磷酸甜菜堿對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉發(fā)酵產(chǎn)聚蘋(píng)果酸的影響

楊東霖，李佳謙，魯亮，王舸楠，王紀(jì)，趙廷彬，殷海松，喬長(zhǎng)晟,,4,5*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津慧智百川生物工程有限公司，天津，300457)3(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津，300457)4(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)5(天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

聚蘋(píng)果酸(polymaleic acid，PMLA)是一種以蘋(píng)果酸為唯一單體的高分子聚合物，主要有α、β、γ三種構(gòu)型，微生物體內(nèi)只合成β-PMLA這一種構(gòu)型[1]。β構(gòu)型的PMLA主鏈上含有大量的酯鍵[2]，在水中可自發(fā)降解或經(jīng)催化后降解，使其有可取代塑料的可能性[3-4]，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)效益與環(huán)境價(jià)值。并因其具有較多游離的羧基，故可直接接入或經(jīng)化學(xué)修飾后連接化合物基團(tuán)、特異性蛋白、靶向分子或特定藥物等多種功能性生物活性分子[5]，形成許多具有特殊功能的衍生物[6]，其可作為藥物載體材料與生物材料[7]，具有非?？捎^的發(fā)展前景與應(yīng)用范圍。

目前多采用出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)作為生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵[8-9]，對(duì)于產(chǎn)黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)發(fā)酵PMLA的研究較少。由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的PMLA產(chǎn)量低，仍未達(dá)到理想的工業(yè)化水平，且生產(chǎn)過(guò)程較為復(fù)雜[10]，使用的發(fā)酵原料多為有機(jī)氮源或硝酸鹽類(lèi)物質(zhì)[11]，成本較高或在放大工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)有安全風(fēng)險(xiǎn)。甜菜堿作為一種發(fā)酵助劑在工業(yè)微生物發(fā)酵領(lǐng)域已有較多的應(yīng)用，其可參與甲基代謝反應(yīng)，也可被分解為其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)參與到細(xì)胞代謝中[12-13]；XU等[14]發(fā)現(xiàn)外源添加甜菜堿可有效提高賴(lài)氨酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶活力；LI等[15]在生產(chǎn)維生素B12的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可極大刺激維生素B12的合成，并在120 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了驗(yàn)證。ZOU等[16]在使用乳桿菌發(fā)酵乳酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用甜菜堿可替代原培養(yǎng)基中的吐溫80，乳酸產(chǎn)量大幅提高，產(chǎn)率可達(dá)到95.5%，且乳酸脫氫酶的活性得到提升。磷酸甜菜堿是甜菜堿的磷酸鹽，目前還未見(jiàn)應(yīng)用在PMLA發(fā)酵領(lǐng)域，其價(jià)格便宜且添加量也較低，可以極大降低生產(chǎn)成本。本研究從添加量與發(fā)酵工藝條件出發(fā)，驗(yàn)證磷酸甜菜堿對(duì)PMLA發(fā)酵是否有促進(jìn)作用，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶活力變化，探究甜菜堿在發(fā)酵中的作用機(jī)制，為PMLA的發(fā)酵提供可行的工藝方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

BCSW-001產(chǎn)黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)CGMCC 18996，天津北洋百川生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)、Shim-pack GIST C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本Shimadzu公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；GRJB-5D多聯(lián)發(fā)酵控制系統(tǒng)，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；ZQZY-78BV振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；GZX-9030MBE鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-16G高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇金怡儀器科技有限公司；BS124S分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基PDA(g/L)：新鮮土豆200，葡萄糖20，瓊脂粉20，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖60 (單獨(dú)滅菌)，酵母浸粉3，丁二酸2，(NH4)2SO41，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO40.1，ZnSO40.05，玉米漿1 mL/L，溶劑為水，121 ℃滅菌20 min[17]。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖200(單獨(dú)滅菌)，(NH4)2SO44，KH2PO40.1，MgSO40.3，K2SO40.5，MnSO40.05，CaCO325，溶劑為水，121 ℃滅菌20 min。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

