海洋桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體的制備及其在單葡萄糖甘油二酯催化合成中的應(yīng)用

張志平，趙雨哲，趙彩夢，楊旭，魏濤

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

甘油糖脂是糖與1, 2-二酰基-sn-甘油通過糖苷鍵連接而成的化合物，其單糖或寡糖附著在甘油主鏈的sn-3位置，主要存在于海藻[1-3]、藍細菌[4-6]及高等植物中。單葡萄糖甘油二酯(monoglucosyl diacylglycerol，MGlc-DAG)、1, 2-二?；?3-O-β-D-吡喃型半乳糖基-甘油(monogalactosyldiacylglycerol，MGDG)、1, 2-二?；?3-O-(α-D-吡喃型半乳糖基(1→6)-O-β-D吡喃型半乳糖基)-甘油(digalactosyldiacylglycerol，DGDG)和1, 2-二?；?3-O-(6-脫氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖基)-甘油(sulfoquinovosyldiacylglycerol，SQDG)是海洋藍藻和葉綠體中常見的4種甘油糖脂[7]。在其他細菌中也發(fā)現(xiàn)了多種甘油糖脂，在這些甘油糖脂中，糖供體(除了半乳糖和葡萄糖)主要以α-或β-異聚體的形式結(jié)合在(1→2)，(1→3)，(1→4)或(1→6)鏈中[8]。此外，從天然產(chǎn)物中鑒定出一些獨特類型的甘油糖脂，包括氨基甘油糖脂[9]、醚鍵甘油糖脂[10]和葡萄糖醛酸甘油脂[11]。甘油糖脂具有多種生物活性和藥理活性，如抗腫瘤[12-13]、抗氧化[14]、抗病毒[15]和抗炎[16]等，可廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)，已成為業(yè)界研究熱點。

常見的植物提取方法為Floch液-液萃取法，該方法使用有機溶劑氯仿/甲醇進行萃取[17]，操作步驟較為繁瑣，所提取的產(chǎn)物中甘油糖脂含量少、純度低、雜質(zhì)(中性脂、游離脂肪酸和磷脂等)多[18]?；瘜W(xué)合成法對反應(yīng)條件和分離設(shè)備要求高，副產(chǎn)物較多，目標(biāo)產(chǎn)品不易分離，產(chǎn)生的廢液污染性強。生物酶法制備甘油糖脂，具有反應(yīng)步驟較少，轉(zhuǎn)化率高、純度高等優(yōu)勢，有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。根據(jù)已有文獻報道和課題組前期研究，海洋桿菌Candidatuspelagibactersp.HTCC7211中的糖基轉(zhuǎn)移酶Agt具有催化合成不同甘油糖脂活性，其中以二磷酸尿苷-葡萄糖(uridine diphosphate gluscose,UDP-Glu)和甘油二酯為底物合成單葡萄糖甘油二酯的活性最高；生物信息學(xué)分析結(jié)果也表明保守絲氨酸Ser257與酶和底物結(jié)合活性有關(guān)[19-20]。因此本文嘗試構(gòu)建海洋桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體，獲得高活性突變體酶，進而研究以UDP-Glu和甘油二酯為底物合成單葡萄糖甘油二酯，以期為甘油糖脂合成新方法和工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

海洋桿菌Candidatuspelagibactersp.HTCC7211，感受態(tài)細胞EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL，克隆與表達載體pET15b和重組質(zhì)粒pET15b/Agt，均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

dNTP、ProbestTMDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeI及SalI，日本寶生物(大連)公司；DNA連接試劑盒kit ver.2.1、細菌基因組DNA提取試劑盒kit ver.3.0，TaKaRa公司；氨芐青霉素、氯霉素、咪唑、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris]、甘氨酸(電泳級)，美國BBI公司；蛋白Marker，美國Thermo Scientific公司；Ni-NTA 瓊脂糖，Qiagen公司；UDP-Glu、甘油二酯(diacylglycerol，DAG)、MGlc-DAG、MGDG，美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；J6-MI型超低溫離心機，美國Beckman公司；JY92-II DN型超聲波細胞粉粹機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JB-680B型全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；UV-2006型紫外可見分光光度計，上海儀器有限公司；德國默克硅膠板60，北京豐美天合科技有限公司；瑞士CAMAG自動TLC取樣器Ⅲ，上海艾研生物科技有限公司；TLC Scanner 4型CAMAG薄層色譜掃描儀，上海智巖科學(xué)儀器有限公司；CMax Plus型SpectraMax微孔讀板機，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；Agilent Technologies 1290 Infinity II UPLC型超高效液相色譜，美國Agilent公司；AB SCIEX Triple QuadTM 5500型質(zhì)譜儀，AB SCIEX公司；Nanodrop 2000型微量紫外分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建

