連作對寒地雙孢蘑菇土壤微生物的影響

付靜,鄭煥春,郭勁鵬

連作對寒地雙孢蘑菇土壤微生物的影響

付靜,鄭煥春*,郭勁鵬

黑龍江省林業(yè)科學院牡丹江分院, 黑龍江 牡丹江 157010

為解決雙孢蘑菇連作障礙，通過對其連續(xù)栽培土壤中的微生物不同生長年限和生長期進行采集、測定、分離研究。研究表明：連續(xù)種植雙孢菇三年的土壤，細菌數(shù)量不同生長期先升高再降低，逐年上升；放線菌數(shù)量不同生長期變化較平穩(wěn)，但隨著種植年限上升較大；真菌數(shù)量不同生長期變化較小，逐年變化也不顯著。從土樣中分離的對雙孢蘑菇菌絲生長起促進的作用的微生物7種，其中固氮菌 N1、芽孢桿菌C1和鏈霉菌A1對雙孢蘑菇菌絲生長促進作用較大。

連作; 雙孢蘑菇; 土壤微生物

土壤微生物是評價土壤質量的指標之一[1]。土壤中的微生物，包括細菌、放線菌、真菌具有較強的酶系統(tǒng)，可以分解土壤和培養(yǎng)基質中難以吸收的大分子有機物為小分子，為雙孢蘑菇所利用。有些放線菌還能產生抗生素，成為雙孢蘑菇栽培的“天然”殺菌劑，因此可以說土壤微生物是雙孢蘑菇栽培中環(huán)境因素之一。

解決雙孢蘑菇連作障礙，對其栽培土壤中的微生物研究是第一步，也是非常重要的組成部分，理清雙孢蘑菇及其與環(huán)境微生物共同作用的關系對于解決雙孢蘑菇連作障礙問題，實現(xiàn)棚室連續(xù)栽培的關鍵和重中之重[2,3]。

研究以雙孢蘑菇連作土壤為主進行試驗研究，以解決雙孢蘑菇連作障礙為目的，對栽培地土壤微生物連續(xù)變化情況進行研究。

土壤微生物的三大主要類群包括細菌、放線菌和真菌[4]。它們構成了土壤微生物的主要生物微環(huán)境，任何一種數(shù)量和類別發(fā)生變化，都影響土壤的生物活性水平。調查對雙孢蘑菇連作前后土壤中的微生物變化情況，將會使我們清楚地認識到雙孢蘑菇及其與土壤微生物相互作用關系，連作后菌群變化對雙孢蘑菇生長和產量的變化影響。這將指導我們在進行雙孢蘑菇連作后如何進行土壤性能指標的調整，對雙孢蘑菇等草腐菌類的棚室連作提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤采自牡丹江市郊，種植雙孢蘑菇連續(xù)三年的土壤為試驗樣品。

1.1.2 供試培養(yǎng)基按表1配制土壤微生物培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品采集設置不同采樣點，每塊處理面積為10 m×1.5 m，共15 m2。采用五點取樣法，試驗區(qū)土壤分成五個區(qū)，去除2 cm表面土后，各取0.5 kg土壤，土樣混合均勻，裝入無菌的自封塑料袋內，供微生物試驗所用。

1.2.2 土壤樣液制備土壤懸浮液：準確稱取新鮮土壤樣品10.000 g，置于250 mL的無菌錐形瓶內，加入90 mL無菌水，磁力攪拌器上120 rpm震蕩25 min，制得土壤懸浮液。

土壤稀釋液：按表2遵守無菌技術操作規(guī)程配制不同稀釋度的土壤稀釋液，供微生物測定使用。

表 2 不同稀釋度的土壤稀釋液配制

1.2.3 土壤微生物測定

（1）三種土壤微生物培養(yǎng)基各自配置好后，121 ℃滅菌20 min，冷卻至45 ℃左右時制作平板，待平板冷卻后測定土壤微生物。

（2）在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上加入稀釋度10-7和10- 8的土壤稀釋液各200 mL培養(yǎng)細菌，每稀釋度5次重復，37 ℃培養(yǎng)2 d，以平板表面涂抹法計數(shù)，重復3次試驗。

（3）在加入0.3%重鉻酸鉀溶液的高氏一號培養(yǎng)基上加入稀釋度10-3和10-4的土壤稀釋液各200 mL培養(yǎng)放線菌，每稀釋度5次重復。28 ℃培養(yǎng)5 d，以平板表面涂抹法計數(shù)，重復3次試驗。

