色譜技術(shù)在肽分離中的應(yīng)用

張碩，陳炬龍，唐雨欣，蔡寶國(guó)

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精化妝品學(xué)部，上海，201418)

伴隨食品、醫(yī)藥和生物等科學(xué)與工程技術(shù)的不斷交叉發(fā)展，肽的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。隨之肽的需求呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這對(duì)于肽的分離和純化工作提出了更高的要求。對(duì)肽進(jìn)行精確且系統(tǒng)的分離是獲取優(yōu)質(zhì)肽、提高其性能及擴(kuò)大其應(yīng)用的重要前提。肽存在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)多樣性的特點(diǎn)，肽分離的儀器也隨之更新迭代，以適應(yīng)實(shí)際分離需要。色譜分離為肽分離和制備提供了良好的技術(shù)支持，常用的色譜技術(shù)有：離子交換色譜、分子排阻色譜和反相高效液相色譜。目前，對(duì)色譜技術(shù)在肽分離中的應(yīng)用進(jìn)行綜合和系統(tǒng)的評(píng)述較少。本文將闡述3種色譜技術(shù)的原理及其在肽分離中的應(yīng)用，為肽分離工作提供合理的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持，以進(jìn)一步擴(kuò)大肽在食品、醫(yī)療和化妝品中的應(yīng)用。

1 肽的簡(jiǎn)述

肽是一類介于氨基酸和大分子蛋白質(zhì)之間的線性聚合體。因其具有分子質(zhì)量低、易于吸收、生物活性高和免疫原性低等特性，逐漸成為食品[1-2]、醫(yī)藥治療[3-4]、美容[5-6]和化妝品[7-8]領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象。肽的生物活性和功能取決于它們的氨基酸組成、序列和分子質(zhì)量[9]。人體內(nèi)的多種自然生理活動(dòng)都與特定肽的相互作用產(chǎn)生的信號(hào)傳遞和調(diào)節(jié)有關(guān)[10]。一般而言，按照氨基酸的組成和數(shù)量的不同，分為2～10個(gè)氨基酸的寡肽、10～50個(gè)氨基酸的多肽和50個(gè)以上氨基酸組成的蛋白質(zhì)。功能肽的分子質(zhì)量普遍在300～1 200 Da，以平均每個(gè)氨基酸120 Da的分子質(zhì)量計(jì)算，相當(dāng)于肽數(shù)目在3～10個(gè)。當(dāng)肽的分子質(zhì)量小于10 000 Da，易于滲透組織，被人體吸收的效果較好[11]。與此同時(shí)，在市場(chǎng)銷售的化妝品用肽原料同樣也是普遍在十肽及以下，如六肽-1、五肽-3和三肽-2等。

肽具有獨(dú)特的帶電性、親疏水性、不同的分子質(zhì)量，以及可形成不同構(gòu)型的特點(diǎn)[12]，為色譜對(duì)其進(jìn)行分離分析提供了理論基礎(chǔ)。例如，肽根據(jù)本身含有的某些氨基酸特定結(jié)構(gòu)如苯環(huán)結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生一定的光學(xué)性質(zhì)(紫外吸收和熒光吸收)，如α-氨基酸可以發(fā)生茚三酮反應(yīng)、Sanger反應(yīng)和Edman降解等，如酰胺鍵可以發(fā)生雙縮脲。根據(jù)R基的電荷性和極性，多肽可以表現(xiàn)出酸性、堿性和中性，強(qiáng)水溶性和弱水溶性等。

常見(jiàn)肽以獲取來(lái)源可以分為天然提取肽、生物合成和人工化學(xué)合成肽[13]。其中，天然提取肽，通常是從海洋、可食用植物中提取，動(dòng)物提取較少。其受到提取材料的地理和環(huán)境的影響，操作工藝較為復(fù)雜，產(chǎn)量較低，成本高。生物合成肽，適合制備大于50個(gè)氨基酸組成的目的多肽，較易獲得，且隨基因重組技術(shù)發(fā)展，推動(dòng)了該技術(shù)的快速發(fā)展。人工合成肽，主要是通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)制備多肽，產(chǎn)量高且成本低[11]，但由于合成過(guò)程副產(chǎn)物多，且環(huán)境不友好，因而受到限制。