前期利用生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬分析發(fā)現(xiàn)，C.pelagibactersp.HTCC7211糖基轉(zhuǎn)移酶Agt和其同源物中，氨基酸殘基Ser257為高度保守位點，可能與底物UDP-Glu和甘油二酯結(jié)合有關(guān)，本研究嘗試構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶Agt點突變體(T257A、T257I、T257S、T257D和T257K)[19-20]，具體方法如下：使用重疊延伸PCR法構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體質(zhì)粒，以pET15b/Agt重組質(zhì)粒為模版，設(shè)計上下游引物(表1)進行突變片段PCR，將突變基因片段重新克隆到pET15b載體中以獲得突變體重組質(zhì)粒。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：模板1 μL(25 ng)，dNTP (25 mmol/L)2 μL，引物(100 μmol/L)各1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，10×緩沖液 5 μL，ProbestTMDNA聚合酶 (5U/μL)1 μL，超純水37 μL。第一輪PCR反應(yīng)模板為質(zhì)粒pET15b/Agt，第二輪PCR反應(yīng)模板為第一輪PCR產(chǎn)物。具體PCR反應(yīng)條件為：第一輪：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)。第二輪：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)。

表1 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體構(gòu)建上下游引物Table 1 Synthetic oligonucleotide primers used for construction of glycosyltransferase Agt

1.2.2 野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt及其突變體基因的誘導(dǎo)表達和純化

將野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt基因質(zhì)粒與上述合成的突變體重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到E.coliBL21-codonPlus(DE3)-RIL中，取單菌落在已加入100 mg/L氨芐青霉素及34 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L)中培養(yǎng)，當(dāng)OD600達到0.4～0.6時，加入0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達，10 h后收集菌體，經(jīng)離心后超聲破碎，收集上清液，隨后采用鎳柱親和層析(洗脫緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，500 mmol/L NaCl, 300 mmol/L 咪唑, 1% Triton X-100)和Superdex-200(16/60)凝膠過濾柱(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，200 mmol/L NaCl；洗脫速度0.5 mL/min)進行純化，得到野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt以及重組突變體酶，使用SDS-PAGE法檢測純化后的目標(biāo)蛋白。

1.2.3 野生型Agt與突變體酶活性分析

以UDP-Glu和甘油二酯為底物，不含有酶的反應(yīng)體系作為空白對照組，野生型Agt與突變體酶作為實驗組進行酶活性分析。酶活力標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(1 mL)為：0.1 mmol/L UDP-Glu、0.1 mmol/L甘油二酯、2.0 μmol/L純化蛋白和50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)反應(yīng)緩存液[19-20]。將反應(yīng)體系于35 ℃恒溫下200 r/min恒定孵育20 h，采用Floch法以V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2提取反應(yīng)產(chǎn)物，并使用薄層層析TLC法分離反應(yīng)產(chǎn)物，隨后使用液質(zhì)聯(lián)用LC-MS方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物。酶活力單位的定義：一個酶活力單位為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘催化合成1 μmol的單葡萄糖甘油二酯所需的酶量。

1.2.4 反應(yīng)產(chǎn)物甘油糖脂的分離提取

采用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2和V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)分別為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6復(fù)提反應(yīng)產(chǎn)物。具體操作流程如下：取1 mL酶催化所得反應(yīng)產(chǎn)物，加入1 mLV(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2劇烈振蕩45 s后于3 000 r/min離心5 min，提取液分層后，糖脂溶于下層有機相中，收集下層有機相。將上層溶液加入V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)分別為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6溶液中重新提取，合并2次提取樣品，得到反應(yīng)產(chǎn)物。按公式(1)計算提取率：

(1)