將保存于4 ℃的菌體斜面取出置于25 ℃恒溫箱中活化2 h，在無(wú)菌操作下用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA斜面上，放于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5 d。

1.2.2 搖床培養(yǎng)

在無(wú)菌環(huán)境下，用適量無(wú)菌生理鹽水將活化好的斜面菌株的孢子洗下來(lái)形成孢子菌懸液，接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為25 ℃、200 r/min，培養(yǎng)40 h后，將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)。恒溫?fù)u床培養(yǎng)條件為25 ℃、200 r/min，發(fā)酵144 h。

1.2.3 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

接種口在火焰保護(hù)下，按照10%的接種量，將300 mL混合均勻的種子液接種到5 L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，罐內(nèi)初始裝液量為3 L，轉(zhuǎn)速400～500 r/min，通風(fēng)量5～8 L/min，25 ℃恒溫發(fā)酵144 h。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體量測(cè)定方法

取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，滴加6 mol/L的稀鹽酸，中和發(fā)酵液中剩余的CaCO3，直到不再有氣泡產(chǎn)生為止，混合均勻后的液體5 000 r/min離心15 min，倒掉上清液。用10 mL生理鹽水重懸菌體，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，將離心管置于80 ℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)量菌體干重(g/L)[18]。

1.3.2 殘?zhí)菧y(cè)定方法

采用生物傳感儀直接測(cè)定法，取發(fā)酵液10 mL，15 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，然后用蒸餾水稀釋100倍，用生物傳感儀測(cè)定樣品中葡萄糖的含量，記為G1。取上清液2 mL，向上清液中添加200 μL 6 mol/L的鹽酸，65 ℃恒溫水浴10 min，水冷至室溫，將溶液定容到4 mL，混勻后從中吸取1 mL稀釋50倍，為保證pH處于中性范圍，可以用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值(約35 μL)，測(cè)得的葡萄糖含量標(biāo)記為G2。發(fā)酵液中蔗糖的含量按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：S，發(fā)酵液中剩余的蔗糖含量，g/L；G1，酸水解前發(fā)酵上清液中葡萄糖的含量，g/L；G2，酸水解后發(fā)酵上清液中葡萄糖的含量，g/L。

1.3.3 PMLA測(cè)定方法

取5 mL發(fā)酵液于15 000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取2 mL上清液于水解反應(yīng)釜中，同時(shí)加入等體積的2 mol/L H2SO4溶液，110 ℃水解11 h，將PMLA完全水解為單體蘋(píng)果酸。HPLC檢測(cè)水解前后的蘋(píng)果酸的含量，兩者之差即為PMLA產(chǎn)量。

HPLC的檢測(cè)條件：色譜柱Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相V(25 mmol/L KH2PO4溶液)∶V(乙腈)=95∶5(用6 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)；進(jìn)樣量5 μL；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm[19]。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 RNA提取及樣本檢測(cè)

在搖床上從500 mL搖瓶(裝液量100 mL)中取發(fā)酵液于5 mL離心管中，5 000 r/min離心30 s，去除未被利用的CaCO3；將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，10 000 r/min離心2 min，收集菌體；菌體沉淀用PBS重懸，10 000 r/min離心2 min，重復(fù)上述操作2次。將菌體進(jìn)行液氮研磨后，使用Trizol試劑盒從產(chǎn)黑色素短梗霉細(xì)胞中提取總RNA。分析RNA的純度和完整性，再用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(以O(shè)D260/OD280表示)，然后用Qubit 2.0對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，最后用Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性[20]。

1.4.2 文庫(kù)的構(gòu)建與檢測(cè)

