2型糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞基因差異表達(dá)與信號通路

徐魁 李敏才

(湖北科技學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

糖尿病(DM)，特別是2型糖尿病(T2DM)是嚴(yán)重的代謝性疾病，高血糖將引起血管受損、動脈硬化和周圍血管病變。DM患者由于高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是常見的病理現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管功能受損和腎小球?yàn)V過屏障的通透性下降，構(gòu)成DM視網(wǎng)膜病變和DM腎病等并發(fā)癥病變基礎(chǔ)。本研究從DM患者和正常對照個(gè)體中分離真皮組織中內(nèi)皮細(xì)胞，對其RNA測序(RNA-seq)進(jìn)行比較差異表達(dá)的基因。

生物學(xué)研究的新領(lǐng)域——大數(shù)據(jù)基因表達(dá)芯片技術(shù)的出現(xiàn)，通過比較基因表達(dá)譜變化，篩選出與疾病相關(guān)的基因〔1〕。還可以對差異性基因參與的生物學(xué)過程、通路分析研究〔2〕。為研究T2DM患者與健康者內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差異性，以GSE92724芯片數(shù)據(jù)為樣本〔3〕，運(yùn)用基因富集分析(GSEA)軟件，采用生物信息學(xué)方法對基因本體(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路和蛋白質(zhì)相互網(wǎng)絡(luò)(STRING)分析可能存在的分子機(jī)制、探索相關(guān)生物學(xué)通路和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測，為T2DM內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1樣本數(shù)據(jù)來源 在Pubmed的GEO數(shù)據(jù)庫中輸入“type 2 diabetic patients”，選擇GSE92724的芯片數(shù)據(jù)作為研究對象。該芯片數(shù)據(jù)樣本來自4例T2DM患者、6例健康對照者外科手術(shù)切除的真皮組織，采用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD31+，CD45-，Podoplanin-)分離得到內(nèi)皮細(xì)胞樣本。

1.2數(shù)據(jù)分析 下載GSE92724的CEL文件，對探針?biāo)降男盘栔颠M(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化和基因注釋處理，最終轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)水平的中位值〔2，4〕。

1.3差異性基因分析 對4例T2DM患者、6例對照者基因表達(dá)值，通過在線工具BioJupies軟件分析差異性基因，繼而對差異性基因進(jìn)行火山圖表示。通過倍比法(FC)和假發(fā)現(xiàn)率(FDR)篩選顯著差異性基因分析，篩選條件：FDR<0.05，P≤0.01且|logFC|>1.5。對顯著性差異化基因進(jìn)行聚類熱圖分析〔5〕。

1.4GSEA 對處理后的GSE92724數(shù)據(jù)表達(dá)值，采用GSEA軟件進(jìn)行GO功能富集的生物學(xué)過程和KEGG的通路富集分析〔6〕，分析次數(shù)設(shè)置為1 000，并按分析的富集分?jǐn)?shù)(ES)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(NES)值排序。

1.5蛋白質(zhì)網(wǎng)路分析及核心基因分析 對GSEA分析得到的顯著性差異基因(閾值為>0.4)進(jìn)行STRING分析(https：/string-db-org.com)，將分析得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape得到蛋白質(zhì)表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行核心基因表達(dá)分析〔7〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用相關(guān)軟件檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在線R軟件BioJupies分析差異表達(dá)基因，采用倍數(shù)變化和顯著性分析，設(shè)置P≤0.05 且|logFC|>1.5。GSEA軟件GO功能富集分析和KEGG通路富集分析采用軟件推薦P<0.01。PPI軟件和Cytoscape軟件分析采用推薦P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1基因芯片數(shù)據(jù)差異性分析 通過對探針?biāo)降男盘栔颠M(jìn)行質(zhì)控、變異穩(wěn)定性分析、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化處理，對基因表達(dá)譜中位值進(jìn)行差異基因分析，發(fā)現(xiàn)T2DM患者與健康對照者內(nèi)皮細(xì)胞的差異表達(dá)基因1 633個(gè)(P<0.05)，進(jìn)一步篩選出極其顯著性差異表達(dá)基因，篩選條件：P<0.05并且|log2FC|>1.5，共篩選出777個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因126個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因651個(gè)。按Pearson系數(shù)進(jìn)行聚類繪制成熱圖，前75個(gè)基因的表達(dá)結(jié)果見圖1。

圖1 前75個(gè)顯著性差異表達(dá)基因的聚類熱圖

2.2GO功能富集分析 GO富集分析包括生物學(xué)過程(BP)，分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)，選取BP分析，功能分析顯示T2DM中上調(diào)基因參與多個(gè)生物學(xué)過程，排在前5位生物學(xué)過程分別為呼吸爆發(fā)的正性調(diào)節(jié)(GO：0060267)、免疫效應(yīng)過程調(diào)節(jié)(GO：0002697)、體液免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)(GO：0002920)、蛋白質(zhì)激活級聯(lián)調(diào)節(jié)(GO:0000257)、蛋白質(zhì)加工調(diào)節(jié)(GO:0070613)；T2DM下調(diào)基因參多個(gè)生物學(xué)過程，排在前5位生物學(xué)過程：表皮發(fā)育(GO:008544)、乳腺上皮發(fā)育(GO:0061180)、乳腺發(fā)育(GO:0030879)、建立皮膚屏障(GO:0061436)、皮膚發(fā)育(GO:0043588)。