2015年多肽類藥物在全球銷售額達(dá)到220億美元，目前約有80種肽類藥物被批準(zhǔn)銷售上市，處于開(kāi)發(fā)研究和臨床試驗(yàn)階段的還有上百種。據(jù)透明度市場(chǎng)研究(Transparency Market Research)調(diào)查報(bào)告《Protein Hydrolysates Market》顯示，肽作為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的重要功能性成分之一，越來(lái)越多地被用于食品、臨床營(yíng)養(yǎng)、化妝品和個(gè)人護(hù)理等領(lǐng)域[14]。據(jù)全球領(lǐng)先數(shù)據(jù)提供機(jī)構(gòu)市場(chǎng)觀察(MarketWatch)報(bào)道，2021年口服肽復(fù)合年增長(zhǎng)率為6.6%，到2026年預(yù)計(jì)將達(dá)到11.394億美元[15]。肽具有食品營(yíng)養(yǎng)和呈味、疾病治療、美容抗衰老等功能，在食品、醫(yī)療和美容化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在食品領(lǐng)域，來(lái)自天然生物質(zhì)資源的蛋白質(zhì)水解物和肽可根據(jù)其生物活性被用作功能性食品，例如一些從海洋提取的具有抗氧化作用生物活性肽，從植物獲得的抗菌肽等，抗菌肽AMPs在食品保存中能起到抑菌作用達(dá)到抑制脂質(zhì)氧化[16]。在醫(yī)療方面，肽療法在醫(yī)療實(shí)踐中發(fā)揮了顯著的作用，宿主防御肽(host defense peptide,HDP)表現(xiàn)出廣泛的抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性[17]，ACE-抑制肽具有抗血壓、降血脂的功能[18]。另外，有些肽經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁作用[19]。在美容化妝品領(lǐng)域，肽不僅可以治療面部老化，還可以治療痤瘡和改善皮膚的先天免疫系統(tǒng)，以及緊致皮膚和淡化色斑[10]。因此，隨著肽的種類和數(shù)量需求的快速增加，對(duì)于肽的分離技術(shù)提出了更高的要求。

2 色譜技術(shù)原理及其應(yīng)用

2.1 離子交換色譜

2.1.1 離子交換色譜的原理及其特點(diǎn)

離子交換色譜(ion exchange chromatography，IEC)是分離帶電肽的一類重要的色譜技術(shù)。在一定pH下，待分離的肽和流動(dòng)相，與固定相上的離子交換劑基團(tuán)進(jìn)行可逆的相互作用，因作用力強(qiáng)弱不同與離子交換劑基團(tuán)相互競(jìng)爭(zhēng)吸附。陰離子交換劑優(yōu)先對(duì)作用力強(qiáng)的負(fù)電荷含量高的肽進(jìn)行靜電吸附，而含正電荷的肽被洗脫下來(lái)[20]，最后通過(guò)高鹽濃度梯度或pH梯度洗脫液將待分離肽洗脫下來(lái)從而達(dá)到分離目的。洗脫過(guò)程中，與離子交換劑結(jié)合作用弱的先被洗脫下來(lái)，而結(jié)合作用強(qiáng)的被后洗脫下來(lái)[21](圖1)。

圖1 離子交換色譜原理Fig.1 Principle of ion exchange chromatography

“離子電荷性質(zhì)”是離子交換色譜分離肽溶液的核心。有學(xué)者指出離子交換色譜在親水性化合物的分析和純化中發(fā)揮了重要作用[22]。肽溶質(zhì)與離子交換劑的交換結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和等電點(diǎn)呈現(xiàn)的離子狀態(tài)，例如環(huán)境pH高于等電點(diǎn)時(shí)，肽帶負(fù)電荷與陰離子交換劑結(jié)合，相反則與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合。HENNEMAN等[23]在探究分離多肽及其混合物中指出根據(jù)肽或蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)在已知pH的電荷下可以采用離子交換色譜進(jìn)行分離。同時(shí)，環(huán)境pH與等電點(diǎn)的差值越大，肽與離子交換劑的結(jié)合力越強(qiáng)。被分離的肽的電荷密度和等電點(diǎn)值與色譜柱上的離子交換劑的離子容量大小決定保留能力的強(qiáng)弱。離子交換色譜最為明顯的優(yōu)勢(shì)在于它的分離條件最接近生物的生理環(huán)境，利于溫和條件下的可逆洗脫操作且不易導(dǎo)致肽變性，對(duì)生物分子有一定的兼容性。但是，由于其定性能力較差，需要聯(lián)合其他多種分離技術(shù)進(jìn)行操作，而且該色譜較昂貴，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不太適合分離對(duì)pH和金屬離子敏感的生物分子。