（4）在鏈霉素PDA培養(yǎng)基上加入稀釋度10-3和10-4的土壤稀釋液各200 mL培養(yǎng)真菌，每稀釋度重復5次。28 ℃培養(yǎng)5 d后，以平板表面涂抹法計數(shù)，重復3次試驗。

每克土壤中菌落計算方法：菌落數(shù)=計數(shù)皿中平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5[5]

1.2.4 雙孢蘑菇連作對土壤微生物的影響分別取不同生長年限不同土壤地塊的采樣點，對不同種植年限的雙孢蘑菇分別進行細菌、真菌、放線菌數(shù)量變化趨勢的測定。通過測試，判斷雙孢蘑菇連作對土壤中各微生物類群的影響。微生物取樣方式、培養(yǎng)基及測定方法同前。

1.2.5 有益微生物的分離和鑒別分別從雙孢蘑菇不同生長年限土壤地塊中采樣，制備系列稀釋液，采用平板涂布分離法分離相關類別的微生物，并對雙孢蘑菇菌絲體生長情況試驗，判斷連作土壤中有益微生物類群對雙孢蘑菇菌絲的影響。微生物取樣方式同前，分離培養(yǎng)基為：真菌使用馬丁培養(yǎng)基，放線菌使用高氏一號培養(yǎng)基，細菌培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。以色澤、菌落形態(tài)等培養(yǎng)特征為標準，挑取不同單個菌落分離純化。并在綜合PDA培養(yǎng)基中央接入雙孢蘑菇菌絲，培養(yǎng)3 d后在雙孢蘑菇菌絲體前端接入有益微生物純化活菌體，混合培養(yǎng)于第3、6、9、12 d分別測量雙孢蘑菇菌絲體直徑，觀察對比雙孢蘑菇菌絲體生長特征變化[6-8]。

2 結果與分析

2.1 雙孢蘑菇栽培地微生物數(shù)量情況

通過試驗得到了雙孢蘑菇栽培地微生物數(shù)量情況，結果如表3所示。在雙孢蘑菇生長不同階段：菌絲生長期、菇蕾期、出菇期、第二茬出菇期，土壤微生物中細菌的數(shù)量最多，達到108級別以上；其次是放線菌，達到103級別以上；真菌數(shù)量最少，處于103級別以下?？梢钥闯龇N植雙孢蘑菇的土壤細菌數(shù)量的變化大體上是呈現(xiàn)先升高再降低變化趨勢，即雙孢蘑菇菌絲生長到原基形成細菌數(shù)量逐漸增多，菇蕾期后逐漸降低時；放線菌和真菌整體上是下降趨勢，但分別在菇蕾期和出菇期有較多數(shù)量；雙孢蘑菇栽培地微生物數(shù)量不僅與雙孢蘑菇不同生長期有關，也與溫度、濕度變化情況關系密切。

表 3 雙孢蘑菇不同生長期土壤微生物的數(shù)量/103cfu·g-1

土樣中分離出的微生物經過鏡下的分類和鑒定，經初步統(tǒng)計樣地土壤涉及的微生物，包括桿菌、球菌、鏈霉菌等共有63種、放線菌有44種、細菌有36種。

2.2 雙孢蘑菇連作地雙孢蘑菇與土壤微生物的相互作用關系

針對不同生長年限和不同生長期種植雙孢蘑菇的土壤進行微生物種群及其數(shù)量的動態(tài)研究，探索各生長年限和生長期的不同種類微生物種群及其數(shù)量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)土壤微生物與雙孢蘑菇生長發(fā)育的變化規(guī)律，對于進一步探討雙孢蘑菇連作障礙控制技術都有著現(xiàn)實意義。

2.2.1 雙孢蘑菇不同種植年限和生長期土壤細菌的變化趨勢通過試驗，雙孢蘑菇不同種植年限不同生長期的土壤中細菌變化情況如下：

圖 1 雙孢蘑菇不同生長年限和生長期細菌的數(shù)量

由圖1可以看出雙孢蘑菇種植三年的土壤，細菌數(shù)量的總體變化趨勢大致相同，都是波浪式變化，先升高再降低；種植1年的雙孢蘑菇土壤細菌的數(shù)量隨著時間變化而增加，在原基形成期達到最大值，在出菇期回落；而種植2～3年的雙孢蘑菇均是在菇蕾期土壤細菌的數(shù)量達到最大，出菇期則略低于菇蕾期。同時，隨著種植年限的增加，土壤細菌的數(shù)量差異明顯，雙孢蘑菇種植2年土壤中的細菌數(shù)量比種植當年有所增長，而種植3年的土壤比種植2年的細菌數(shù)量增長較多。

表 5 雙孢蘑菇不同生長年限和生長期細菌數(shù)量的方差分析

注：A為年限；B為生長期；下同。

Note：A is years; B is growing period; the same below.

