)蛋白序列為：caANP32A含有249個(gè)氨基酸，caANP32B_X1氨基酸序列最長(zhǎng)，含有301個(gè)氨基酸；caANP32B_X2次之，含有266個(gè)氨基酸；caANP32B_X3含有243個(gè)氨基酸，caANP32E_X1含有256個(gè)氨基酸，caANP32E_X2含有263個(gè)氨基酸。caANP32B的3個(gè)剪接變異體主要在N-Cap區(qū)域存在差異；而caANP32E的2個(gè)剪接變異體在N-Cap和C-Cap區(qū)域均存在較大差異，caANP32E_X1 N-端序列較長(zhǎng)，C-端序列較短，caANP32E_X2則與之相反，即C-端氨基酸數(shù)多于N-端(圖5)。

圖5 caANP32家族氨基酸序列比對(duì)

2.3 caANP32A 對(duì)不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

以不同種屬ANP32A表達(dá)質(zhì)粒與病毒RNA聚合酶共轉(zhuǎn)染DKO細(xì)胞，結(jié)果顯示,過表達(dá)caANP32A或人、豬、馬的ANP32A均可支持犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性(圖6A、6B)，即caANP32A或人、豬、馬ANP32A組犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性均極顯著高于空載體組(P<0.01)；而caANP32A對(duì)禽源流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性影響與空載體、huANP32A和eqANP32A_X2無顯著性差異(P>0.05)(圖6C)。chANP32A均極顯著支持3種亞型流感病毒RNA聚合酶活性(P<0.01)。

①A,犬流感病毒H3N2GD11;B,馬流感病毒H3N8JL89;C,禽流感病毒H9N2ZJ12。②與空載體對(duì)照組(Vec)相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4 caANP32B 對(duì)不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

以不同種屬ANP32B表達(dá)質(zhì)粒與病毒RNA聚合酶共轉(zhuǎn)染DKO細(xì)胞，結(jié)果顯示，caANP32B顯著支持犬流感病毒H3N2GD11RNA聚合酶活性(P<0.05)；caANP32B顯著或極顯著支持馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性(P<0.05；P<0.01)；過表達(dá)caANP32B或人、豬、馬的ANP32B均可支持犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性(圖7A、7B)，而對(duì)禽流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性有較低的支持作用(圖7C)。chANP32B均不支持3種亞型流感病毒RNA聚合酶活性。同時(shí)，caANP32B 3個(gè)剪接變體對(duì)于犬流感病毒H3N2GD11或馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性呈現(xiàn)不同的支持作用，其中caANP32B_X2活性支持最高(圖7A、7B)。此外，通過對(duì)不同物種來源的ANP32B蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，caANP32B 3種剪接變異體與其他ANP32B蛋白的氨基酸相似性較高，caANP32B 3種剪接變異體主要在N-Cap區(qū)域存在序列長(zhǎng)短和氨基酸差異(圖7D)。

A,犬流感病毒H3N2GD11;B,馬流感病毒H3N8JL89;C,禽流感病毒H9N2ZJ12;D,不同物種ANP32B的序列比對(duì)

2.5 caANP32E對(duì)不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

以同一種屬caANP32A、caANP32B_X2和caANP32E表達(dá)質(zhì)粒與病毒RNA聚合酶共轉(zhuǎn)染DKO細(xì)胞，結(jié)果顯示,過表達(dá)caANP32E_X1和caANP32E_X2對(duì)犬流感病毒H3N2GD11、馬流感病毒H3N8JL89和禽流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性影響與空載體相比均無顯著差異(P>0.05)，即caANP32E蛋白不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性(圖8A～8C)。

A,犬流感病毒H3N2GD11;B,馬流感病毒H3N8JL89;C,禽流感病毒H9N2ZJ12

3 討 論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)禽流感病毒RNA聚合酶活性具有物種限制性，是禽流感病毒跨種傳播的重要屏障之一。已有研究表明多種宿主因子可通過與 RNA 聚合酶互作調(diào)控病毒的復(fù)制及宿主適應(yīng)性范圍，其中ANP32家族蛋白在A型流感病毒復(fù)制及跨物種傳播中起著決定性作用[17-18]。MDCK細(xì)胞作為一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，常用作禽、人、馬、犬等不同物種流感病毒分離及疫苗培養(yǎng)的細(xì)胞系[19]，然而MDCK細(xì)胞中caANP32蛋白對(duì)不同物種流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用如何鮮有報(bào)道。本研究對(duì)犬組織和MDCK細(xì)胞中ANP32家族蛋白的多態(tài)性進(jìn)行分析，明確了caANP32蛋白的表達(dá)形式，并評(píng)估了caANP32家族成員對(duì)不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響。

