UPLC- MS/MS 法測(cè)定柑橘中喹啉銅殘留量

王建田，譚顯修，劉喜偉，徐 月，滿益龍，周 勇

（1. 隆回縣七江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，湖南 隆回 422205；2. 隆回縣荷田鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，湖南 隆回 422204；3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

我國(guó)是世界上第一大柑橘生產(chǎn)國(guó)，柑橘產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)南方丘陵山區(qū)的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位[1]。柑橘潰瘍病是全世界范圍內(nèi)危害柑橘生產(chǎn)的主要檢疫性病害，在我國(guó)主要柑橘產(chǎn)區(qū)幾乎皆有發(fā)生，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[2]。喹啉銅等有機(jī)銅制劑是目前化學(xué)防治柑橘潰瘍病的理想藥劑，與無(wú)機(jī)銅制劑相比，其具備良好效果的同時(shí)對(duì)作物更加安全[3]。然而，過(guò)量使用喹啉銅可能會(huì)導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境污染等問(wèn)題。為確保我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展，農(nóng)藥減施增效綜合技術(shù)體系的建立勢(shì)在必行[4]。2021 年9 月3 日實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量（GB 2763—2021）中規(guī)定，柑橘中喹啉銅的最大殘留限量為5 mg/kg[5]。

關(guān)于喹啉銅在梨[6]、西瓜[7]、楊梅[8]、黃瓜[9]、水稻[10]、馬鈴薯[11]、枇杷[12]、蘋果[13]等基質(zhì)中的殘留檢測(cè)方法已有報(bào)道。柑橘中包含果膠、類胡蘿卜素、纖維素等多種成分，基質(zhì)組成較為復(fù)雜，而采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)柑橘中喹啉銅殘留量的方法目前尚無(wú)報(bào)道。因此，該研究針對(duì)柑橘基質(zhì)，建立了一種以QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理方法為基礎(chǔ)，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定柑橘中喹啉銅殘留量的方法，旨在為柑橘生產(chǎn)中喹啉銅合理使用和柑橘產(chǎn)品質(zhì)量安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試柑橘樣品采集于湖南省園藝研究所果樹創(chuàng)新園。

主要試劑有8-羥基喹啉銅（98.8%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），乙腈（色譜純，德國(guó)默克股份有限公司），甲醇（色譜純，德國(guó)默克股份有限公司），甲酸（色譜純，德國(guó)CNW 科技公司），PSA、C18、GCB（德國(guó)CNW 科技公司），試驗(yàn)用水為超純水。

主要儀器設(shè)備有TSQ Endura 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技公司），TDZ5-WS 低速離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司），TG16-II 高速離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司），ME104 電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]，JY5002 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），MTV-100 旋渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司），XW-80A 微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制稱取喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品0.025 2 g，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成996 mg/L 的母液。將喹啉銅母液用甲醇稀釋配制成濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋配得濃度為2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 基質(zhì)效應(yīng)分析使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定量分析時(shí)通常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，在建立檢測(cè)方法時(shí)可以按照以下公式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估：ME（%）=（A/B）×100，當(dāng)ME 在80%～120%之間時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)，無(wú)需采取措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME 在50%～80%或120%～150%之間時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)ME ≤50%或≥150%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，均需采取補(bǔ)償措施[14]。

1.2.3 樣品處理（1）樣品預(yù)處理。果肉樣品：先去除柑橘果皮，然后用不銹鋼刀將果肉切成1 cm 大小的碎塊，在不銹鋼盆中混勻后進(jìn)行分取，然后用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿。全果樣品：將柑橘全果用不銹鋼刀切成1 cm 大小的碎塊，在不銹鋼盆中混勻后進(jìn)行分取，然后用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿。（2）樣品前處理。用天平稱取5 g 勻漿后的柑橘樣品至50 mL 離心管中，在離心管中加入提取液；該研究以乙腈-水（體積比1 ∶1）溶液中添加不同濃度的甲酸（0、0.1%、0.5%）對(duì)樣品進(jìn)行提取；渦旋3 min，4 000 r/min 離心3 min。取2 mL 離心管，預(yù)先稱取20 mg 凈化劑（該研究采用PSA、C18、GCB、PSA+C18、PSA+C18+ GCB 共5種凈化材料分別對(duì)果肉和全果樣品進(jìn)行凈化處理），加入1.5 mL 上一步的乙腈提取溶液，漩渦1 min。再置于10 000 r/min 的高速離心機(jī)上離心3 min，移取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，濾液即可上機(jī)測(cè)定。

1.2.4 色譜條件優(yōu)化（1）色譜柱選擇：分別采用Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Mixed-Mode HILIC-1（150 mm×2.1 mm，3 μm）這2 款色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)分離效果選擇更合適的色譜柱。（2）流動(dòng)相的確定：分別比較了喹啉銅在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%乙酸銨水-乙腈溶液3 種流動(dòng)相下的響應(yīng)強(qiáng)度，依據(jù)峰形和保留時(shí)間確定最佳的流動(dòng)相。其他色譜條件如下：柱溫35℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化配制1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用全掃描模式確定目標(biāo)物的母離子，優(yōu)化離子噴霧電壓、噴針溫度、離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、射頻透鏡電壓等參數(shù)后對(duì)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行掃描，選擇信號(hào)最強(qiáng)的2個(gè)子離子作為特征子離子。然后在子離子掃描模式下同時(shí)對(duì)射頻透鏡電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，最后確定最佳的質(zhì)譜參數(shù)條件。電離源模式為ESI，電離源極性為正，霧化氣為氮?dú)?，鞘氣壓力?75 790 Pa，離子傳輸管溫度為320℃，噴針溫度為300℃，離子噴霧電壓為3 500 V，采用手動(dòng)調(diào)諧對(duì)射頻透鏡電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，在選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描（SRM）模式下進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 方法驗(yàn)證（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和基質(zhì)效應(yīng)：柑橘基質(zhì)較為復(fù)雜，即使采用凈化劑進(jìn)行了凈化處理，剩余的基質(zhì)成分仍然對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的檢測(cè)有干擾。用乙腈-水（體積比1 ∶1）溶液和空白基質(zhì)提取液分別配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3 次，采用外標(biāo)法定量。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）方法的回收率、精密度和定量限：分別采用空白柑橘果肉和全果進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，添加濃度為0.05、0.1、5、10 mg/kg，每個(gè)濃度重復(fù)5 次，考察方法的回收率和精密度，以添加的最低濃度作為方法的定量限。