1.2.5 薄層層析方法分析檢測反應(yīng)產(chǎn)物

使用CAMAG自動TLC取樣器III對提取的糖脂進行薄層層析(thin layer chromatography，TLC)分析。在硅膠板60上用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶35∶4進行分離，并用V(硫酸)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10進行染色，觀察合成的糖脂化合物。

1.2.6 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)方法分析檢測反應(yīng)產(chǎn)物

將TLC檢測后獲得的糖脂產(chǎn)物溶解于有機溶劑[V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(乙腈)=6∶3∶1]中，采用LC-MS檢測產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。使用BEH Amide XP色譜柱(內(nèi)徑2.5 μm，3 mm×150 mm，Waters，USA)進行色譜分離。LC-MS檢測流動相為溶劑A-乙腈，溶劑B-pH 9.2的10 mmol/L乙酸銨。進樣前先使用V(溶劑A)∶V(溶劑B)=95∶5平衡色譜柱10 min，15 min后，使用從V(溶劑A)∶V(溶劑B)=95∶5到V(溶劑A)∶V(溶劑B)=70∶30逐步梯度進行分離，恒定流速為150 μL/min。質(zhì)譜分析條件為：ESI正離子模式，離子噴霧電壓3 500 V，溫度350 ℃。霧化器氣體以及加熱器氣體40 psi。

1.2.7 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體酶最適反應(yīng)條件分析

1.2.7.1 最適酶濃度確定

以UDP-Glu和甘油二酯為底物，分別加入不同濃度的突變體酶進行反應(yīng)，測定單葡萄糖甘油二脂的產(chǎn)量。

1.2.7.2 最適底物濃度確定

在最適酶濃度作用下，分別加入不同濃度的UDP-Glu作為底物進行反應(yīng)，測定單葡萄糖甘油二脂的產(chǎn)量。

1.2.7.3 最適反應(yīng)溫度確定

在最適酶濃度和底物濃度條件下，以Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.5)為緩沖體系，將一定量的突變體酶與底物分別于10～50 ℃條件下反應(yīng)(溫度梯度為5 ℃)，在水浴振蕩24 h后，測定突變體酶的酶反應(yīng)活力。

1.2.7.4 最適反應(yīng)pH確定

使用50 mmol/L的不同pH(6.0～11.0)緩沖體系：磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.5)和3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸(CAPS，pH 9.5～11.0)，將一定量酶加入到上述不同pH緩沖液中反應(yīng)1 h，分別測定酶活力。

1.2.7.5 最適反應(yīng)條件下突變體酶催化合成單葡萄糖甘油二酯的反應(yīng)

在上述確定的突變體酶各項最適條件下進行催化反應(yīng)，測定催化產(chǎn)物單葡萄糖甘油二酯的產(chǎn)量，計算轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt及其突變體酶的表達

海洋桿菌C.pelagibactersp.HTCC7211糖基轉(zhuǎn)移酶Agt及其突變體酶(T257A、T257I、T257S、T257D和T257K)重組質(zhì)粒在E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL表達后，經(jīng)鎳柱親和層析和分子篩Superdex-200(16/60)凝膠過濾柱，獲得純化后的突變體酶，SDS-PAGE電泳分析表明，突變體酶的分子質(zhì)量約為38 kDa(圖1)。

M-蛋白Marker；1-全蛋白；2-上清蛋白；3-純化后的糖基轉(zhuǎn)移酶Agt；4-8-分別為純化后的突變體酶(T257A、T257I、T257S、T257D以及T257K)圖1 純化后的野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt及其突變體酶的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified glycosyltransferase Agt mutant enzymes and wild type control

2.2 野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt及其突變體酶動力學(xué)分析

kcat/Km值是衡量酶催化效率的重要參數(shù)，通過測定不同突變體的kcat/Km值，進而表征酶催化效率的變化情況。以UDP-Glu及甘油二酯為底物，對比分析野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt及其突變體酶的動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果如表2所示。突變體T257S的kcat/Km值為(111.9±1.9) L/(mmol·min),是野生型酶Agt(71.4±2.7) L/(mmol·min)的1.56倍，由此可知突變體T257S催化效率相對于野生型酶Agt顯著提高；其他突變體T257A、T257I、T257D和T257K催化合成單葡萄糖甘油二酯效率均有所降低。推測原因，突變體T257S突變的位點可能有效改變酶的活性中心微環(huán)境，與Thr相比，Ser缺少一個亞甲基，因此Ser殘基與底物之間可能會有更多的結(jié)合空間，利于Ser殘基與糖供體UDP-Glu間的相互作用[21-22]。上述結(jié)果表明，與野生型酶Agt相比，突變體T257S具有更高的催化活性和催化效率，因此，選用突變體T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯。

