一株高效降解麥秸木質(zhì)素菌株的篩選及效能評價

趙文萱,鞠志剛,鄭亞強,施洪喜,梅松

一株高效降解麥秸木質(zhì)素菌株的篩選及效能評價

趙文萱,鞠志剛,鄭亞強,施洪喜,梅松

貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽 550025

為通過篩選為秸稈木質(zhì)素的預(yù)處理及秸稈高值化利用提供一種相對溫和且高效的微生物處理方法，并系統(tǒng)評價目的菌株對小麥秸稈木質(zhì)素的降解效果，進(jìn)而推動秸稈類木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源的高效轉(zhuǎn)化及利用。本研究以小麥秸稈為原料，通過愈創(chuàng)木酚及苯胺藍(lán)顯色法進(jìn)行初篩，選取在培養(yǎng)基上同時具有氧化圈及褪色圈的菌株，對篩選的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶歷程分析，對預(yù)處理前后小麥秸稈的成分進(jìn)行分析并采用掃描電鏡進(jìn)行表征，通過酶解糖化分析進(jìn)一步驗證菌株的木質(zhì)素降解效能。經(jīng)篩選獲得一株能夠有效降解小麥秸稈木質(zhì)素的枝頂孢屬真菌（sp），其發(fā)酵液漆酶活力為2.1 U/mL，木素過氧化物酶活力為1.6 U/mL，錳過氧化物酶活力為1.9 U/mL；在固液比1:3，120 r/min，28 ℃條件下，10 d后對小麥秸稈木質(zhì)素降解效率可達(dá)44.53%，同時纖維素及半纖維含量分別提高了8.34%和23.93%；通過掃描電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)枝頂孢屬真菌預(yù)處理后，小麥秸稈致密有序的表面明顯被破壞，產(chǎn)生褶皺，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了斷裂、粗糙、空穴的現(xiàn)象；枝頂孢屬真菌預(yù)處理的小麥秸稈，經(jīng)纖維素酶及木聚糖酶水解后葡萄糖含量可達(dá)64 mmol/L，木糖含量可達(dá)28 mmol/L。本研究中篩選到的枝頂孢屬真菌產(chǎn)酶效力高，在有效降解秸稈中木質(zhì)素組分的同時，較好地保留了纖維素及半纖維素組分，具有良好的應(yīng)用前景。

小麥秸稈; 生物降解; 菌株篩選

秸稈是一種含量豐富的木質(zhì)纖維素類可再生生物質(zhì)資源[1]，經(jīng)處理可轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品。秸稈類生物質(zhì)資源主要成分為木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。纖維素及半纖維素是糖類物質(zhì)組成的高分子化合物，木質(zhì)素是以苯丙烷基為基本結(jié)構(gòu)單元組成的致密結(jié)構(gòu)，將纖維素和半纖維素包裹其中，形成一種天然的生物質(zhì)抗降解屏障，嚴(yán)重阻礙了纖維素及半纖維被酶解糖化[2]。因此，目前秸稈類生物質(zhì)資源的利用率相對較低，這不僅造成了資源浪費，還會造成環(huán)境污染。

為了有效降解秸稈中的木質(zhì)素，提高秸稈利用率，常采用物理法、化學(xué)法、微生物法或耦合法對秸稈進(jìn)行預(yù)處理[3]。采用物理法處理木質(zhì)素一般耗能較大且效果不甚理想；采用化學(xué)法處理木質(zhì)素組分雖然效果較好，但會對環(huán)境造成較為嚴(yán)重的污染；相比之下，通過微生物產(chǎn)酶降解法破壞秸稈的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)以其成本低、對環(huán)境友好、操作安全等優(yōu)點逐漸受到關(guān)注，其中起主要作用的為漆酶，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶[4]。

目前被廣泛應(yīng)用于秸稈木質(zhì)素降解的模式菌株為黃孢原毛平革菌（）[5]，但有研究表明，黃孢原毛平革菌在降解木質(zhì)素的同時會破壞部分纖維素及半纖維素組分[6]。因此自然界中是否存在木質(zhì)素降解效果好，且能較好保留秸稈纖維素及半纖維素的菌株有待考究。