1.2.7 樣品檢測(cè)采用建立的方法對(duì)購(gòu)于本地市場(chǎng)和超市的12 個(gè)柑橘樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別測(cè)定果肉和全果中喹啉銅的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化后選擇信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)的118.111 作為定量離子，相應(yīng)相對(duì)較弱的128.111 作為定性離子，篩選出146.183/118.111 作為定量離子對(duì)，146.183/128.111 作為定性離子對(duì)，優(yōu)化碰撞電壓進(jìn)而得到最佳的離子信號(hào)強(qiáng)度，獲得喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1 所示。然后在子離子掃描模式下同時(shí)對(duì)射頻透鏡電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，最后確定最佳的質(zhì)譜參數(shù)條件為：保留時(shí)間1.23 min，母離子146.183 m/z，子離子118.111/128.111 m/z，碰撞電壓25/22 V，射頻透鏡電壓122 V。

圖1 0.01 mg/L 喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用Hypersil GOLD C18 色譜柱時(shí)，溶劑標(biāo)液出峰峰形較好，但基質(zhì)匹配標(biāo)液出峰峰形差；使用Mixed-Mode HILIC-1 色譜柱時(shí)，溶劑標(biāo)液和基質(zhì)匹配標(biāo)液出峰峰形均較好，故選擇Mixed-Mode HILIC-1 色譜柱進(jìn)行洗脫分離。在相同梯度洗脫條件下，比較了喹啉銅在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%乙酸銨水-乙腈溶液3 種流動(dòng)相下的響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果表明流動(dòng)相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液時(shí)，喹啉銅的峰形更好且響應(yīng)較高，因此選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液作為液相流動(dòng)相條件。液相洗脫條件如表1 所示。

2.3 提取條件的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加甲酸比不添加甲酸得到回收率更高，推測(cè)酸性條件有利于喹啉銅的離子化效率，進(jìn)而提高添加回收率；添加0.1%和0.5%甲酸得到的回收率結(jié)果相當(dāng)，從節(jié)約成本的角度考慮，最終確定甲酸的添加濃度為0.1%。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用PSA 對(duì)果肉樣品進(jìn)行凈化、C18 對(duì)全果樣品進(jìn)行凈化，得到的凈化效果較好、回收率結(jié)果最佳，故篩選出適合柑橘果肉和全果的凈化劑分別為PSA 和C18。果肉樣品中加入20 mg PSA，全果樣品中加入20 mg C18。

2.5 方法的線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

由表2 可知，在0.01～2 mg/L 濃度范圍內(nèi)，喹啉銅的質(zhì)量濃度和峰面積呈良好線性關(guān)系，決定系數(shù)分別為0.998 2、0.998 9 和0.999 4；柑橘果肉和全果的基質(zhì)效應(yīng)分別為48%和42%，均為基質(zhì)減弱效應(yīng)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

2.6 方法的回收率、精密度和定量限

由表3 可知，在0.05、0.1、5、10 mg/kg 4 個(gè)添加水平下，喹啉銅在柑橘果肉和全果中的平均回收率分別為99%～103%、91%～97%，RSD分別為1.9%～6.1%、3.0%～8.4%，喹啉銅在柑橘果肉和全果中的定量限均為0.05 mg/kg，結(jié)果符合NY/T788—2018[15]的要求。柑橘果肉、全果空白樣品的色譜圖見圖2，添加樣品色譜圖見圖3。

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 加標(biāo)樣品色譜圖（0.1 mg/kg）

表3 喹啉銅在柑橘果肉和全果中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.7 樣品檢測(cè)

采用優(yōu)化后的提取檢測(cè)方法對(duì)購(gòu)于本地市場(chǎng)和超市的12 個(gè)柑橘樣品分別進(jìn)行果肉和全果檢測(cè)，結(jié)果顯示，12 個(gè)樣品果肉中喹啉銅的含量范圍為≤0.15

mg/kg，全果中喹啉銅的含量范圍為≤0.32 mg/kg。

3 結(jié) 論

該研究使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)柑橘中喹啉銅的殘留量，對(duì)樣品處理方法、色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：樣品經(jīng)含0.1%甲酸的乙腈-水（體積比1 ∶1）溶液渦旋提取，果肉樣品使用20 mg PSA 凈化，全果樣品使用20 mg C18 凈化；采用Mixed-Mode HILIC-1色譜柱分離，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為0.3 mL/min，柱溫為35℃；在選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描（SRM）模式下進(jìn)行測(cè)定，喹啉銅在0.01～2 mg/L 范圍內(nèi)性關(guān)系良好，決定系數(shù)均≥0.998 2，喹啉銅在柑橘果肉和全果中的最低檢測(cè)濃度均為0.05 mg/kg，添加回收試驗(yàn)中喹啉銅在柑橘果肉和全果中的平均回收率范圍為91%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.9%～8.4%。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確度和精密度高，適用于柑橘中喹啉銅殘留量的檢測(cè)。