RNA樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入裂解液將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，插入片段符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw data)的末端數(shù)據(jù)進(jìn)行裁剪和質(zhì)量控制，得到clean reads。根據(jù)Trinity-2.11.0指南，首先使用RSEM軟件將clean reads比對(duì)到實(shí)驗(yàn)室先前組裝的參考轉(zhuǎn)錄本上，使用DESeq2軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的Raw counts進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，篩選獲得不同樣本之間的差異表達(dá)基因。并將注釋差異表達(dá)基因的GO號(hào)進(jìn)行富集，從而得到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中分子功能(Gene Ontology)、生物過(guò)程和細(xì)胞組分的富集結(jié)果。根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步分析基因產(chǎn)物的功能及在細(xì)胞中的代謝途徑。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次的平均值，并用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸甜菜堿添加濃度對(duì)菌體量與PMLA產(chǎn)量的影響

按1.2.2的方法進(jìn)行搖床實(shí)驗(yàn)，向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基加入磷酸甜菜堿，添加質(zhì)量濃度設(shè)置為0.1～1.7 g/L，遞增質(zhì)量濃度為0.2 g/L，空白組為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，不添加磷酸甜菜堿。如圖1-a所示，隨著磷酸甜菜堿的加入，菌體量不斷增加，當(dāng)添加量為1.3 g/L時(shí)，菌體量達(dá)到最大25.0 g/L，空白組菌體量為7.75 g/L。磷酸甜菜堿添加濃度繼續(xù)增大，菌體量出現(xiàn)下降，菌體生長(zhǎng)受到抑制。如圖1-b所示PMLA產(chǎn)量隨著磷酸甜菜堿添加量的提高基本呈上升趨勢(shì)，當(dāng)添加量為0.9 g/L時(shí)，PMLA產(chǎn)量達(dá)到最大47.9 g/L，空白組產(chǎn)量為10.37 g/L。但當(dāng)磷酸甜菜堿繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)量開(kāi)始下降，說(shuō)明磷酸甜菜堿添加過(guò)多時(shí)，菌體可能主要將能量用于生長(zhǎng)作用，而沒(méi)有用于產(chǎn)酸。由圖1-c可知，當(dāng)磷酸甜菜堿添加量為0.9 g/L時(shí)，菌體的單位產(chǎn)酸率最高，且此時(shí)產(chǎn)量最高，故選擇此添加量進(jìn)行后續(xù)研究。

a-菌體量；b-PMLA產(chǎn)量；c-單位菌體產(chǎn)酸率圖1 磷酸甜菜堿添加濃度對(duì)菌體量、PMLA產(chǎn)量和單位菌體產(chǎn)酸率的影響Fig.1 Effect of betaine phosphate concentration on biomass,PMLA and yield

2.2 5 L發(fā)酵罐工藝條件優(yōu)化

2.2.1 不同通風(fēng)量對(duì)于菌體發(fā)酵的影響

PMLA的發(fā)酵為好氧發(fā)酵過(guò)程，不同的溶氧條件會(huì)導(dǎo)致菌株的代謝產(chǎn)物不同[21]。為探究在添加磷酸甜菜堿后PMLA發(fā)酵的最適溶氧條件，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為空白組，添加0.9 g/L磷酸甜菜堿為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先探究通風(fēng)對(duì)于發(fā)酵的影響，固定轉(zhuǎn)速400 r/min，調(diào)整通風(fēng)量為5、6.5、8 L/min,按1.2.3的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，前40 h實(shí)驗(yàn)組菌體積累較少，40～60 h菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)較快，中后期菌體生長(zhǎng)較慢，5 L/min的條件下實(shí)驗(yàn)組菌體生長(zhǎng)的速度最快，實(shí)驗(yàn)組菌體量最后可達(dá)到39.5 g/L?？瞻捉M菌體生長(zhǎng)均較為緩慢，在144 h時(shí)5 L/min條件下菌體量積累最多，為15.7 g/L。

