一株辣椒疫霉拮抗菌Y4-39 分離鑒定及生防作用研究

鄒修為，熊有明，謝劍波，肖志鵬，顏 瑾，陳 武，唐前君，王運(yùn)生

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.衡陽市煙草公司，湖南 衡陽421001；3.邵陽市新邵縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 新邵 422900）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。隨著我國(guó)設(shè)施蔬菜栽種面積逐年增加，辣椒疫病已成為嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的一種毀滅性土傳病害。其病原菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主廣泛，可以在土壤中長(zhǎng)期存活，一旦傳入就難以根治，嚴(yán)重時(shí)可造成毀棚，帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，生物防治已逐漸成為植物病害綠色防控的重要選項(xiàng)，在防治蔬菜病害方面優(yōu)勢(shì)凸顯。已有多種辣椒疫霉生防菌的報(bào)道[2-3]，部分生防菌兼具拮抗和促生作用[4]，大多數(shù)生防菌是從根際土壤中分離得到的。

黑水虻（Hermetia illucensL.）作為腐食性昆蟲，能夠取食禽畜糞便和生活垃圾，轉(zhuǎn)化為昆蟲蛋白質(zhì)和脂肪。黑水虻蟲糞，又稱蟲沙，可開發(fā)為優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥，從黑水虻腸道中挖掘有益微生物，可直接利用黑水虻幼蟲生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物有機(jī)肥。近年來，黑水虻作為環(huán)保昆蟲，廣泛應(yīng)用于禽畜糞便、餐廚垃圾、農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的資源化利用[5]。黑水虻腸道中含有非常豐富的微生物，這些腸道微生物對(duì)于黑水虻消化吸收有機(jī)垃圾中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有十分重要的作用[6]。同時(shí)，豐富的黑水虻腸道微生物也是挖掘有益微生物的寶庫(kù)，例如具有抗菌活性的枯草芽孢桿菌[7]、產(chǎn)蛋白酶和有機(jī)磷分解酶的有益菌等[8]。黑水虻蟲糞可作為優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥，黑水虻腸道微生物具有作為生物菌肥益生菌開發(fā)的潛力，來自黑水虻腸道的有益微生物，由于在同一生態(tài)位經(jīng)歷協(xié)同進(jìn)化，經(jīng)黑水虻腸道后可在蟲糞中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存活，從而延長(zhǎng)生物菌肥的貨架期。

Y4-39 菌株就是筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期從黑水虻腸道中分離、純化的一株對(duì)辣椒疫霉菌具有高效抑菌活性的生防菌，該研究通過形態(tài)學(xué)、生理生化檢測(cè)及16S rDNA 序列對(duì)其進(jìn)行鑒定，并測(cè)試了該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)熱、光及蛋白酶的敏感性，還通過盆栽試驗(yàn)比較了不同發(fā)酵液劑量處理對(duì)辣椒疫霉的防治效果，以期為該菌株的后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx和菌株

黑水虻種群為課題組保存種群，最初來源為武漢品系。辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）LYB-1 由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組提供。

1.2 黑水虻腸道菌的分離

選取 3～5 頭4 齡健康黑水虻幼蟲，首先用無菌水清洗蟲體3 次，然后用75%乙醇浸泡幼蟲1 min，再用0.1%的升汞浸泡2 min，用無菌水清洗幼蟲3 次，置于無菌濾紙上，在無菌條件下解剖取出幼蟲的腸道，加入0.5 mL 無菌水于研缽中進(jìn)行研磨，然后再加入1.5 mL 無菌水，稀釋成不同濃度梯度菌懸液，取適宜稀釋度的菌懸液涂布在酪蛋白篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，選取抗辣椒疫霉菌效果較好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

取分離純化的菌株于LB 平板劃線培養(yǎng)、30℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)，培養(yǎng)72 h 后在顯微鏡下觀察其芽胞形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)和耐鹽試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