2.3KEGG通路富集分析 KEGG通路分析顯示T2DM上調(diào)基因參與多個(gè)通路調(diào)節(jié)，排在前5位通路調(diào)節(jié)：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(hsa05323)、瘧疾(hsa05144)、自身免疫性甲狀腺疾病(hsa05320)、造血細(xì)胞譜系(hsa04640)、金黃色葡萄球菌感染(hsa05150)；T2DM下調(diào)基因參與多個(gè)通路調(diào)節(jié)，排在前5位通路調(diào)節(jié)：黑色素(hsa04916)、癌癥中的蛋白多糖(hsa05205)、基底細(xì)胞癌(hsa05217)、干細(xì)胞多能性信號通路(hsa04550)、細(xì)胞因子-受體相互作用(hsa04060)。

2.4蛋白質(zhì)相互作用和核心基因分析 彩色標(biāo)記的核心基因位于樞紐位置見圖2。

圖2 顯著性差異基因的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)

以P值≤0.01 且|logFC|>2為條件得到659個(gè)極其顯著性差異表達(dá)基因輸入在線STRING軟件，分析結(jié)果顯示節(jié)點(diǎn)值622，邊緣值2 084，預(yù)期邊緣值914，PPI富集呈顯著差異，主要體現(xiàn)在組織發(fā)育、上皮發(fā)育、系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程，分子功能表現(xiàn)為Ca離子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、Frizzled連接、信號受體結(jié)合等。將分析得到的蛋白質(zhì)之間的相互作用得分值輸入Cytoscape，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。在評分>300條件下進(jìn)行核心基因篩選，得到CCL20、LPAR3、LPAR1、LPAR5、NMU、PTGER3、S1PR5、CCL27、ACKR3等核心基因。

3 討 論

內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的屏障，調(diào)節(jié)血流量和血管張力，維持血管穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙〔8〕是指血管舒張因子(一氧化氮、前列環(huán)素、內(nèi)皮衍生超極化因子等)和血管收縮因子(內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、血栓烷等)的平衡失調(diào)，導(dǎo)致血管收縮功能增強(qiáng)。內(nèi)皮功能障礙是多種血管疾病的早期階段，如心血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素，氧化的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)接觸損傷的內(nèi)皮并積聚在內(nèi)皮下，逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊〔9〕。內(nèi)皮功能障礙是DM最有害的事件之一〔10〕。DM循環(huán)中的高葡萄糖引發(fā)內(nèi)皮功能障礙和細(xì)胞凋亡，會加速動脈粥樣硬化血管疾病，形成的繼發(fā)性病變?nèi)鏒M腎病、DM視網(wǎng)膜病變、DM足。因而DM內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，被認(rèn)為是血管病變的首發(fā)因素?；蛐酒拇髷?shù)據(jù)測試能發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)譜改變，為揭示疾病的分子機(jī)制提供幫助。在DM真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞與健康對照組的差異性基因中，進(jìn)行GO富集分析得到上調(diào)的生物學(xué)過程：呼吸爆發(fā)的正性調(diào)節(jié)〔11〕，免疫效應(yīng)過程調(diào)節(jié)〔12〕、體液免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)〔13，14〕等。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致其內(nèi)皮功能障礙的最重要機(jī)制之一，通常丙二醛(MDA)反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平，而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽(GSH)可反映機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平。因而DM患者生物學(xué)過程表現(xiàn)出呼吸爆發(fā)的正性調(diào)節(jié)〔11〕。在DM真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞的富集差異基因GO分析中，與對照組相比，一些下調(diào)的生物學(xué)過程：如GO功能富集的表皮發(fā)育、乳腺上皮發(fā)育、乳腺發(fā)育，符合DM患者表皮生長發(fā)育遲緩、皮膚中腺上皮發(fā)現(xiàn)緩慢，與相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道研究相一致〔15〕。研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與DM存在明顯的相關(guān)性〔16〕，DM作為瘧疾的危險(xiǎn)因素存在〔17〕。同樣在大數(shù)據(jù)分析中，自身免疫性甲狀腺疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與DM之間存在明顯的富集相關(guān)性〔18〕。

KEGG通路富集研究中，發(fā)現(xiàn)黑色素、癌癥中的蛋白多糖、基底細(xì)胞癌等通路下調(diào)。DM皮膚病變中，存在與正常組織不一樣的調(diào)節(jié)方式〔19〕。血漿中的蛋白多糖完全可成為DM的評價(jià)指標(biāo)〔20〕。大數(shù)據(jù)分析顯示14個(gè)新等位基因與基底細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)，提示DM發(fā)生基底細(xì)胞癌的概率減少，以往報(bào)道DM患者皮膚腫瘤性疾病較少相一致〔20〕。

將GSE92724芯片數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因譜導(dǎo)入，通過STRING分析結(jié)果值導(dǎo)入Cytoscape分析：主要有核心基因趨化因子(CCL)20、CCL27〔21〕、溶血磷脂受體(LPAR)1、LPAR3〔22〕、神經(jīng)介質(zhì)(NM)U〔23〕、前列腺素E2受體EP3亞型(PIGER3)、鞘氨醇1-磷酸受體(S1PR)5〔24〕、非典型趨化因子受體(ACKR)3〔25〕。以往研究發(fā)現(xiàn)，DM患者中趨化因子〔21〕及受體〔25〕表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)DM中炎癥病變，核心基因PIGER3也證實(shí)這一過程〔26，27〕。在部分DM患者中，表現(xiàn)溶血磷脂受體〔22〕和鞘氨醇-磷酸受體上調(diào)〔24〕，與脂質(zhì)代謝、炎癥病變相關(guān)。