圖2 不同通風(fēng)量對(duì)菌體量的影響Fig.2 Effect of different ventilation rates on biomass

通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖3所示，前40 h實(shí)驗(yàn)組PMLA產(chǎn)量較低，40 h后隨著菌體量的增加，產(chǎn)量增長(zhǎng)較快。80 h后通風(fēng)條件為5 L/min與6.5 L/min的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量增長(zhǎng)開(kāi)始減慢，8 L/min的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量積累一直較快,發(fā)酵到144 h可達(dá)到45.62 g/L。前24 h，3個(gè)通風(fēng)條件下空白組都沒(méi)有PMLA的積累，可能與前期空白組的菌體量過(guò)低有關(guān)，36 h后空白組的PMLA開(kāi)始合成，但合成量均較少，發(fā)酵到144 h時(shí)，8 L/min通風(fēng)條件下的空白組產(chǎn)量最高，為16.43 g/L。

圖3 不同通風(fēng)量對(duì)PMLA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different ventilation rates on PMLA yield

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相同通風(fēng)與轉(zhuǎn)速條件下實(shí)驗(yàn)組的菌體量與產(chǎn)量均高于空白組，說(shuō)明磷酸甜菜堿的加入有利于菌體的生長(zhǎng)，可提高PMLA的產(chǎn)量。3個(gè)通風(fēng)條件對(duì)比發(fā)現(xiàn)8 L/min通風(fēng)條件下，PMLA產(chǎn)量最高，5 L/min與6.5 L/min PMLA可能無(wú)法滿足菌體的耗氧需求，部分菌體轉(zhuǎn)為無(wú)氧呼吸，而消耗同樣濃度的碳源，無(wú)氧呼吸提供的能量較少，為了維持生長(zhǎng)提供足夠的能量與ATP，導(dǎo)致耗糖加快，副產(chǎn)物較多。雖然實(shí)驗(yàn)組均未出現(xiàn)拐點(diǎn)，但通風(fēng)量8 L/min已經(jīng)較大，繼續(xù)增大通風(fēng)量放大生產(chǎn)時(shí)對(duì)于工藝設(shè)備要求較高，所以確定8 L/min為最適通風(fēng)量。發(fā)酵144 h時(shí)，不同通風(fēng)條件下，空白組與實(shí)驗(yàn)組的菌體量與產(chǎn)量如表1所示。

表1 不同通風(fēng)量對(duì)PMLA發(fā)酵的影響Table 1 Effects of different ventilation on PMLA fermentation

2.2.2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)于菌體發(fā)酵的影響

由2.2.1確定8 L/min的通風(fēng)條件，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為空白組，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基添加0.9 g/L磷酸甜菜堿為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置轉(zhuǎn)速為400、450、500 r/min。如圖4所示，在400、450 r/min條件下，實(shí)驗(yàn)組菌體前期生長(zhǎng)較慢，40 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量積累較快。在轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)，實(shí)驗(yàn)組菌體生長(zhǎng)非常活躍，延滯期較短，發(fā)酵液在72 h后開(kāi)始發(fā)黑，可能是某些副產(chǎn)物代謝途徑加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組在500 L/min條件下菌體量最高，發(fā)酵144 h可達(dá)到43.50 g/L。3個(gè)轉(zhuǎn)速條件下，空白組的菌體活力均比實(shí)驗(yàn)組低，生長(zhǎng)較慢，空白組在500 r/min的轉(zhuǎn)速條件下菌體量最高，144 h為16.8 g/L。

圖4 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌體量的影響Fig.4 Effect of different rotating speeds on biomass