基于以上，本研究通過篩選培養(yǎng)基初篩及發(fā)酵產(chǎn)酶試驗復(fù)篩獲得高產(chǎn)木質(zhì)素酶的菌株；為驗證菌株效能，以小麥秸稈為試驗材料，采用篩選到的菌株對小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，對預(yù)處理前后的小麥秸稈進(jìn)行成分分析，從而獲得有效降解小麥秸稈木質(zhì)素的同時可較好保留纖維素及半纖維素組分的菌株，并對其進(jìn)行鑒定；為綜合評價菌株的木質(zhì)素降解效能，通過掃描電鏡同步驗證小麥秸稈結(jié)構(gòu)的變化，并對處理后小麥秸稈進(jìn)行水解，根據(jù)水解液中的糖含量進(jìn)一步檢驗?zāi)康木杲到饽举|(zhì)素的效果。

期望通過本研究為秸稈木質(zhì)素的預(yù)處理及秸稈高值化利用提供一種相對溫和且高效的微生物處理方法，系統(tǒng)評價目的菌株對小麥秸稈木質(zhì)素的降解效果，進(jìn)而推動秸稈類木質(zhì)纖維素生物質(zhì)資源的高效轉(zhuǎn)化及利用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試驗材料包括：2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、3,4-二甲氧基芐醇3,4-二甲氧基芐醇（黎蘆醇）及硫酸錳（MnSO4）等試劑購自阿拉丁生化科技公司；混合纖維素酶（黑曲霉）及木聚糖酶（青霉）購自Sigma公司；葡萄糖及木糖含量測定所使用的試劑盒，購自酶聯(lián)生物公司。黃孢原毛平革菌購自中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心（菌株編號40719）；小麥秸稈全株采集于貴州省貴陽市，干燥后粉碎，過10目篩備用；無機(jī)鹽營養(yǎng)液，購自山東拓普生物工程有限公司。

主要試驗儀器包括：臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL18M）、酶標(biāo)儀（BMG LABTECH）、馬弗爐（天津中環(huán)電爐股份有限公司）、真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）及掃描電鏡（Hitachi, Japan）等。

1.2 樣品采集與處理

菌株富集：用于高效木質(zhì)素降解菌株篩選的腐木、爛木葉等32份樣品采集于貴州省山地林區(qū)。取不同樣品（1 g）于盛有無菌水（100 mL）的三角瓶（250 mL）中，室溫振蕩1 h后取上清液，采用梯度稀釋法稀釋至10-6后，吸取1 mL涂布于滅菌PDA平板上（馬鈴薯200 g煮沸過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水補足1000 mL），待其長出單菌落。

菌株初篩：將單菌落同時接種于0.04%的愈創(chuàng)木酚PDA篩選培養(yǎng)基（篩選產(chǎn)漆酶菌株）及0.1g/L的苯胺藍(lán)PDA篩選培養(yǎng)基（篩選產(chǎn)木素過氧化物酶及錳過氧化物酶菌株）固體平板進(jìn)行同步初篩（28 ℃，10 d），篩選能同時產(chǎn)生氧化圈及褪色圈的菌株，并計算氧化圈及褪色圈直徑與菌落直徑比，比值越大說明其高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的可能性越大[7]。

菌株復(fù)篩：配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基（小麥秸稈30 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L），將初篩菌株接種其中進(jìn)行培養(yǎng)（120 r/min，28 ℃），約10 d。每24 h采樣1 mL，將樣品置于離心機(jī)中，1000 r/min離心8 min后，吸取上清液即為粗酶液。并測定菌株的木質(zhì)素酶產(chǎn)酶歷程，至菌株酶活力呈下降趨勢，選擇漆酶、木素過氧化物酶及錳過氧化物酶活力高的菌株作為本研究的出發(fā)菌株[8]。