2.1.2 離子交換色譜在肽分離中的應(yīng)用

離子交換色譜分離肽和小分子蛋白質(zhì)的應(yīng)用步驟主要包括：(1)根據(jù)預(yù)分離的肽性質(zhì)選擇適合的離子交換色譜；(2)肽溶液先在緩沖溶液預(yù)平衡；(3)以含有不同濃度NaCl的緩沖溶液以特定流速和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行洗脫。

如表1所示，瓊脂糖凝膠和纖維素是最為常見(jiàn)的2種載體。一般陰離子鍵合固定相基團(tuán)有二乙胺基乙基(diethyllaminoethyl，DEAE)和三甲胺基烷基季銨基(trimethylamino alkyl quaternary ammonium group，Q)等，陽(yáng)離子鍵合固定相基團(tuán)有磺丙基(sulfopropyl，SP)和羧甲基(carboxymethyl，CM)等。它們可以被鍵合于交聯(lián)葡聚糖(sephadex)、纖維素(cellulose)等一些載體上。例如， DEAE鍵合于高流速瓊脂糖凝膠能夠形成一種弱堿性環(huán)境的陰離子交換介質(zhì)，即陰離子交換色譜。有學(xué)者在研究芳族基團(tuán)與多峰和常規(guī)離子交換樹(shù)脂的相互作用機(jī)理中，指出芳香族部分可與多峰和常規(guī)離子交換樹(shù)脂發(fā)生相互作用，陽(yáng)離子(例如Na+)有助于減弱芳香族部分與配體的結(jié)合[21]。同時(shí)，由于液相色譜中存在的金屬離子對(duì)于具有負(fù)電荷的多肽在陰離子交換色譜中的影響，有學(xué)者利用螯合劑進(jìn)行處理[24]，結(jié)果分離效果得到了有效的改善。因此，采用離子交換色譜分離肽溶質(zhì)時(shí)需要考慮待分離溶液中是否有干擾離子及其濃度或含量。

表1 離子交換色譜柱在肽分離中的應(yīng)用Table 1 Application of ion exchange chromatography in the isolation of peptide

續(xù)表1

一般而言，采用離子交換色譜分離肽時(shí)，常需用到Tris-HCl、HAc-NaAc、PBS和二乙醇胺等緩沖溶液進(jìn)行預(yù)先平衡，緩沖液作用使得待分離的肽溶質(zhì)帶上一定的電荷并營(yíng)造pH環(huán)境，使其與離子交換劑可以充分地結(jié)合。

洗脫方式常見(jiàn)有3種：第一種是改變緩沖液pH，從而改變肽的吸附狀態(tài)為解吸附狀態(tài)。例如，在陽(yáng)離子交換色譜中，提高流動(dòng)相pH使吸附在柱子上的帶正電荷的肽帶負(fù)電，從而達(dá)到解吸附；第二種是增加緩沖液的離子強(qiáng)度，將吸附強(qiáng)的分子從離子交換劑上替換下來(lái)，例如梯度不斷增加的NaCl溶液；第三種即將前兩者相互結(jié)合從而達(dá)到洗脫目的。已報(bào)道的文獻(xiàn)中，常以NaCl進(jìn)行洗脫居多，濃度范圍在0～1.0 mol/L,流速一般控制在0.8～2.0 mL/min。需要注意的是，流速如果過(guò)快，電荷吸附作用差異不明顯的肽溶質(zhì)難以明顯分離；但是流速過(guò)慢會(huì)消耗時(shí)間，降低分離效率。