如圖5所示 40 h實(shí)驗(yàn)組與空白組產(chǎn)量均較低，可能由于此時(shí)菌體量少，導(dǎo)致PMLA積累較少，40 h以后實(shí)驗(yàn)組菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，產(chǎn)量增長(zhǎng)較快，96 h以后500 r/min的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量增長(zhǎng)較慢，而400、450 r/min的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量仍在繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)速為450 r/min的實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵144 h最后達(dá)到53.10 g/L。40 h左右空白組開(kāi)始有PMLA生成，但合成量較少，3個(gè)轉(zhuǎn)速條件中，450 r/min的空白組最終產(chǎn)量最高，產(chǎn)量為17.29 g/L。相同通風(fēng)轉(zhuǎn)速條件下，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)空白組的菌體量與產(chǎn)量均低于實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明磷酸甜菜堿的加入提高了菌體活力，可以促進(jìn)PMLA合成，提高了蔗糖利用率。3個(gè)轉(zhuǎn)速條件比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在450 r/min產(chǎn)量最高，故確定最適的發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速450 r/min，通風(fēng)量8 L/min。發(fā)酵144 h時(shí)，不同轉(zhuǎn)速條件下，空白組與實(shí)驗(yàn)組的菌體量與產(chǎn)量如表2所示。

圖5 不同轉(zhuǎn)速對(duì)PMLA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different rotating speeds on PMLA

表2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)PMLA發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different rotating speeds on PMLA fermentation

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析

2.3.1 差異表達(dá)基因篩選

60 h菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段，菌體生長(zhǎng)較為活躍，代謝旺盛，故選擇在60 h時(shí)，在搖床實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)空白組與實(shí)驗(yàn)組取樣測(cè)序，空白組為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基添加0.9 g/L磷酸甜菜堿，測(cè)序結(jié)果已上傳到NCBI，將得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)處理后進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，對(duì)兩組的組間樣品與組內(nèi)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性和差異性分析，如圖6-a所示PCA評(píng)分為69.6%，處在50%～100%，證明模型擬合較好且可靠性較高。每組3個(gè)樣本聚集比較緊密，證明組內(nèi)樣本的重復(fù)性較好，各組間樣本分散較遠(yuǎn)，證明磷酸甜菜堿的加入確實(shí)使菌體在60 h基因的表達(dá)量出現(xiàn)差異。

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控與參考基因組比對(duì)并經(jīng)過(guò)DEseq2差異表達(dá)分析后可得出有1 984個(gè)基因表達(dá)有差異(圖6-c)，其中221個(gè)基因表達(dá)量顯著提高，46個(gè)基因表達(dá)量顯著下降(圖6-b)。

a-實(shí)驗(yàn)組與空白組的PCA得分圖；b-基因表達(dá)差異量火山圖；c-基因表達(dá)差異量熱圖圖6 空白組與實(shí)驗(yàn)組差異表達(dá)基因分析圖Fig.6 Analysis of differentially expressed genes between control and experimental group

2.3.2 GO富集分析

將獲得的221個(gè)表達(dá)量較高的基因通過(guò)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行GO富集分析，GO數(shù)據(jù)庫(kù)主要將基因本體分為3類(lèi)：生物過(guò)程、細(xì)胞組成組分、分子功能。如圖7所示，其中富集到生物過(guò)程條目中的差異表達(dá)量較高的基因主要參與ATP能量代謝、丙酮酸代謝與糖酵解過(guò)程，富集到細(xì)胞組成組分中的差異表達(dá)量較高的基因主要與蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物的組成、胞質(zhì)小核糖體亞基的組成有關(guān)，富集到分子功能中的基因主要與有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、與羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性有關(guān)。富集結(jié)果表明磷酸甜菜堿的加入提高了菌體的能量代謝能力與有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力，對(duì)于PMLA的合成有影響。