酶活力測定方法[9]：（1）木素過氧化物酶活力國際單位定義為：每1 min氧化1 μmol藜蘆醇所需要的酶量（U）。測定方法：取10 mmol藜蘆醇40 μL，0.1 mol pH5.0的酒石酸緩沖液152 μL，10 mmol過氧化氫8 μL，混勻后，加入10 μL稀釋酶液，置于酶標(biāo)儀中于310 nm讀取1 min前后的OD值變化，計算酶活力。（2）錳過氧化物酶活力國際單位定義為：每1 min將1 μmol Mn2+氧化成Mn3+所需要的酶量（U）。測定，取10 mmol硫酸錳5 μL，0.1 mol pH5.0酒石酸緩沖液187 μL，10 mmol過氧化氫8 μL，混勻后，加入10 μL稀釋酶液，置于酶標(biāo)儀中于270 nm讀取1 min前后的OD值變化，計算酶活力。（3）漆酶活力酶活力國際單位定義為：每1 min氧化1 μmol ABTS所需要的酶量（U）。測定方法：取10 mmol ABTS溶液10 μL，0.1 mmol pH4.6醋酸緩沖液190 μL，混勻后，加入10 μL稀釋酶液，置于酶標(biāo)儀中于420 nm讀取1 min前后的OD值變化，計算酶活力。

菌株效能驗證：小麥秸稈預(yù)處理發(fā)酵體系，以固液比1:3添加小麥秸稈粉和0.48%的無機(jī)鹽營養(yǎng)液，混勻后滅菌，分裝于250 mL三角瓶中（裝液量100 mL）。采用直徑5 mm打孔器對生長均勻的目的菌株P(guān)DA平板進(jìn)行打孔，將菌塊接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，對小麥秸稈進(jìn)行發(fā)酵預(yù)處理[10]，以接入黃孢原毛平革菌（目前科學(xué)界認(rèn)定的木質(zhì)素降解模式菌株）的小麥秸稈和未接種的小麥秸稈為對照，每組三個平行（預(yù)處理條件：120 r/min，28 ℃，10 d）。

1.3 分析方法

秸稈成分分析：預(yù)處理后的小麥秸稈采用超純水清洗進(jìn)行反復(fù)沖洗（至少三遍），烘干后保存。測定不同微生物預(yù)處理后小麥秸稈的降解率以及秸稈中木質(zhì)素、纖維素及半纖維的含量變化，采用美國國家可再生能源實驗室（NREL）的標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行測定[11,12]，即差重法測定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

菌株形態(tài)學(xué)及生物學(xué)鑒定：通過初篩及復(fù)篩確定目的菌株后，觀察菌落生長形態(tài)、顏色等并采用顯微鏡觀察菌體特征，初步確定種屬后提取菌株基因組，以菌株鑒定的通用引物擴(kuò)增特異序列后與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，繼而確定菌株的分類所屬。

預(yù)處理小麥秸稈結(jié)構(gòu)分析：為進(jìn)一步驗證本研究所獲得的菌株對木質(zhì)素降解效果切實有效，對預(yù)處理后的小麥秸稈進(jìn)行冷凍干燥，脫去樣品中的水分，采用掃描電鏡觀察預(yù)處理后小麥秸稈表觀結(jié)構(gòu)的變化，以模式菌株預(yù)處理及未處理小麥秸稈為對照[13]。

預(yù)處理秸稈酶解糖化分析：采用纖維素酶（30 fpu/g）及木聚糖酶30 U/g）對1.5 g預(yù)處理小麥秸稈進(jìn)行水解，在料液比1:10，50 ℃，140 r/min條件下水浴搖床中酶解60 min后，采用葡萄糖及木糖試劑盒分別測定水解液中葡萄糖、木糖及混合糖（葡萄糖與木糖含量總和）的含量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株富集與篩選

首先將不同樣品（爛木葉等）混懸稀釋后涂布于PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，共富集到的362株菌株，同時接種于篩選產(chǎn)漆酶菌株的愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基及篩選產(chǎn)木素過氧化物酶、錳過氧化物酶菌株的苯胺藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株初篩；經(jīng)初篩共獲得17株真菌既能在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上產(chǎn)生氧化圈，又能在苯胺藍(lán)上產(chǎn)生褪色圈，則初步推斷這些菌株具有產(chǎn)木質(zhì)素酶的可能性；測量菌株氧化圈/褪色圈直徑與菌落直徑的比值，其中12號菌株效果最佳，氧化圈與菌落直徑比為2.15，褪色圈與菌落直徑比為2.176，比值越大則初步推斷該菌株產(chǎn)酶能力越強（圖1）。