肽的檢測(cè)波長(zhǎng)一般多在214～280 nm，常見(jiàn)的有214、220和280 nm，前兩者是因?yàn)轷０锋I的吸收波長(zhǎng)與之接近，280 nm是用于檢測(cè)含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)氨基酸，如L-色氨酸(Trp, W)和L-酪氨酸(Tyr, Y)，這些氨基酸連接而成分子質(zhì)量較高的肽。在具體的分離過(guò)程中，可以先掃描待測(cè)液的最大吸收波長(zhǎng)，而后確定其檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于離子交換色譜分離的依據(jù)主要是不同肽段所帶電荷的不同，經(jīng)先后分離不同電性肽段從而篩選和獲取目標(biāo)肽段。以常見(jiàn)的有降壓作用的ACE-I抑制肽分離為例，大部分以DEAE作為陰離子固定相基團(tuán)。NOORANI等[25]從沿海廢棄的棘突猛蝦蛄殘肉中分離ACE-I抑制肽，分離過(guò)程中使用了DEAE 纖維素的離子交換色譜柱。將經(jīng)過(guò)凍干獲取的粗樣品溶解于醋酸鈉緩沖溶液，用1.0 mol/L NaCl為變化梯度以2.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，成功獲得了3 000 Da的AC肽段和3 000～10 000 Da的TH肽段，經(jīng)過(guò)后續(xù)的分離得到351 Da的MSN和388 Da的MTH兩個(gè)肽段。而從植物提取的ACE抑制肽中，ZHANG等[26]從醋泡黑豆蛋白水解產(chǎn)物中提取ACE抑制肽，使用了DEAE瓊脂糖凝膠的離子交換色譜柱，先用pH 8的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡后，用含0、0.05、0.1和0.2 mol/L NaCl的緩沖液以1.8 mL/min的流速逐步洗脫樣品，最終分離出了IILLSF、SIKFGSF和RSPEDSIIF等3個(gè)肽段。CHEN等[27]從薏苡仁中也采用該類離子交換色譜柱，先用pH 8.8的二乙醇胺緩沖液平衡薏苡仁醇溶蛋白后，用0～0.5 mol/L的NaCl以2.0 mL/min流速進(jìn)行洗脫，獲得分子質(zhì)量小于3 kDa的肽段。

2.2 分子排阻色譜

2.2.1 分子排阻色譜的原理及其特點(diǎn)

分子排阻色譜(size exclusion chromatography，SEC)，亦稱之為凝膠過(guò)濾層析，是一類分離不同分子質(zhì)量肽的重要色譜技術(shù)，其分離原理類似于過(guò)濾，是基于具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒發(fā)揮分子篩作用，在流動(dòng)相的帶動(dòng)下篩選并過(guò)濾出分子質(zhì)量不同的肽，分子質(zhì)量越小的肽越能夠進(jìn)入凝膠的內(nèi)部孔徑中而導(dǎo)致留出時(shí)間越慢，而無(wú)法進(jìn)入凝膠顆粒的大分子則可直接穿過(guò)凝膠顆粒的顆粒間隙流出(圖2)。

圖2 體積排阻色譜原理Fig.2 Principle of size exclusion chromatography

與離子交換色譜不同的是，分子排阻色譜中待分離的肽不會(huì)跟色譜基質(zhì)發(fā)生作用，適合分離對(duì)pH和金屬離子敏感的生物分子，具有高選擇性和高分辨率[6]。不足之處在于樣品的檢測(cè)收集消耗時(shí)間，分辨率會(huì)受到凝膠孔徑和粒徑的大小和均勻度的影響。

2.2.2 分子排阻色譜在肽分離中的應(yīng)用

分子排阻色譜在肽的初步分離中發(fā)揮了重要作用。文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)是分離肽最常見(jiàn)的分子排阻色譜填料，最為普遍使用的是Sephadex G-15 和 Sephadex G-25，分離的肽分子質(zhì)量普遍在200～1 300 Da。在G-X中，X代表交聯(lián)葡聚糖凝膠吸水值的10倍。即G-15為每克交聯(lián)葡聚糖凝膠膨脹時(shí)能吸取1.5 g水，因此數(shù)值越大，其吸水膨脹越明顯，分子交聯(lián)程度越復(fù)雜，孔徑越小，小分子肽越難以透過(guò)。分子排阻色譜的色譜柱長(zhǎng)度、流動(dòng)相和流速與離子交換色譜柱不一樣。其中，分子排阻色譜的色譜柱長(zhǎng)度一般是離子交換色譜柱的5～10倍。為了使得交聯(lián)葡聚糖凝膠可以充分分離肽溶質(zhì)，一般的流速控制在0.2～1.0 mL/min。同時(shí)，分離過(guò)程不需要和離子交換色譜柱一樣附帶高濃度離子進(jìn)行洗脫，一般采用含有少量可以溶解肽的鹽酸的超純水或者緩沖溶液。分子排阻色譜在肽分離中的應(yīng)用具體實(shí)例見(jiàn)表2。