1.4 16S rDNA 序列擴(kuò)增及分析

將篩選保存的菌株（編號(hào)Y4-39）在30℃下培養(yǎng)24 h（已達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），吸取1.5 mL 菌液置于2.0 mL 離心管中，12 000 r/min 離心3 min，棄上清得到菌體沉淀。利用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取Y4-39 菌株的基因組DNA。用細(xì)菌通用引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′ 和1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化的PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，組裝得到16S rDNA 一致序列后在NCBI 中進(jìn)行Blastn 序列比對(duì)[9]，選擇rRNA/ITS 庫(kù)作為目標(biāo)序列庫(kù)，找出相似度較高的的序列。用ClustalW 程序[10]進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA7.0 軟件[11]構(gòu)建NJ 樹。

1.5 拮抗菌Y4-39 發(fā)酵液制備

用滅菌牙簽挑選單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。然后按照1%的接種量接種至LB 液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用于后續(xù)對(duì)峙試驗(yàn)，用無菌培養(yǎng)液調(diào)整菌體含量至1×108CFU/mL，用于后續(xù)的盆栽試驗(yàn)。

1.6 辣椒疫霉孢子液的制備

將辣椒疫霉菌接種在PDA 平板上，25℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d，待其產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水洗滌3次，每次加入無菌水2 mL，用無菌毛筆將孢子洗刷下來置于三角瓶中，在光照條件下靜置24 h，然后置于4℃冰箱中靜置30 min，收集孢子液，用無菌水調(diào)整游動(dòng)孢子含量約1×105CFU/mL，用于后續(xù)接種試驗(yàn)。

1.7 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)試

發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min 將菌體沉淀，吸取10 mL 上層清液，分別進(jìn)行如下處理。（1）熱穩(wěn)定性測(cè)試溫度設(shè)置：將上清液分別置于30、40、60、80、100、120℃（120℃處理在高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行）水浴中處理30 min，以離心后的發(fā)酵液上清液為對(duì)照（CK）；（2）蛋白酶穩(wěn)定性測(cè)試：分別用蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、胰蛋白酶處理上清液，酶濃度為500 g/mL，37℃水浴處理30 min，以未加蛋白酶的處理為對(duì)照（CK）；（3）紫外線穩(wěn)定性測(cè)試處理：將上清液在紫外燈（254 nm）和自然光下分別照射1、2、4、8、16、24 h，以離心后的發(fā)酵液上清液為對(duì)照（CK）。將上述處理過的上清液（10 mL）添加到30 mL 融化冷至50℃以下的PDA 培養(yǎng)基中，充分混勻后倒平板；用無菌接種環(huán)挑取直徑為5 mm 的疫霉病菌菌餅置于平板中央，25℃培養(yǎng)，待其病原菌剛長(zhǎng)滿空白對(duì)照平板，用十字交叉法測(cè)量其處理平板的病原菌菌落直徑，每處理重復(fù)3 次。

1.8 生防菌對(duì)辣椒疫病的防治作用試驗(yàn)

辣椒苗（湘研5 號(hào)）先在育苗盤中長(zhǎng)至8～10 葉，然后移栽至直徑為10 cm 的花盆中，盆內(nèi)裝有滅菌基質(zhì)和滅菌土壤（體積比為1∶1），每盆移栽1株辣椒苗。隨機(jī)分為5 組，每組12 盆。設(shè)如下處理：T1，10 mL發(fā)酵液+20 mL 無菌培養(yǎng)液；T2，20 mL 發(fā)酵液+10 mL 無菌培養(yǎng)液；T3，30 mL 發(fā)酵液；CK1（陰性對(duì)照），30 mL 無菌培養(yǎng)液；CK2（陽性對(duì)照），30 mL 50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 000 倍液。將各處理溶液均勻澆灌在辣椒根圍土壤上，24 h 后在辣椒苗根部接種5 mL 辣椒疫霉孢子液（游動(dòng)孢子含量1×105CFU/mL），保濕培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行常規(guī)管理。接種后10～15 d 調(diào)查發(fā)病情況。參照毛愛軍等[12]的辣椒疫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y4-39 的鑒定