繼而進(jìn)行菌株復(fù)篩，將初篩得到的17株菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別測定菌株漆酶、木素過氧化物酶及錳過氧化物酶活力，選擇酶活力高的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。經(jīng)復(fù)篩可以發(fā)現(xiàn)，初篩中氧化圈及透明圈與菌株的直徑比并不能完全顯示菌株酶活力的高低。經(jīng)酶活力測定，本研究獲得三株綜合產(chǎn)酶能力較強的菌株（圖2 A），繼而對優(yōu)勢菌株進(jìn)行產(chǎn)酶歷程分析（圖2 B），其中2號菌株漆酶活力最高可達(dá)2.1 U/mL，木素過氧化物酶活力最高可達(dá)1.6 U/mL，錳過氧化物酶活力最高可達(dá)1.9 U/mL；8號菌株漆酶活力最高為1.5 U/mL，木素過氧化物酶活力最高為0.9 U/mL，錳過氧化物酶活力最高為1.6 U/mL；12號菌株漆酶活力最高可達(dá)2.4 U/mL，木素過氧化物酶活力最高為1.2 U/mL，錳過氧化物酶活力最高為1.7 U/mL。

圖1 愈創(chuàng)木酚氧化圈及苯胺藍(lán)褪色圈與菌落直徑比

圖2 （A）不同菌株木質(zhì)素酶活力測定（B）優(yōu)勢菌株產(chǎn)酶歷程分析

根據(jù)復(fù)篩結(jié)果，為進(jìn)一步驗證菌株木質(zhì)素降解效能，分別采用2號、8號、12號對小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，以黃孢原毛平革菌預(yù)處理和未經(jīng)任何微生物預(yù)處理的小麥秸稈為對照，探究本研究中篩選到的菌株對小麥秸稈木質(zhì)素、纖維素及半纖維素組分的降解情況（表1）。

表1 不同菌株預(yù)處理前后小麥秸稈成分分析

通過對不同菌株預(yù)處理前后的小麥秸稈重量進(jìn)行對比可知，預(yù)處理后的小麥秸稈均會部分失重。對不同菌株預(yù)處理前后小麥秸稈成分分析可知，本研究中經(jīng)篩選獲得的2號菌株對小麥秸稈木質(zhì)素降解效率最高可以達(dá)到44.53%，相較于模式菌株黃孢原毛平革菌的木質(zhì)素降解率35.70%有所提高，但經(jīng)分析可知本研究中篩選到的2號菌株在預(yù)處理過程中可以較好的保留小麥秸稈纖維素及半纖維素組分，預(yù)處理后纖維素及半纖維含量分別提高了8.34%和23.93%；本研究中篩選到的8號和12號菌株木質(zhì)素酶的產(chǎn)酶效力雖強，但其木質(zhì)素降解能力相對較低，降解率分別為16.56%和12%，同時較2號菌株相比在降解木質(zhì)素的同時會水解小麥秸稈中較多纖維素及半纖維素組分；因此選擇2號菌株為后續(xù)研究對象，其為可以高效降解木質(zhì)素的同時較好的保留小麥秸稈纖維素及半纖維素組分的菌株。

2.2 菌株形態(tài)學(xué)及生物學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d后單菌落直徑可達(dá)20 mm，菌體近圓形，呈淡粉色，厚絨狀，中間稍有凸起；采用顯微鏡觀察菌絲體，孢子梗長度不定，幼期短，成熟后變長，分生孢子內(nèi)聚或形成疏松的頭狀花序，孢子橢圓形，壁光滑（圖3）；提取菌株的基因組DNA，選擇真菌的ITS序列通用引物擴(kuò)增后測序，將測序結(jié)果用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對后并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果，確定該菌為枝頂孢屬真菌(sp)。

圖3 （A）菌株菌落形態(tài)（B）顯微鏡下菌絲形態(tài)（100X）

2.3 菌株效能驗證

采用掃描電鏡，對原始小麥秸稈、枝頂孢屬真菌預(yù)處理的小麥秸稈及黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈進(jìn)行觀察（圖4）。