對不同生長年限和不同生長期種植的雙孢蘑菇土壤中細菌數(shù)量進行方差分析（見表5），結果表明不同年限和不同生長期的細菌數(shù)量差異極顯著。

有可能是雙孢蘑菇菌絲體在土壤中的旺盛生長，為土壤中細菌的加速繁殖提供了更豐富的營養(yǎng)條件，而細菌數(shù)量的增加又反過來抑制了雙孢蘑菇的菌絲體生長發(fā)育和菇蕾形成，造成雙孢蘑菇連作減產。

2.2.2 雙孢蘑菇不同種植年限和生長期土壤放線菌的變化趨勢通過試驗，雙孢蘑菇不同種植年限不同生長期的土壤中放線菌變化情況見圖2。

圖 2 雙孢蘑菇不同年限和生長期連作地放線菌的數(shù)量變化

由圖2可以看出：隨著不同的種植年限和生長期放線菌的數(shù)量變化情況，種植1年的雙孢蘑菇土壤中隨著生長期放線菌的數(shù)量呈先下降后增加的趨勢，第2年和第3年雙孢蘑菇種植土壤中放線菌的數(shù)量比種植當年的有所增長，在菇蕾期和出菇期雙孢蘑菇種植2年和3年的土壤比種植1年的土壤中放線菌的數(shù)量增加較多。由此可見，放線菌數(shù)量在雙孢蘑菇的出菇期間變化比較大，連作后，在形成雙孢蘑菇菇蕾期間放線菌數(shù)量增長較大，有可能抑制了雙孢蘑菇菇蕾的形成，進而影響了其產量。

表 6 雙孢蘑菇不同生長年限和生長期放線菌數(shù)量的方差分析

對不同生長年限和不同生長期種植的雙孢蘑菇土壤中放線菌數(shù)量進行方差分析（見表6），結果表明不同年限和不同生長期的放線菌數(shù)量差異極顯著。

分析其原因，抗生素主要由放線菌產生，有可能其產生的抗生素大部分抑制雙孢蘑菇的生長發(fā)育，同時，放線菌同雙孢蘑菇一樣，其生長所必須的主要營養(yǎng)元素也是碳素和氮素，都能廣泛利用纖維素、半纖維素、木質素等含碳和蛋白質等含氮化合物，因此，導致雙孢蘑菇連作障礙的原因也有可能是連作后放線菌數(shù)量的激增。

2.2.3 雙孢蘑菇不同種植年限和生長期土壤真菌的變化趨勢雙孢蘑菇不同種植年限不同生長期土壤真菌的變化試驗結果見圖3。

圖 3 雙孢蘑菇不同年限和生長期連作地真菌的數(shù)量變化

從圖3來看，雙孢蘑菇種植當年、連作1年、2年時土壤真菌的數(shù)量在菇蕾期之前數(shù)量有一定差異，由于環(huán)境條件變化引起的土壤真菌數(shù)量別分在菌絲期、原基形成期、菇蕾期有一定小幅波動，但變化均較小，而當雙孢蘑菇進入出菇期后，土壤中真菌數(shù)量增至最多。

表 7 雙孢蘑菇不同生長年限和生長期真菌數(shù)量的方差分析

對不同生長年限和不同生長期種植的雙孢蘑菇土壤中真菌數(shù)量進行方差分析（見表7），結果表明不同生長期的真菌數(shù)量差異極顯著，而不同年限對真菌數(shù)量沒有多大影響。

雙孢蘑菇土壤真菌數(shù)量在種植當年、種植2年與種植3年的幾個生長期內分別相比，數(shù)量并無特別大的變化。可能是因為雙孢蘑菇就是真菌的緣故，土壤環(huán)境有利于雙孢蘑菇生長的條件下時，也對其他真菌的生長起到促進作用，這可能是導致雙孢蘑菇和土壤真菌數(shù)量較為同步的可能原因。而連續(xù)種植3年時，土壤真菌數(shù)量變化不顯著。

2.3 連作地土壤有益微生物的分離和鑒別

相比較之下，相關資料中對雙孢蘑菇連作對土壤微生物的影響方面的研究較多，但是對于連作土壤中對雙孢蘑菇有益微生物種類的研究極少，試驗就連作土壤中有益微生物對雙孢蘑菇菌絲的生長進行了相關試驗。

從土樣中分離的對雙孢蘑菇菌絲生長起促進的作用的微生物，根據(jù)菌落形態(tài)特征和數(shù)量組成共選留7種，其中固氮菌1種( N1），鏈霉菌2 種( A1、A2)，假單孢菌1種（B1），芽孢桿菌2種（C1、C2）、嗜熱細菌2種（Y1、Y2）。對雙孢蘑菇菌絲體生長影響情況見表8。