表2 分子排阻色譜在肽分離中的應(yīng)用Table 2 Application of size exclusion chromatography in the isolation of peptide

一般而言，使用分子排阻色譜洗脫肽的步驟主要包括：填料溶脹、裝柱排氣、上樣、洗脫和收集餾分。先將交聯(lián)葡聚糖凝膠干粉在超純水或緩沖溶液中浸泡4～5 h使其充分溶脹，多次洗滌和除氣。分子排阻色譜柱使用前需要洗滌干凈，垂直地固定在鐵架臺(tái)上。先將超純水或緩沖溶液加入分子排阻色譜柱，適當(dāng)調(diào)節(jié)恒流泵的流速將柱內(nèi)的氣泡排除。將超純水或緩沖溶液液面降低至距離下端出水口1.0～2.0 cm時(shí)關(guān)閉恒流泵。將溶脹好混勻的交聯(lián)葡聚糖凝膠緩慢加入分子排阻色譜柱，待其自然沉降后，再加入超純水或緩沖溶液洗脫平衡1～2個(gè)柱床體積，直到緊密和均勻的凝膠色譜柱形成。接著，緩慢地加入不超過(guò)柱床體積10%的肽溶液，開(kāi)啟恒流泵，待其洗脫至液面與凝膠色譜柱頂端液面齊平時(shí)，關(guān)閉恒流泵再加入緩沖溶液，再開(kāi)啟恒流泵繼續(xù)洗脫。在洗脫過(guò)程中，收集餾分。

由于分子排阻色譜主要以分子質(zhì)量大小作為分離依據(jù)，因此肽的離子性和極性對(duì)其分離過(guò)程影響不大。以樹(shù)桑葉蛋白水解物為例，分子排阻色譜柱的柱長(zhǎng)選擇90 cm，流速控制在0.5 mL/min，抗氧化肽組分F5在Sephadex G-15色譜柱中經(jīng)去離子水洗脫后分離出69.74%的450～1 400 Da的肽段和22.56%的300～450 Da小分子肽段[32]。而同樣采用Sephadex G-15色譜柱分離苦蕎麥水解物肽分子的流速控制在0.8 mL/min，當(dāng)其收集體積在20～30 mL時(shí)，·OH清除率最高的肽片段的分子質(zhì)量在550～750 Da[34]。這兩者都是植物提取的抗氧化肽，在Sephadex G-15色譜柱中均分離出了分子質(zhì)量在500～800 Da的肽段。而利用Sephadex G-10色譜柱分離由離子交換色譜初分離獲得的薏苡仁抗高血壓肽餾分C，結(jié)果顯示該組分雖然分離出了C1和C2兩個(gè)主要餾分[27]，但其分離度并不明顯，雖然該文獻(xiàn)中并未顯示出具體的柱長(zhǎng)和流速，但是這種情況下可以嘗試增長(zhǎng)柱長(zhǎng)，減小流速以提高分離度。對(duì)于Sephadex G-25柱，牛-α乳白蛋白[35]和橙籽蛋白水解物[36]分離的降血糖肽段分子質(zhì)量在900～1 300 Da。這也進(jìn)一步應(yīng)證了分子排阻色譜填料吸水值及其膨脹交聯(lián)度跟分離的肽段分子質(zhì)量存在緊密聯(lián)系。一般而言，隨著G-X的X數(shù)值增大，分子交聯(lián)程度越緊密，小分子肽得以分離，大分子肽分離純度更高。

2.3 反相高效液相色譜

2.3.1 反相高效液相色譜的原理及其特點(diǎn)