圖4 （A）原始小麥秸稈（B）黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈（C）枝頂孢屬真菌預(yù)處理的小麥秸稈

如圖4（A）所示，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過預(yù)處理的小麥秸稈表面結(jié)構(gòu)致密，纖維素排列有序；經(jīng)黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈表觀結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4（B）所示，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過黃孢原毛平革菌預(yù)處理后小麥秸稈表面明顯產(chǎn)生褶皺，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了斷裂、粗糙、空穴的現(xiàn)象；經(jīng)過枝頂孢屬真菌預(yù)處理后，小麥秸稈表面致密有序的表面明顯被破壞，產(chǎn)生褶皺如圖4（C）所示；通過掃描電鏡結(jié)果分析，可以推斷經(jīng)兩種菌株預(yù)處理的小麥秸稈，在后續(xù)酶解過程中會提高纖維素降解酶與纖維素、半纖維素的可及度，提高單糖得率，可有效地提高小麥秸稈利用率。

為進(jìn)一步驗證枝頂孢屬真菌對小麥秸稈中木質(zhì)素具有良好預(yù)處理效果的同時可以較好的保留纖維素及半纖維素組分，采用纖維素酶（30 fpu/g）及木聚糖酶（30 U/g）在料液比1:10，50 ℃，140 r/min條件下，將1.5 g經(jīng)水洗干燥的空白對照秸稈，枝頂孢屬真菌及黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈酶解60 min，分別測定水解液中葡萄糖及木糖的含量，并計算混合糖（葡萄糖與木糖含量總和）的含量（圖5）。

圖5 預(yù)處理小麥秸稈酶解分析(A)原始小麥秸稈酶解后糖含量分析（B）枝頂孢屬真菌預(yù)處理小麥秸稈酶解后糖含量分析（C）黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈酶解后糖含量分析

如圖5A所示，原始小麥秸稈經(jīng)纖維素酶及木聚糖酶水解后，葡萄糖含量為11 mmol/L，木糖含量為12 mmol/L，未經(jīng)處理的小麥秸稈酶解效果不佳；枝頂孢屬真菌預(yù)處理的小麥秸稈水解后葡萄糖含量為64 mmol/L，木糖含量為28 mmol/L，水解效果良好，如圖5B所示。黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈水解后葡萄糖含量為45 mmol/L，木糖含量為19 mmol/L，水解效果較好，如圖5C所示；經(jīng)分析可知，未經(jīng)處理的小麥秸稈因有木質(zhì)素包裹，故水解效果不佳，經(jīng)枝頂孢屬真菌和黃孢原毛平革菌預(yù)處理的小麥秸稈因木質(zhì)素被降解掉一部分，水解液中糖含量顯著提高，但經(jīng)枝頂孢屬真菌預(yù)處理的小麥秸稈水解液中的葡萄糖及木糖含量分別較黃孢原毛平革菌高出了42.2%和47.4%，混合糖含量提高了43.8%，進(jìn)一步說明，本研究中篩選到的枝頂孢屬真菌在有效降解秸稈中木質(zhì)素組分的同時，對纖維素及半纖維素組分損傷較少。

3 討論與結(jié)論

本研究經(jīng)過菌株初篩，獲得17株菌既能在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上產(chǎn)生氧化圈，又能在苯胺藍(lán)上產(chǎn)生褪色圈，初步確定這些菌株可產(chǎn)生木質(zhì)素酶；并測量了氧化圈及褪色圈直徑與菌落直徑的比值，但經(jīng)過產(chǎn)酶歷程分析得知，氧化圈及透明圈與菌落的直徑比并不能完全顯示菌株酶活力的高低；進(jìn)而選擇木質(zhì)素酶活力較高的菌株，以黃孢原毛平革菌為對照，分析其對預(yù)處理前后小麥秸稈成分的影響，本研究最終獲得一株對小麥秸稈木質(zhì)素降解效率可以達(dá)到44.53%，又可以較好的保留小麥秸稈纖維素及半纖維素組分的菌株，因此本研究中篩選到的菌株相較于前人研究具有明顯優(yōu)勢[15]；同時本研究中篩選到的菌株酶活力較高，其漆酶活力最高可達(dá)2.1 U/mL，為李小玉等[4]的研究的17.5倍，木素過氧化物酶活力最高可達(dá)1.6 U/mL，為李小玉等[4]的研究的1.19倍，錳過氧化物酶活力最高可達(dá)1.9 U/mL，為李小玉等[4]的研究的4.09倍，此結(jié)果再次與孟童瑤等[16]的研究結(jié)果相呼應(yīng)，木質(zhì)素酶活力高，可有效提高木質(zhì)素的降解率；經(jīng)鑒定為本研究中篩選到的菌株為枝頂孢屬真菌（sp），屬于蟲草科菌株。