2.1.1 生理生化鑒定經(jīng)劃線純化后的單菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株在LB 平板上28℃培養(yǎng)24 h 后，形成4～6 mm 的近似圓形的乳白色菌落（圖1），前期邊緣較整齊，表面較光滑，后期邊緣不整齊，表面粗糙顯皺狀；革蘭氏染色呈陽性（圖2），短桿狀，兩端鈍圓，能運(yùn)動(dòng)，發(fā)酵后期形成芽孢；能水解淀粉，V-P 試驗(yàn)和接觸酶反應(yīng)、葡萄糖產(chǎn)酸、硝酸鹽還原、明膠液化及檸檬酸鹽利用等試驗(yàn)結(jié)果均為陽性（表1）。通過形態(tài)學(xué)與生理生化測(cè)定結(jié)果初步判斷該菌株為芽孢桿菌。如圖3 所示，菌株Y4-39 對(duì)辣椒疫霉菌有明顯拮抗作用。

圖1 菌株Y4-39 的菌落形態(tài)

圖2 菌株Y4-39 的革蘭氏染色結(jié)果

圖3 菌株Y4-39 對(duì)辣椒疫霉菌的拮抗作用

表1 菌株Y4-39 生理生化特性

2.1.2 16S rDNA序列鑒定菌株Y4-39 的16S rDNA基因序列測(cè)序結(jié)果顯示，其大小為1 511 bp。在NCBI進(jìn)行Blastn 比對(duì)，目標(biāo)庫(kù)選擇16S rRNA/ITS 序列庫(kù)，結(jié)果顯示，菌株Y4-39 與Bacillus velezensisFZB42 最相似，相似性為99.67%，選擇最相似的20 條序列進(jìn)行進(jìn)化分析，以Macrococcus bohemicusCCM 7100 作為外群，采用Neighbor-joining 法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株Y4-39 與Bacillus velezensisFZB42 在同一枝上（圖4）。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，鑒定菌株Y4-39 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖4 菌株Y4-39 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

由圖5 可知，隨著溫度的升高，菌株Y4-39 發(fā)酵液的抑菌活性呈下降趨勢(shì)，40℃處理與對(duì)照差異不顯著，60～80℃處理，抑菌活性有所下降，但依然保持較高抑菌活性，但當(dāng)溫度≥100℃時(shí)，抑菌圈直徑急劇降低，120℃處理后，抑菌活性喪失。

圖5 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.3 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性

由圖6 可知，菌株Y4-39 發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈酶蛋白酶處理后，對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌直徑分別為14.3、20.2、20.8 mm，與CK 相比，抑菌圈直徑分別降低了68.1%、47.3%、47.1%，說明發(fā)酵液成分均對(duì)蛋白酶敏感，其中對(duì)蛋白酶K 最為敏感。

圖6 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.4 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對(duì)紫外光的穩(wěn)定性

由圖7 可知，菌株Y4-39 發(fā)酵液在自然光下穩(wěn)定性較好，各處理抑菌活性無明顯變化；紫外光處理1～4 h 后，菌株Y4-39 發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉菌抑菌活性無明顯影響，但處理4 h 后，其抑菌活性逐漸降低，紫外線照射24 h 活性最低，其抑菌圈直徑為20.5 mm，僅為對(duì)照組的53.9%。

圖7 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.5 菌株Y4-39 對(duì)辣椒疫病的防治作用

從表2 可以看出，3 種劑量處理對(duì)辣椒疫霉均具有一定的防治效果，與CK1（空白對(duì)照）相比，用菌株Y4-39 發(fā)酵液灌根處理能顯著降低辣椒疫病的病情指數(shù)，其中以T3 處理的病情指數(shù)最低，為21.35，略高于CK2（50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1000 倍液），但二者之間差異不顯著。在該試驗(yàn)條件下，T2 和T3 處理防治效果均達(dá)到65%以上，二者之間差異不顯著，從節(jié)省成本的角度考慮，推薦實(shí)際使用劑量為20 mL發(fā)酵液/株。