犬可感染多種亞型流感病毒[20]，但僅H3N8和H3N2亞型流感病毒可在犬群中流行[21]，推測(cè)可能與不同亞型流感病毒RNA聚合酶在犬宿主細(xì)胞上的適應(yīng)能力相關(guān)，而ANP32家族蛋白決定了流感病毒RNA聚合酶活性[14-15]?；贜CBI提供的預(yù)測(cè)序列信息可推測(cè)caANP32家族基因存在潛在變體，因此本研究首先對(duì)caANP32家族蛋白基因進(jìn)行組織分布及序列分析。組織分布結(jié)果提示,不同組織中caANP32B豐度均極顯著高于其他2個(gè)家族成員caANP32A和caANP3E；而caANP32A和caANP32E在不同組織中的基因豐度略有不同。這可能是由于ANP32家族蛋白參與細(xì)胞發(fā)育及生命周期的多個(gè)過程[22-24]，因某些組織的生長(zhǎng)特性導(dǎo)致ANP32家族基因豐度分布有所不同。犬心臟組織及MDCK細(xì)胞中ANP32家族基因克隆結(jié)果證實(shí)，caANP32家族基因存在轉(zhuǎn)錄本多態(tài)性：caANP32A存在1個(gè)轉(zhuǎn)錄本，caANP32B存在3種剪接變體，而caANP32E存在2種剪接變體。

研究發(fā)現(xiàn)，chANP32A基因在其LRR與LCAR區(qū)域之間具有獨(dú)特的33個(gè)氨基酸序列插入，從而能特異性支持禽流感病毒RNA聚合酶活性[11]，且chANP32A基因在其特有的33個(gè)氨基酸關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域處存在3個(gè)序列長(zhǎng)短差異的剪接變體，而這一差異顯著影響了不同變體對(duì)流感病毒RNA聚合酶的支持活性[12,25]。本研究發(fā)現(xiàn)，caANP32B及caANP32E均存在不同剪接變異體，但其序列差異主要體現(xiàn)在N-Cap區(qū)域，并沒有類似禽ANP32A的33個(gè)氨基酸插入，這種N-Cap區(qū)域差異導(dǎo)致其對(duì)犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性的支持能力不同，其中caANP32B_X2支持能力顯著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3，但不改變其對(duì)禽流感病毒RNA聚合酶的支持活性。序列分析提示，caANP32B_X2的N-端序列與其他物種ANP32B序列相似性更高，而caANP32B_X1 N-端氨基酸殘基偏長(zhǎng)，caANP32B_X3的N-端氨基酸殘基偏短，推測(cè)可能是由于caANP32B剪切變異體N-Cap區(qū)域序列長(zhǎng)短和所編碼氨基酸差異，導(dǎo)致其對(duì)流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力不同。ANP32蛋白與流感病毒RNA聚合酶結(jié)合能力直接影響了其對(duì)RNA聚合酶的支持活性[15]，而caANP32B不同剪接變體的N-Cap區(qū)域序列長(zhǎng)短差異是否影響了其與流感病毒RNA聚合酶的結(jié)合能力，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶的活性，也符合馬傳染病和慢病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果[26]。此外,過表達(dá)caANP32A/caANP32B對(duì)禽流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性支持能力均較低，表明犬和其他哺乳動(dòng)物ANP32A/ANP32AB蛋白在支持哺乳動(dòng)物流感病毒RNA聚合酶和禽流感病毒RNA聚合酶活性方面存在差異，表現(xiàn)出較強(qiáng)的種間限制作用。在針對(duì)不同亞型流感病毒RNA聚合酶活性分析時(shí)，陰性對(duì)照數(shù)值出現(xiàn)變化是由于不同亞型流感病毒RNA聚合酶的本底值不同造成的，本試驗(yàn)前期對(duì)多個(gè)物種的流感RNA聚合酶分析時(shí)發(fā)現(xiàn)均存在這一現(xiàn)象，此現(xiàn)象不會(huì)影響單個(gè)亞型RNA聚合酶活性[14-15,26]。

禽ANP32A的3個(gè)剪接變體具有物種特異性，且禽ANP32A不同變體的豐度對(duì)禽流感病毒的進(jìn)化和RNA聚合酶的適應(yīng)性具有不同的驅(qū)動(dòng)力[12]。ANP32蛋白的N129/130D氨基酸位點(diǎn)已被確認(rèn)為是其支持不同物種流感病毒RNA聚合酶復(fù)制的關(guān)鍵活性位點(diǎn)[14]，而有研究發(fā)現(xiàn)部分人群中自然攜帶ANP32B D130A的突變體,該突變體可能通過競(jìng)爭(zhēng)性與流感病毒RNA聚合酶結(jié)合從而降低攜帶人群對(duì)流感病毒的易感性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，caANP32B存在3種剪接變異體，且這3種剪接變異體對(duì)A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力不盡相同，這是否可能是驅(qū)動(dòng)犬流感病毒不斷進(jìn)化的內(nèi)在原因仍需進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

caANP32A和caANP32B能較好地支持哺乳動(dòng)物A型流感病毒RNA聚合酶活性，對(duì)H9N2亞型禽流感病毒支持活性較低，而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。