表2 野生型糖基轉(zhuǎn)移酶Agt與突變體酶動力學(xué)參數(shù)分析aTable 2 Kinetic parameters of purified glycosyltransferase Agt mutant enzymes and wild type controla

2.3 突變體酶T257S反應(yīng)產(chǎn)物提取方法的優(yōu)化結(jié)果

甘油糖脂常采用Floch液-液萃取法，選用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2為提取液，然而，該方法所提產(chǎn)物中含有一定量的中性脂、游離脂肪酸和磷脂等雜質(zhì)，往往需要進一步采用薄層色譜法/固相萃取/高效液相色譜法等來分離純化[17-18]。本文研究了傳統(tǒng)氯仿/甲醇法與不同體積比環(huán)己烷/乙酸乙酯重復(fù)提取的效果，各種方法對T257S反應(yīng)產(chǎn)物提取率的比較結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，單采用氯仿/甲醇法的提取率僅為42.2%，而通過環(huán)己烷/乙酸乙酯復(fù)提后的產(chǎn)物提取率均有所提高，特別是采用V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶4復(fù)提后，產(chǎn)物提取率可達84.7%。因此V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶4復(fù)提產(chǎn)物的得率約是單純采用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2法的2倍。

圖2 對比分析環(huán)己烷/乙酸乙酯和氯仿/甲醇方法提取反應(yīng)產(chǎn)物Fig.2 Comparative analysis of reaction products extracted by the methods cyclohexane/ethyl acetate and chloroform/methanol

2.4 TLC方法分離T257S反應(yīng)產(chǎn)物

TLC能夠分離、定性分析出多種新的糖脂。對有機萃取獲得的高純產(chǎn)物進行薄層色譜分析，結(jié)果如圖3所示，使用V(硫酸)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10染色后，對照標(biāo)準(zhǔn)品可知，實驗組均為單條帶，反應(yīng)產(chǎn)物為單葡萄糖甘油二酯，表明突變體酶T257S可以利用UDP-Glu和甘油二酯為底物合成單葡萄糖甘油二酯。

1-單葡萄糖甘油二酯和MGDG標(biāo)品；2-未加酶的對照組；3,4-加入突變體酶后的催化合成產(chǎn)物圖3 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體T257S合成單葡萄糖甘油二酯的TLC結(jié)果Fig.3 TLC results for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.5 LC-MS法檢測T257S反應(yīng)產(chǎn)物

采用LC-MS法進一步鑒定甘油糖脂結(jié)構(gòu)。在正離子掃描模式下檢測結(jié)果如圖4所示，突變體酶T257S催化反應(yīng)產(chǎn)物中獲得單葡萄糖甘油二酯的特征碎片圖譜，甘油二酯為m/z577.4、甘油單酯(甘油-16∶0)為m/z313.3，甘油單酯(甘油-18∶1)為m/z339.3，單葡萄糖甘油二酯母離子為m/z774.3。進一步證明了糖基轉(zhuǎn)移酶突變體T257S合成產(chǎn)物為單葡萄糖甘油二酯，具體生物催化反應(yīng)式見圖5。

圖4 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體T257S合成單葡萄糖甘油二酯的二級質(zhì)譜結(jié)果Fig.4 Secondary mass spectrometry results for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

圖5 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體T257S合成單葡萄糖甘油二酯催化反應(yīng)式Fig.5 Reaction scheme for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.6 糖基轉(zhuǎn)移酶突變體T257S最適反應(yīng)條件分析

2.6.1 突變體酶最適酶濃度和最適底物濃度

突變體酶最適酶濃度及底物濃度見圖6。

圖6 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體T257S的最適反應(yīng)酶濃度(a)和底物質(zhì)量濃度(b)Fig.6 Optimal enzyme concentration (a) and substrate concentration (b) for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