表2 生防菌Y4-39 對(duì)辣椒疫霉的防治效果

3 討 論

菌株Y4-39 是從黑水虻腸道中分離純化的一株對(duì)辣椒疫霉和白絹病菌均有較好抑制效果的芽孢桿菌，但對(duì)這2 種病原菌的的抑菌活性物質(zhì)可能不同，初提物經(jīng)蛋白酶處理后，對(duì)白絹病菌的抑菌作用消失，但對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌作用僅有所下降，但依然具有抑制作用。推測(cè)對(duì)白絹病菌的抑菌物質(zhì)主要是抗菌肽類，對(duì)蛋白酶敏感，而對(duì)辣椒疫霉菌的抑菌物質(zhì)除了抗菌肽外，還存在其他抗菌物質(zhì)。課題組對(duì)菌株Y4-39 的全基因組序列進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果表明，其基因組中至少存在13 個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇（結(jié)果另發(fā)表），包括有表面活性素（surfactin）、大環(huán)內(nèi)酰亞胺H （macrolactin H）、bacillaene、芬枯草菌素（fengycin）、地非西?。╠ifficidin）、桿菌素（bacillibactin）和桿菌溶素（bacilysin）等。但菌株Y4-39 對(duì)辣椒疫霉菌具有抑制作用的活性物質(zhì)是什么，仍需進(jìn)一步研究確定。

黑水虻為腐食性昆蟲，腸道微生物對(duì)其消化、轉(zhuǎn)化有機(jī)垃圾的營(yíng)養(yǎng)元素具有非常重要的輔助作用。黑水虻腸道微生物大部分來自食物和環(huán)境，前腸、中腸、后腸微生物種類差異比較大，前腸和中腸受食物和環(huán)境微生物的影響顯著高于后腸[13]。菌株Y4-39 在黑水虻前、中、后腸和蟲糞中均有存在，表明其能在黑水虻腸道中存活、繁殖并從蟲糞中排泄出來，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力?？梢酝ㄟ^人為接種的方式將菌株Y4-39 接種到黑水虻食物中，黑水虻取食、活動(dòng)后，菌株進(jìn)一步發(fā)酵增殖，從而獲得含有大量Y4-39 功能菌的蟲沙，從而進(jìn)一步研發(fā)具有生防功能的生物菌肥。通常，生物菌肥中的菌與肥是分開制備，然后再通過物理混合而成[14]。而經(jīng)黑水虻輔助發(fā)酵生產(chǎn)的生物菌肥由于菌與肥是在同一體系中完成的，相互之間經(jīng)歷了相互適應(yīng)、協(xié)合進(jìn)化過程，菌與肥之間相融性更好，功能菌能更好地存活于菌肥體系，從而提升了菌肥的活性。

該研究鑒定的貝萊斯芽孢桿菌Y4-39 菌株對(duì)辣椒疫霉病菌具有良好的抑制效果，盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，20 mL 發(fā)酵液灌根處理對(duì)辣椒疫霉防效達(dá)67.78%。貝萊斯芽孢桿菌是一種安全的環(huán)境有益菌，在多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[15]。菌株Y4-39 經(jīng)黑水虻幼蟲發(fā)酵后在其蟲糞中存在大量活性菌，抗逆性強(qiáng)，能形成芽孢，可開發(fā)為具生防功能的生物菌肥。

4 結(jié) 論

從黑水虻腸道中分離純化獲得一株對(duì)辣椒疫霉菌具有高效抑菌活性的生防菌，編號(hào)為Y4-39，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA 序列分析，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；其抑菌活性物質(zhì)主要為抗菌肽類物質(zhì)，能經(jīng)受80℃以下高溫處理，但對(duì)蛋白酶和紫外線較敏感；盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Y4-39 發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉具有良好的防治效果，20 mL/株發(fā)酵液灌根處理對(duì)辣椒疫霉的防效達(dá)67.78%。