為進(jìn)一步驗證菌株對小麥秸稈的木質(zhì)素降解效果，通過掃描電鏡對小麥秸稈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過枝頂孢屬真菌預(yù)處理后，小麥秸稈致密有序的表面明顯被破壞，產(chǎn)生褶皺，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了斷裂、粗糙、空穴的現(xiàn)象，也進(jìn)一步說明了本研究中篩選到的可有效去除小麥秸稈中部分木質(zhì)素組分，與樸哲等的研究結(jié)果一致[17]；同時根據(jù)Palonen H等[18]的研究結(jié)果可以進(jìn)一步推斷，木質(zhì)素的去除將在后續(xù)酶解過程中提高纖維素及半纖維素酶與纖維素、半纖維素的可及度，提高水解產(chǎn)物的單糖得率；繼而進(jìn)行酶解糖化分析，枝頂孢屬真菌預(yù)處理的小麥秸稈水解后葡萄糖含量為64 mmol/L，木糖含量為28 mmol/L，分別較黃孢原毛平革菌高了42.2%和47.4%；與蘇玉春等[19]篩選到的菌株相較，本研究中篩選到的枝頂孢屬真菌在有效降解小麥秸稈中木質(zhì)素組分的同時，對纖維素及半纖維素組分損傷較低。

綜上所述，本研究篩選到的枝頂孢屬真菌可提高木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源的部分利用率，在秸稈資源的綜合利用方面具有較好的潛力和應(yīng)用前景。

[1] 于振波,劉玉萍,李廣來,等.農(nóng)業(yè)秸稈綜合利用技術(shù)探析[J].再生資源與循環(huán)經(jīng)濟(jì),2019,12(5):28-31

[2] Islam KS, Saleh ZN, Miray S,. Cloning, expression and biochemical characterization of lignin-degrading DyP-type peroxidase fromsp. Strain BL5 [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2021,151:109917

[3] 李小玉,李廣慈,李學(xué)兵.不同化學(xué)法分離解聚過程對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響[J].遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報,2020(1):1-9

[4] 李靈靈,王敬紅,趙鐸,等.木質(zhì)素降解菌BYL-7的篩選及降解條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報,2020,47(12):4059-4071

[5] Hemati A, Aliasgharzad N, Khakvar R,. Role of lignin and thermophilic lignocellulolytic bacteria in the evolution of humification indices and enzymatic activities during compost production [J]. Waste Management, 2020,119:122-134

[6] Xiuxiu F, Qiumin L, Yunqin L,. Screening of a microbial consortium for selective degradation of lignin from tree trimmings[J]. Bioresource Technology, 2018,254:247-255

[7] 劉劍,劉君昂,周國英,等.竹材木質(zhì)素高效降解菌的分離篩選及鑒定[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2014(8):48-52

[8] 崔堂武,袁波,凌晨,等.木質(zhì)素降解酶的酶活測試方法的評價與分析[J].化工進(jìn)展,2020,39(12):5189-5202

[9] 趙文萱,焦宏官,鄭亞強.預(yù)處理及木質(zhì)素酶對玉米秸稈酶解糖化效果影響[J/OL].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.1-9 [2021-12-01].https://doi.org/10.13327/j.jjlau.2020.6019.