反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強(qiáng)的溶劑為流動(dòng)相的一種液相色譜分離模式，基于樣品中不同組分和分離基質(zhì)疏水基團(tuán)間疏水作用的強(qiáng)弱不同而進(jìn)行分離，因具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于肽的分離[40]。其工作原理是色譜柱內(nèi)部填充的是表面經(jīng)過(guò)酸化處理含有烷基(或苯環(huán))的非極性微硅膠載體，流動(dòng)相先在微硅膠表面形成一層溶劑膜，隨著肽溶質(zhì)分子的進(jìn)入，肽的非極性基團(tuán)與烷基(或苯環(huán))作用而占據(jù)部分溶劑膜空間，而形成吸附的單分子吸附層。由于這種吸附是具有可逆性的，當(dāng)流動(dòng)相的極性發(fā)生變化時(shí)如非極性增強(qiáng)，肽溶質(zhì)分子會(huì)發(fā)生解吸附而被洗脫下來(lái)。因此，流動(dòng)相在由強(qiáng)極性流動(dòng)相變?yōu)榈蜆O性流動(dòng)相時(shí)，強(qiáng)到低極性肽溶質(zhì)分子會(huì)先后被洗脫下來(lái)(圖3)。

圖3 反相高效液相色譜原理Fig.3 Principle of reversed-phase high performance liquid chromatography

微硅膠表面經(jīng)烷烴C8和C18處理顯示出非極性，隨著碳鏈的增長(zhǎng)非極性增大其疏水性增強(qiáng)，肽溶質(zhì)的極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大，出峰時(shí)間越久[41]，因此色譜柱填料的選擇需要根據(jù)待分離的肽溶質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行衡量。反相色譜柱具有使用簡(jiǎn)便、高分辨性、高敏感性和分離時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，但是價(jià)格昂貴，洗脫劑通常為有機(jī)溶劑，容易污染環(huán)境。

2.3.2 反相色譜在肽分離中的應(yīng)用

在選取反相柱色譜進(jìn)行肽分離時(shí)，流動(dòng)相一般選擇超純水和乙腈，有時(shí)添加體積分?jǐn)?shù)為0.05%～0.1%二氟乙酸、三氟乙酸、螞酸或磷酸。這類酸一方面可以調(diào)節(jié)洗脫體系中溶液的酸堿度，同時(shí)還能作為離子對(duì)試劑與肽上的正電荷和極性基團(tuán)相互作用而減少極性保留問(wèn)題，增強(qiáng)分離效果，進(jìn)而改善出峰的峰型、峰寬和拖尾等問(wèn)題。流速通?？刂圃?.2～1.0 mL/min，而洗脫方式一般采用梯度洗脫而不是等度洗脫，這主要是因?yàn)樵摲绞讲粌H可以縮短分析周期，提高分離能力，還可以改善峰型，減少拖尾，提高靈敏度。柱溫一般控制在室溫至30 ℃。一般而言，色譜柱填料孔徑的選擇十分重要，主要根據(jù)分離肽的分子質(zhì)量來(lái)進(jìn)行選擇。肽的分子質(zhì)量一般在240～6 000 Da，而2～5 kDa分子質(zhì)量肽的孔徑范圍一般選擇130～300 ?(即13～30 nm)，而低于2 kDa一般選擇80～120 ?(即8～12 nm)。利用反相色譜分離肽的具體實(shí)例見(jiàn)表3。

表3 反相高效液相色譜柱在肽分離中的應(yīng)用Table 3 Application of reversed-phase high performance liquid chromatography in the isolation of peptide

肽分子分離前需進(jìn)行充分溶解，由于肽段同時(shí)含有疏水和親水氨基酸，采用單一水相溶解難以達(dá)到完全溶解的目的， 需要添加有機(jī)相進(jìn)行助溶如用含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的超純水和乙腈等體積的流動(dòng)相混合溶解樣品。如果樣品蛋白含量較高，溶解液會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)的絮凝現(xiàn)象，此時(shí)需要采用0.22 μm針頭濾膜過(guò)濾。

