病毒性心肌炎患者血清sST2、mir-26b表達水平及臨床意義

梁萬前，李建華，白彩艷，李燕，陳志剛

心肌炎是由心臟損傷引起的心肌組織炎癥性疾病，其感染原因包括病毒、細菌、原生動物或真菌，常見的心肌炎由病毒感染引起[1,2]。病毒性心肌炎可表現(xiàn)為疲勞和呼吸短促的非特異性癥狀或類似急性冠狀動脈（冠脈）綜合征的侵略性癥狀，給其臨床診斷、預后和治療帶來挑戰(zhàn)[3]。因此，尋找特異反映病毒性心肌炎病理特征的分子生物標記物成為研究的重點。微小RNA（miRNA）在心臟發(fā)生、心臟病等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)廣泛保守的miR-26家族與肥胖癥、膽管癌和心血管疾病密切相關(guān)[5-7]，且在乙肝病毒感染的人外周血單核細胞中表達下降[8]，但尚未報道m(xù)iR-26家族成員之一miR-26b在病毒性心肌炎病理進展中的功能。此外，在包括冠心病、心肌梗塞、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病中，可溶性生長刺激表達基因2蛋白（sST2）與心血管疾病的嚴重程度呈正相關(guān)，具有診斷和預后價值[9]，與病毒感染引起的炎癥性疾病相關(guān)[10]，但sST2與病毒性心肌炎是否存在聯(lián)系尚不明確。本研究擬觀察病毒性心肌炎患者和健康體檢者血清中miR-26和sST2表達水平，初步探究其與病毒性心肌炎患者病情的關(guān)系及預測預后的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組納入2017年3月至2019年12月間于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科收治的病毒性心肌炎患者56例，其中男性26例，女性30例，年齡23～65（44.32±9.11）歲。病毒性心肌炎患者的診斷標準符合《2013歐洲心臟病學會心肌炎的病因、診斷、管理和治療共識》[11]。納入標準：①符合診斷標準；②年齡18～65歲；③治療前1～2月內(nèi)均具有病毒感染史；④病史資料完整。排除標準：①患有肝、肺、腎或其他血液系統(tǒng)疾??；②患有高血壓、感染性心內(nèi)膜炎等心臟??；③非首次發(fā)??；④惡性腫瘤患者；⑤非自愿加入實驗者。根據(jù)患者病情嚴重程度分：輕度17例，中度19例，重度20例。另選取上述期間健康體檢者56例為正常對照，其中男性24例，女性32例，年齡21～65歲，平均年齡為（46.18±8.64）歲。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準，研究對象及家屬均知情同意并簽字確認。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集分別采集病毒性心肌炎患者和健康體檢者晨起空腹靜脈血5 ml，-4℃置于生化管內(nèi)，離心（2500 r/min，15 min）后，收集上清液，分裝（避免多次凍融）標記，-50℃保存，待檢。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清中miR-26b表達水平根據(jù)Trizol試劑盒說明提取各組血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。嚴格按照qRT-PCR試劑盒說明書步驟檢測各組血清中miR-26b表達水平。qRT-PCR反應條件：95℃預熱1 min，55℃反應1 min，72℃反應1 min，72℃延長5 min，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后，收集數(shù)據(jù)，以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-26b相對表達量，其中miR-26b和U6引物序列由由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成，表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測sST2水平根據(jù)sST2試劑盒說明書步驟，以空白孔調(diào)零，在加入終止液15 min內(nèi)，測量各組在450 nm波長處各孔OD值，檢測各組樣本中sST2表達水平。

1.2.4 主要儀器與試劑RNA提取試劑盒（編號：R0011）購自上海碧云天有限公司；sST2試劑盒（QY-H50015）購自齊一生物科技（上海）有限公司；TaqMan一步式qRT-PCR試劑盒（Probe qRT-PCR）（T2210）購自北京Solarbio公司；qRT-PCR儀和MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2.5 觀察指標比較患者治療后3個月心電圖、肌鈣蛋白恢復情況及臨床癥狀變化，分為預后良好組（臨床癥狀消失或好轉(zhuǎn)，心電圖或肌鈣蛋白恢復正常）和預后不良組（臨床癥狀、肌鈣蛋白和心電圖均未顯著改善甚至加重），比較兩組血清miR-26b、sST2水平，及對預后的預測效果。

1.3 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用方差分析。計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。利用ROC曲線評估血清中miR-26b、sST2水平對病毒性心肌炎預后不良的預測價值。利用多因素Logistic分析影響病毒性心肌炎患者預后不良的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料病毒性心肌炎患者與健康體檢者的年齡、男性比例、總膽固醇、三酰甘油和膽固醇酯含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，表2。

表2 一般資料比較

2.2 血清中miR-26b、sST2表達水平比較與健康體檢者相比，病毒性心肌炎患者血清中miR-26b表達水平顯著降低（P＜0.05），sST2水平顯著升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表3。

表3 miR-26b、sST2在病毒性心肌炎患者和健康體檢者血清中表達水平比較

2.3 不同嚴重程度病毒性心肌炎患者miR-26b及sST2水平比較與輕度病毒性心肌炎患者相比，中度和重度患者血清中miR-26b表達水平均顯著降低（P＜0.05），sST2表達水平顯著升高（P＜0.05）；與中度患者相比，重度患者血清中miR-26b表達水平均顯著降低（P＜0.05），sST2表達水平顯著升高（P＜0.05），表4。