[10] Saritha M, Anju A, Lata N. Pretreatment of paddy straw with Trameteshirsuta for improved enzymatic saccharification [J]. BioresourceTechnology, 2012,104:459-465

[11] Sluiter A, Hames, B, Ruiz R,. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass [R/OL]. 2012. Technical Report NREL/TP- 510-42618. http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html.

[12] Alvira P, Tomas-Pejo E, Ballesteros M,. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: a review [J]. Bioresource Technology, 2010,101(13):4851-4861

[13] 冉福,焦婷,雷趙民,等.不同蒸汽爆破條件對玉米秸稈飼用價值的影響[J].草業(yè)科學(xué),2020,37(10):2133-2141

[14] Al-Zuhair S, Ahmed K, Abdulrazak A,. Synergistic effect of pretreatment and hydrolysis enzymes on the production of fermentable sugars from date palm lignocellulosic waste [J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2013,19(2):413-415

[15] 韓東晶,王志花,周寧,等.白蟻菌圃中木質(zhì)素降解菌的篩選及降解效果[J].生物技術(shù)通報,2022(3):113-120

[16] 孟童瑤,李素艷,鄒榮松,等.固定化木質(zhì)素降解菌對園林廢棄物堆肥的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報,2021,38(1):38-46

[17] 樸哲,李玉敏,馬帥,等.堆肥制作中微生物侵染秸稈的環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報,2011,27(5):98-100

[18] PalonenH. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose [J]. VTTPublications Information Service, 2004(520):1-80

[19] 蘇玉春,李文斌,向應(yīng)欣,等.毛頭鬼傘降解木質(zhì)素及其優(yōu)化條件[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2021,43(3):310-316

趙宗祥,王明偉,李蕾,吳俊南,王夢茹,李世廣.羅伯茨綠僵菌AAU-4對草地貪夜蛾幼蟲的毒力及生長發(fā)育的影響.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2022,53(1):60-65. 文中“羅伯茨綠僵菌”更正為“羅伯茨綠僵菌”。

Screening and Efficacy Evaluation on a Strain EfficientlyDegrading Wheat Straw Lignin

ZHAO Wen-xuan, JU Zhi-gang, ZHENG Ya-qiang, SHI Hong-xi, MEI Song

550025,

To provide a relatively mild and efficient microbial treatment method for the pretreatment of straw lignin and high-value utilization of straw through screening, and systematically evaluate the degradation effect of the target strain on lignin so as to promote the efficient transformation and utilization of lignocellulosic biomass resources of straw. In this study, wheat stalk was used as raw material, and the guaiacol and aniline blue color development method were used for preliminary screening. The strains that have both oxidation circle and fading circle on the culture medium were selected. And the enzyme production process of the selected strains was analyzed. The composition of wheat straw before and after pretreatment was analyzed and characterized by scanning electron microscope. The lignin degradation efficiency of the strain was further verified by enzymatic saccharification analysis. After screening, aspwhich can effectively degrade straw lignin was obtained. Fermentation broth enzyme activity test showed that the laccase activity, lignin peroxidase activity and manganese peroxidase activity ofspwere 2.1 U/mL, 1.6 U/mL and 1.9 U/mL respectively. Under the conditions of solid-liquid ratio 1:3, 120 r/min and 28 ℃, the degradation efficiency of wheat straw lignin can reach 44.53% after 10 days, at the same time, the cellulose and hemicellulose components increased 8.34% and 23.93% respectively. Scanning electron microscopy showed that after pretreatment withsp, the dense and orderly surface of wheat straw was obviously damaged, resulting in folds, fracture, roughness and holes. The glucose content and xylose content of wheat straw pretreated byspreach 64 mmol/ L and 28 mmol/ L after hydrolysis by cellulase and xylanase. In summary, thespscreened in this study have high enzyme production efficiency, it degrade the lignin components in straw effectively, while retain the cellulose and hemicellulose components well, has a good application prospect.

Wheat straw; biodegradation; strain screening

Q819

A

1000-2324(2022)03-0386-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.03.008

2022-03-15

2022-04-24

貴中醫(yī)博士啟動基金([2020]18 號)

趙文萱(1990-),女,博士研究生,講師,主要生物質(zhì)資源開發(fā)利用的研究. E-mail:zhaowenxuan0602@163.com