表 8 有益微生物對雙孢蘑菇菌絲體生長影響

對雙孢蘑菇菌絲體促進作用主要表現(xiàn)在兩個方面：一是處理后短期的促進作用；二是平穩(wěn)的促進作用。從對雙孢蘑菇菌絲生長有益的微生物種類看，而細菌作用強度最大，其中促進作用較大的是細菌中的固氮菌N1，其次是細菌中的芽孢桿菌C1和放線菌中的鏈霉菌A1。

3 討論與結論

（1）近年來寒地雙孢蘑菇發(fā)展較快，生產過程中發(fā)現(xiàn)存在嚴重重茬的問題，連年種植的棚室病蟲害日益嚴重，產量下降，效益降低，阻礙了寒地雙孢蘑菇的發(fā)展，為了寒地雙孢蘑菇可持續(xù)發(fā)展，研究其連續(xù)三年的連作土壤微生物變化情況，并分離鑒別出有益微生物，下步將對這些有益微生物對雙孢蘑菇的產量和品質的影響情況進一步研究；

（2）相關資料中對雙孢蘑菇連作對土壤微生物的影響方面的研究較多[9,10]。但是對于連作土壤中對雙孢蘑菇有益微生物種類的研究極少，就連作土壤中有益微生物對雙孢蘑菇菌絲的生長進行了相關試驗。同時因為雙孢蘑菇種植地域不同，其土壤微生物相差較大，寒地情況研究較少；

（3）經過試驗發(fā)現(xiàn)連續(xù)種植雙孢蘑菇三年的土壤，細菌數(shù)量不同生長期先升高再降低，逐年上升；放線菌數(shù)量不同生長期變化較平穩(wěn)，但隨著種植年限上升較大；真菌數(shù)量不同生長期變化較小，逐年變化也不顯著。從土樣中分離的對雙孢蘑菇菌絲生長起促進的作用的微生物7種，其中固氮菌1種( N1），鏈霉菌2種( A1、A2)，假單孢菌1種（B1），芽孢桿菌2種（C1、C2）、嗜熱細菌2種（Y1、Y2）。其中N1、C1和A1對雙孢蘑菇菌絲生長起促進作用較大；

（4）細菌、真菌、放線菌這三大微生物類群都是土壤物質生物轉化過程中的重要成員，在土壤肥力變化、動植物殘體的降解等方面起著非常重要作用。通過試驗可知，連作后雙孢蘑菇的土壤環(huán)境中三大類微生物數(shù)量都發(fā)生了變化，其細菌和放線菌數(shù)量的變化差異較大，表明此時種植雙孢蘑菇周邊的土壤微生物平衡狀態(tài)已被打破，土壤生態(tài)系統(tǒng)開始失調，可能會對雙孢蘑菇的正常生長發(fā)育造成不良影響。試驗只對雙孢蘑菇連續(xù)種植三年的地塊土壤進行了微生物試驗，連作更多年限的的雙孢蘑菇地塊還需要進一步的驗證，同時傳統(tǒng)平板計數(shù)法的采用還具有一定的局限性，土壤中的微生物群落不是全部可以被人工培養(yǎng)出來，雙孢蘑菇連作及其土壤微生物群落之間的互相影響規(guī)律還有待于進一步深入探索研究。

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The Effect of Successive Cropping on Soil Microbials ofin Cold Area

FU Jing, ZHENG Huan-chun*, GUO Jin-peng

157010,

In order to solve the obstacle of continuous cropping of, the microorganism in the soil of continuous cropping ofs was collected, measured and isolated in different replanting years and plant periods. The results showed that the quantity of soil microbial community was different with different replanting years and different growth periods. The quantity of bacteria increased first and then decreased in different plant period, and increased with the replant years. The quantity of actinomycetes changed steadily in different planting period, but increased greatly with the planting years. The quanty of fungi changed little in different plant periods and did not change significantly year by year. There were 7 kinds of microbes which could promote the growth ofmycelium, among which nitrogen fixing bacteria N1, bacillus C1and streptomyces A1could promote the growth ofmycelium.

Succesive cropping;; soil microorganism

S646

A

1000-2324(2022)03-0374-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.03.006

2022-03-14

2022-04-04

中央財政林業(yè)科技項目([2016]TQ005)

付靜(1983-),女,碩士,工程師,研究方向為食用菌栽培技術、林木遺傳育種. E-mail:55920867@qq.com

Author for correspondence. E-mail:zzhc2000@163.com