銀膠菊內(nèi)酯調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響

李海峰 林一春 陳岸東 林姝君 馮永鋒

(1海南省臨高縣中醫(yī)院內(nèi)科，海南 臨高 571800；2海口市中醫(yī)院急診科)

銀膠菊內(nèi)酯(PTN)是從菊科植物中分離出來的一種倍半萜類化合物，是一種很有發(fā)展前途的天然化合物,隨著研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)了該化合物有較好的抗炎作用,還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，將在治療各種炎癥、腫瘤等疾病方面發(fā)揮作用。肺泡上皮細(xì)胞具有屏障保護(hù)功能，肺組織損傷發(fā)生時(shí),參與肺組織修復(fù)過程，該細(xì)胞凋亡是引發(fā)肺炎的重要原因之一〔1〕。既往研究表明，PTN常被作為一種治療炎癥性疾病的藥物〔2〕。本研究采用LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞建立炎癥模型，探討PTN通過調(diào)控Janus激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料 BEAS-2B細(xì)胞(購(gòu)于上海酶研生物科技有限公司，貨號(hào)：Y-00805)；試劑：脂多糖(LPS 上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：L8880)；DMEM培養(yǎng)基(北京伊塔生物科技有限公司，貨號(hào)：YT8229)；胎牛血清(FBS 上海愛必信生物科技有限公司，貨號(hào)：abs9*)；CCK-8試劑盒(上海弗元生物科技有限公司，貨號(hào)：FY600001)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS 北京伊塔生物科技有限公司，貨號(hào)：SY0950)；白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：SEKH-0013)；IL-10 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：SEKR-0006)Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海弗元生物科技有限公司，貨號(hào)FY600003-20T)；Bcl-2多克隆抗、酶切Caspase-3多克隆抗體、Bax多克隆抗體(武漢亞科因生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ABP57867/ABP0021/ABM0074)；p-JAK1多克隆抗體、p-JAK2多克隆抗體、p-STAT1多克隆抗體、p-STAT3多克隆抗體(武漢亞科因生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ABP57569/ABP0190)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色劑(北京伊塔生物科技有限公司，貨號(hào)：SY4918)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種到6孔板，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。對(duì)照組：除正常培養(yǎng)外，不做其他處理的BEAS-2B細(xì)胞；LPS組：采用終濃度為1 μg/ml的LPS處理正常培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞24 h；PTN低劑量組、PTN中劑量組、PTN高劑量組：分別采用終濃度為1、5、10 μmol/L PTN處理2 h后，給予1 μg/ml LPS刺激24 h。

1.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 使用 CCK-8法分析各組BEAS-2B細(xì)胞存活率。將各組BEAS-2B細(xì)胞接種在96孔板中，每組 6個(gè)平行，每個(gè)孔加入 100 μl PBS洗滌細(xì)胞并重復(fù)3次，加入 10 μl CCK-8檢測(cè)溶液到每個(gè)孔中，繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀設(shè)置 490 nm，測(cè)量每個(gè)孔的吸光度來計(jì)算細(xì)胞存活率〔3〕。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板內(nèi)，至長(zhǎng)滿孔底部面積80%后，吸出多余培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次。加入1 ml胰酶消化液消化，幾分鐘后吸出消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打細(xì)胞，將混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心后棄去上清，收集細(xì)胞。加入PBS重懸細(xì)胞，取一定數(shù)量細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，離心后棄去上清，按照試劑盒說明書分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫條件避光孵育15 min，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況〔4〕。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液0.2 ml，置冰上裂解30 min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。將收集的蛋白樣品100℃沸水加熱 10 min，使蛋白充分變性，等樣品冷卻至常溫，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜裝置從下至上排列，依次按陰極板、3層濾紙、凝膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、3 層濾紙、陽極板的順序放好。濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，且每一層的氣泡都要排盡。接通電源，轉(zhuǎn)膜2 h。將轉(zhuǎn)膜完畢的PVDF膜取出，浸泡于5%脫脂奶粉配制的封閉液中，37℃封閉1 h后洗膜，加入適宜濃度的Bcl-2、酶切Caspase-3、Bax、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3多克隆抗體，清洗后加入二抗，封閉液中浸泡 2 h。參考相關(guān)說明書，使用 ECL 超敏發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白水平〔5〕。