以沃特斯XSelect?Peptide CSH C18柱(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm, 130?)分析柱為例，該分析柱通常被用于分離純化3 kDa以下的肽段。由于其柱長(zhǎng)較短，相對(duì)于150～250 mm的分析柱的流速一般控制在1.0 mL/min，而該分析柱柱長(zhǎng)較小，流速一般設(shè)置為0.2 mL/min，進(jìn)樣量設(shè)置為2 μL。此外，肽分析柱還有美國(guó)aapptec的TR-AA010119 Spirit Peptide C18(4.6 mm×100 mm, 5 μm)，該柱子通常被用于分離合成多肽。以合成多肽為例子，當(dāng)分離的肽多且峰靠攏，可嘗試調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫梯度，以提高分離度。但是，如果應(yīng)用于制備型色譜柱，這將會(huì)消耗大量流動(dòng)相并增加成本。此時(shí)，可考慮將樣品進(jìn)行二次分離純化。

在大量分離多肽時(shí)，可以采用島津制備型LC-20AP高效液相色譜系統(tǒng)。Spirit peptide 120 C18(21.2 mm×250 mm, 10 μm)制備型色譜柱可以用于分離5 kDa以下的合成肽分子。此時(shí)，流速可以設(shè)置到10～30 mL/min，進(jìn)樣量可以達(dá)到10～20 mL，同時(shí)通過(guò)在HPLC系統(tǒng)中設(shè)置流動(dòng)相的洗脫斜率和水平高度可以實(shí)現(xiàn)不同肽餾分的自動(dòng)收集。此外需要注意的是，采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，由于乙腈在190 nm存在較強(qiáng)的吸收，對(duì)于肽鍵214 nm的測(cè)定存在一定的干擾，可以嘗試更換為其他吸收波長(zhǎng)如220或254 nm，或者掃描214～280 nm的肽吸收峰確定較佳測(cè)定波長(zhǎng)。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

本文對(duì)離子交換色譜、分子排阻色譜和反相高效液相色譜等3種色譜技術(shù)在肽分離中的應(yīng)用，從技術(shù)原理及其特點(diǎn)、應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行了綜述?？傮w而言，對(duì)于預(yù)分離樣品肽的分析和鑒定，一般需要先對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理如采用酶進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物可以通過(guò)超濾對(duì)分子質(zhì)量不同的肽溶質(zhì)進(jìn)行截留分離，再采用色譜技術(shù)進(jìn)一步分離。根據(jù)分離肽的類型不同，通常先經(jīng)過(guò)離子交換色譜柱篩選出所需要的電性肽，或經(jīng)過(guò)分子排阻色譜的分子篩的作用選擇篩選不同分子質(zhì)量的多肽，或根據(jù)肽分子極性的不同利用反相HPLC進(jìn)一步分離。最后，再通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振等等進(jìn)一步確定肽的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。

伴隨儀器設(shè)計(jì)科學(xué)和人工智能的發(fā)展，色譜技術(shù)在肽的分離中的應(yīng)用會(huì)不斷朝“多位一體化”的步伐邁進(jìn)，實(shí)現(xiàn)多種方法相結(jié)合。例如，有學(xué)者同時(shí)富集糖肽和磷酸肽中運(yùn)用離子交換色譜和親水作用色譜，并對(duì)2種色譜技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和調(diào)整[45]。這不僅可以縮短操作程序?qū)崿F(xiàn)一體化，而且極大地提高科研工作的效率。因此，這不僅為儀器設(shè)計(jì)者提供了設(shè)計(jì)靈感，也提出了更高的設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)，需要對(duì)設(shè)備不斷地改善和優(yōu)化其單一的技術(shù)效果，如靈敏快速的檢測(cè)分析系統(tǒng)和定性定量分析能力以跟進(jìn)實(shí)際科研和生產(chǎn)需求。此外，其他有關(guān)的肽分離色譜技術(shù)也在不斷發(fā)展起來(lái)，如固相金屬親和色譜分離具有配體專一化的肽，超臨界流體色譜[46]篩選和分離發(fā)揮藥理作用的肽，用毛細(xì)管電色譜[47]定性和定量分析肽，以及一些環(huán)境友好的技術(shù)如高靜水壓力和脈沖電場(chǎng)[48]等。還有利用人工智能深度學(xué)習(xí)開(kāi)發(fā)輔助肽數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和匹配任務(wù)，大大提高了肽段鑒定的靈敏度和可靠性[49]。色譜技術(shù)及其副產(chǎn)品的發(fā)展未來(lái)會(huì)帶動(dòng)肽分離取得更大進(jìn)展，從而提高肽在食品、醫(yī)療和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用，更好地滿足于市場(chǎng)需求。