表4 miR-26b、sST2在不同嚴重程度病毒性心肌炎患者血清中表達水平比較

2.4 預后良好和預后不良病毒性心肌炎患者血清miR-26b、sST2水平比較與預后不良組相比，預后良好組病毒性心肌炎患者血清miR-26b水平顯著升高（P＜0.05），sST2水平顯著降低（P＜0.05），表5。

表5 預后良好和預后不良病毒性心肌炎患者血清miR-26b、sST2水平比較

2.5 血清中miR-26b、sST2水平對病毒性心肌炎預后不良的預測價值ROC曲線顯示，血清miR-26b預測病毒性心肌炎患者預后不良的曲線下面積（AUC）為0.804（95%CI：0.653～0.954，P＜0.001），截斷值為0.389，對應的敏感度為78.6%，特異性為83.3%；血清中sST2預測病毒性心肌炎患者預后不良的AUC為0.830（95%CI：0.691～0.969，P＜0.001），截斷值為86.689 ng/ml，敏感度為78.6%，特異性為88.1%；兩者聯(lián)合預測病毒性心肌炎患者預后不良的AUC為0.888（95%CI：0.777～0.999，P＜0.001），敏感度為85.7%，特異性為73.8%。（圖1）。

圖1 血清中miR-26b、sST2水平對病毒性心肌炎預后不良的預測價值

2.6 影響病毒性心肌炎患者預后不良的危險因素以病毒性心肌炎患者預后情況為因變量，以血清miR-26b、sST2水平為自變量進行多因素Logistic分析，結(jié)果顯示血清miR-26b水平低、sST2水平高是影響病毒性心肌炎患者預后不良的危險因素（P＜0.05），表6。

表6 影響病毒性心肌炎患者預后不良的危險因素分析

3 討論

miRNA是非編碼RNA家族的成員，通過影響mRNA穩(wěn)定性并充當?shù)鞍踪|(zhì)翻譯的負調(diào)節(jié)劑，調(diào)控許多信號傳導途徑和細胞過程[12]。在心血管系統(tǒng)中，miRNA控制心肌細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的功能，參與心肌梗塞、心力衰竭、炎癥和動脈粥樣硬化等疾病的病理生理學進展[13]。趙欣等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a/b在慢性心房纖顫患者心房組織中表達水平顯著下調(diào)。在血管鈣化維持性血液透析患者血清中，miR-26a水平顯著降低[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎患者與健康體檢者的年齡、男性比例、總膽固醇、三酰甘油和膽固醇酯差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性，但病毒性心肌炎患者血清中miR-26b表達水平顯著降低，與趙欣、石現(xiàn)軍等[14,15]研究類似，提示miR-26b低表達可能與病毒性心肌炎患者病情發(fā)展相關(guān)。sST2是與炎癥和纖維化相關(guān)的生物標記物，在心力衰竭患者血清中，sST2表達水平高于健康體檢者[16]。本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎患者血清中sST2水平顯著高于健康體檢者，與李祥東等[16]研究相似，提示血清中sST2高表達可能與病毒性心肌炎發(fā)展相關(guān)。侯麗娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎病毒感染患者比健康體檢者血清中sST2水平高，并與患者病情嚴重程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，輕度、中度和重度病毒性心肌炎患者血清中miR-26b表達水平依次降低，sST2表達水平依次升高，提示miR-26b低表達、sST2高表達可能與病毒性心肌炎患者的嚴重程度相關(guān)。

miR-26能夠通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的細胞因子表達，參與和炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，而其低表達與預后不良相關(guān)[17]。sST2作為一種新型生物標記物，對心力衰竭等心血管疾病的死亡率具有很強的獨立預測價值[18]。在心臟驟停給予心肺復蘇患者中，sST2高表達的死亡率高于低表達患者，可以作為預后評估的良好指標[19]。此外，sST2也可以預測冠狀動脈搭橋術(shù)后死亡風險[20]。本研究結(jié)果顯示，預后不良組病毒性心肌炎患者相對于預后良好組患者血清miR-26b水平顯著降低，sST2水平顯著升高，提示miR-26b低表達、sST2高表達可能與病毒性心肌炎患者預后不良相關(guān)。ROC結(jié)果顯示，血清miR-26b、sST2預測病毒性心肌炎患者預后不良的AUC分別為0.804、0.830，二者聯(lián)合預測的AUC為0.888，提示血清miR-26b、sST2對患者預后均有一定的預測價值，二者聯(lián)合預測價值更高。進一步Logistic分析顯示，血清中miR-26b水平低、sST2水平高是影響病毒性心肌炎患者預后不良的危險因素，再一次表明miR-26b低表達、sST2高表達與病毒性心肌炎患者的預后密切相關(guān)，推測miR-26b和sST2可能是用于預測病毒性心肌炎預后的潛在生物標志物。

綜上所述，病毒性心肌炎患者血清中miR-26b低表達，sST2高表達，與病毒性心肌炎患者嚴重程度和不良預后相關(guān)，監(jiān)測病毒性心肌炎患者血清中miR-26b和sST2表達水平可能對預測患者病情發(fā)展和改善預后具有重要臨床意義，這可能有助于病毒性心肌炎的臨床診斷和治療。但病毒性心肌炎發(fā)病原理涉及復雜的生物學機制，且本研究樣本量少，結(jié)局具有局限性，后續(xù)需加大樣本量，進行更深入的研究。