圖7 表達(dá)量較高的基因GO富集分析圖Fig.7 GO annotation of genes with high expression

2.3.3 代謝通路分析

如圖8所示，將差異表達(dá)基因與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后可解析到差異表達(dá)基因在代謝通路上的影響，同時(shí)結(jié)合GO富集結(jié)果，可得到磷酸甜菜堿對(duì)于菌株在主要代謝通路上的影響。細(xì)胞外的葡萄糖無(wú)法被細(xì)胞直接吸收利用，因?yàn)槠咸烟菬o(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層，需要借助細(xì)胞膜上己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hexose transporter，KHT2)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的基因表達(dá)量調(diào)高，說(shuō)明相比于空白組，實(shí)驗(yàn)組菌體對(duì)葡萄糖的吸收能力增強(qiáng)，葡萄糖能更多且更迅速的進(jìn)入細(xì)胞。分析發(fā)現(xiàn)糖酵解過(guò)程中的己糖激酶(hexokinase，HXK)、6-磷酸果糖激酶(ATP-dependent 6-phosphofructokinase，PFKA)、果糖二磷酸醛縮酶(fructose-biphosphate aldolase，ALF)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TPIS)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，G3P)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceric kinase，PGK)、烯醇化酶(enolase，ENO)等酶的基因表達(dá)量提高，可以推測(cè)出糖酵解路徑中的相關(guān)酶的活性增強(qiáng)，細(xì)胞的能量代謝得到加強(qiáng)，生成的ATP與能量較空白組更多，所以菌體的生長(zhǎng)情況更好。實(shí)驗(yàn)組的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCKA)與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AATM)的基因表達(dá)量提升較高，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶可將磷酸烯醇式丙酮酸催化為草酰乙酸并同時(shí)吸收來(lái)自空氣中或呼吸作用產(chǎn)生的CO2[22]，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶將草酰乙酸催化生成天冬氨酸，天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)出線粒體外后再被還原為草酰乙酸，由兩者催化生成的草酰乙酸可被細(xì)胞質(zhì)中的蘋(píng)果酸脫氫酶還原成蘋(píng)果酸，隨后與來(lái)自線粒體的少量蘋(píng)果酸進(jìn)一步由非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)蛋白催化生成PMLA[23-24]，GO富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性提高，說(shuō)明相對(duì)于空白組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的PMLA可以被更快的運(yùn)出胞外，減小胞內(nèi)的濃度抑制，更有利于PMLA的合成。

圖8 磷酸甜菜堿對(duì)產(chǎn)黑色短梗霉基因表達(dá)量的影響Fig.8 Effect of betaine phosphate on gene expression of A.melanogenum注：其中紅色代表該基因表達(dá)量提高；基因表達(dá)量均做了歸一化處理,Betaine,實(shí)驗(yàn)組；Control,空白組；基因縮寫(xiě)如下KHT2,己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; HXK,己糖激酶; PFKA, 6-磷酸果糖激酶; ALF, 果糖二磷酸醛縮酶; TPIS, 磷酸丙糖異構(gòu)酶; G3P, 3-磷酸甘油醛脫氫酶; PGK, 磷酸甘油酸激酶; ENO, 烯醇化酶;PCKA, 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶; AATM, 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)磷酸甜菜堿的外源加入能夠促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，提高PMLA產(chǎn)量。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了磷酸甜菜堿的最適添加質(zhì)量濃度為0.9 g/L，并通過(guò)5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最適工藝條件，確定了最適的通風(fēng)量8 L/min與轉(zhuǎn)速450 r/min。在最適條件下實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵144 h產(chǎn)量為53.10 g/L，空白組產(chǎn)量為17.29 g/L，實(shí)驗(yàn)組菌體量與產(chǎn)量均高于空白組，結(jié)果表明磷酸甜菜堿的加入能夠提高產(chǎn)黑色素短梗霉的菌體活力與產(chǎn)酸能力，加快菌體生長(zhǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)磷酸甜菜堿使菌體對(duì)糖的吸收利用加強(qiáng)，并主要通過(guò)加強(qiáng)草酰乙酸的還原反應(yīng)提高PMLA的產(chǎn)量。本研究提供了一種成本低且安全的工業(yè)生產(chǎn)方案，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的酶活力變化，為后續(xù)菌株改造提供參考。