由圖6-a可以看出，單葡萄糖甘油二酯在糖基轉(zhuǎn)移酶突變體T257S酶濃度為8 U/mL時產(chǎn)率最高；由圖6-b可以得出，單葡萄糖甘油二酯在底物UDP-Glu質(zhì)量濃度為500 mg/L時產(chǎn)率最高。

2.6.2 突變體酶最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH

如圖7-a所示，隨著溫度的升高，酶活性也逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)溫度到達35 ℃時，突變體酶T257S活性最高，溫度超過35 ℃酶活性逐漸降低，因此突變體酶T257S的最適反應(yīng)溫度為35 ℃。如圖7-b所示，當(dāng)pH在8.5時，突變體T257S的相對酶活性較高，因此突變體酶T257S最適反應(yīng)pH為8.5。

圖7 糖基轉(zhuǎn)移酶Agt突變體T257S的最適溫度(a)和最適反應(yīng)pH(b)Fig.7 Optimal temperature (a) and pH (b) for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.6.3 最適反應(yīng)條件下突變體酶T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯的反應(yīng)

突變體酶T257S合成單葡萄糖甘油二酯的最佳反應(yīng)條件為：酶濃度8 U/mL、UDP-Glu質(zhì)量濃度500 mg/L、溫度35 ℃和pH 8.5。最佳條件下反應(yīng)20 h，突變體酶T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯的結(jié)果如圖8所示。突變體酶T257S在反應(yīng)8 h后以68.5%的轉(zhuǎn)化率合成單葡萄糖甘油二酯(424.5 mg/L)；在初始500 mg/L的反應(yīng)中，酶在8 h內(nèi)消耗的UDP-Glu為365 mg/L(0.59 mmol/L)，根據(jù)轉(zhuǎn)化化學(xué)計量法，理論生成單葡萄糖甘油二酯應(yīng)為452.2 mg/L，轉(zhuǎn)化率為68.5%。單葡萄糖甘油二酯在反應(yīng)溶液中隨時間分解，表明產(chǎn)物不穩(wěn)定且可能易氧化。整個反應(yīng)過程中，單葡萄糖甘油二酯的損失量約為27.7 mg/L，進而計算得出反應(yīng)生成單葡萄糖甘油二酯純度為93.8%，表明突變體酶T257S具有較高的催化UDP-Glu和甘油二酯合成單葡萄糖甘油二酯的活性，可作為生物技術(shù)應(yīng)用中酶轉(zhuǎn)化合成單葡萄糖甘油二酯的備選酶源。

圖8 最適反應(yīng)條件下突變體酶T257S催化合成單葡萄糖甘油二酯Fig.8 The synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt under optimal reaction conditions

3 結(jié)論與討論

甘油糖脂具有抗腫瘤、抗病毒和抗炎等生物活性，相關(guān)研究已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。本研究在前期發(fā)現(xiàn)海洋細菌C.pelagibactersp.HTCC7211中一個高效催化合成單葡萄糖甘油二酯的甘油糖脂合成酶Agt的基礎(chǔ)上，對該酶進行分子改造，構(gòu)建了系列突變體酶表達質(zhì)粒，并成功實現(xiàn)了宿主表達；相對于野生型甘油糖脂合成酶Agt，突變體T257S的催化效率顯著提高；進一步采用傳統(tǒng)氯仿/甲醇法結(jié)合環(huán)己烷/乙酸乙酯復(fù)提產(chǎn)物，有效提高了產(chǎn)品提取效率；在確定突變體酶最佳反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，反應(yīng)產(chǎn)物單葡萄糖甘油二酯純度可達93.8%。本研究為國內(nèi)外首次采用生物酶法成功制備高純度的單葡萄糖甘油二酯。

綜上所述，通過C.pelagibactersp.HTCC7211中的甘油二脂合成酶Agt基因構(gòu)建并表達的單葡萄糖甘油二酯合成酶突變體T257S具有較高的生物催化活性，可高效催化UDP-Glu和甘油二酯合成高純度單葡萄糖甘油二酯，適用于單葡萄糖甘油二酯生物酶法制備，具有較高的研究價值及廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。