1.6ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子含量 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液500 μl，離心5～10 min，取上清。利用 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中IL-6、IL-10水平，使用前將所有試劑充分混勻，在測(cè)試孔中，加入待測(cè)標(biāo)本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品做兩組平行實(shí)驗(yàn)。隨后立即加入50 μl生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃孵育1 h，之后甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作4次。每孔加入底物50 μl，輕輕震蕩，37℃孵育15 min后，加入終止液，輕搖酶標(biāo)板使之混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度〔6〕。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞存活率比較 LPS組〔(35.38±4.60)%〕細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組〔(100.00±0.76)%〕，說明構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型成功；PTN低、中、高劑量組〔(41.68±1.14)%、(59.56±4.13)%、(75.03±6.66)%〕顯著低于LPS組(P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、LPS組、PTN低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(4.11±0.59)%、(21.20±1.36)%、(16.07±1.26)%、(11.38±1.22)%、(7.31±1.03)%。LPS組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；PTN低、中、高劑量組分別與LPS組差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率的比較

2.3各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 LPS組Bcl-2蛋白水平顯著低于對(duì)照組，酶切Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。PTN 低、中、高劑量組Bcl-2蛋白水平顯著高于LPS組，酶切Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量顯著低于LPS組(P<0.05)，見圖2，表1。

2.4各組IL-6、IL-10水平比較 LPS組與對(duì)照組相比，IL-6含量升高，IL-10含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； PTN低、中、高劑量組與LPS組相比，IL-6含量降低，IL-10含量升高，差異顯著(P<0.05)，見表2。

1～5：對(duì)照組，LPS組,PTN低劑量組,PTN中劑量組,PTN高劑量組；下圖同圖2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

表1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

表2 各組細(xì)胞中炎癥因子含量比較

2.5各組JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 LPS組與對(duì)照組相比，JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；LPS組較PTN低、中、高劑量組顯著降低(P<0.05)，見圖3，表3。

圖3 各組細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

表3 各組細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

JAK/STAT信號(hào)通路是一類重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族〔7〕，此信號(hào)通路的激活與抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷、凋亡等有密切相關(guān)性〔8〕。有研究表明〔9〕，抑制JAK2/STAT3通路激活，可延遲肝臟、肺內(nèi)高遷移率族蛋白-1的釋放高峰，緩解肺泡上皮細(xì)胞損傷引起的致死性損傷，為早期診療提供廣闊的時(shí)間窗，與本研究結(jié)果相符 。

IL-6是炎癥形成的介質(zhì)，是重要的非特異性炎性因子，參與全身炎癥反應(yīng)。IL-10是一種有效的抗炎性因子，通過阻斷促炎性細(xì)胞因子、炎性趨化因子等發(fā)揮抗炎作用〔10〕。IL-10在防止宿主的損傷和維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用〔11〕。劉早陽等〔12〕研究結(jié)果說明IL-6作為一種促炎因子，其水平升高可促進(jìn)肺損傷，而高水平IL-10 可減輕肺損傷。本研究結(jié)果提示炎癥反應(yīng)得到緩解，說明PTN可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡由多種凋亡基因調(diào)控，其中促細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3和抗細(xì)胞凋亡基因 Bcl-2 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程中具有關(guān)鍵作用〔13〕，Bax 和Bcl-2的比例決定了細(xì)胞是否凋亡〔14〕。免疫印跡結(jié)果說明PTN可抑制LPS誘導(dǎo)后的BEAS-2B細(xì)胞凋亡。

綜上，PTN可通過調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路，提高LPS誘導(dǎo)后肺泡上皮細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。