沉默ASGPR基因?qū)Ω阶佣嗵前邢蚩垢伟┳饔玫挠绊?/h1>
2022-07-25 00:50:50孫金霞馬桂芳史衛(wèi)紅黃思怡楊李李啟松吳芹
中國老年學(xué)雜志 2022年8期
孫金霞 馬桂芳 史衛(wèi)紅 黃思怡 楊李 李啟松 吳芹
(江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)
肝細(xì)胞癌(HCC)致死率在腫瘤中居第三位，僅次于肺癌和胃癌〔1〕。目前針對HCC的治療尚無有效辦法，無論靶向藥物或傳統(tǒng)化療方案均無法為HCC患者帶來滿意的治療效果。附子作為“百藥之長”，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛之功效。研究發(fā)現(xiàn)，附子對腫瘤細(xì)胞SGC-7901具有抑制生長的作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，附子總生物堿能有效緩解小鼠誘導(dǎo)出現(xiàn)的乳腺癌身體冰冷、血塊淤積等癥狀〔3〕。董蘭鳳等〔4〕發(fā)現(xiàn)，將附子多糖和阿霉素連用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且連用能有效激活特異性T細(xì)胞免疫，從而起到抗腫瘤的效果。附子中主要化學(xué)成分有生物堿、多糖、苷類等〔5，6〕。附子多糖抗腫瘤作用日益被重視，主要成分是葡萄糖，另含有半乳糖、甘露糖等〔7〕，目前國內(nèi)對附子多糖抗HCC作用及機(jī)制進(jìn)行了初步研究〔8，9〕。本研究旨在探討沉默去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)基因?qū)Ω阶佣嗵前邢蛑委烪CC的機(jī)制。
1 材料與方法
1.1細(xì)胞株與培養(yǎng) 293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，HepG2細(xì)胞購自美國ATCC公司。HepG2細(xì)胞和293T細(xì)胞均使用DMEM培養(yǎng)基(均含10%胎牛血清、100 U/ml雙抗)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。
1.2動(dòng)物與分組 24只雄性SPF級Balb/c裸鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；建立HCC模型后將動(dòng)物按照體重隨機(jī)分為4組：HepG2-NC siRNA+生理鹽水(A組)，HepG2-ASGPR siRNA+生理鹽水(B組)，HepG2-NC siRNA+附子多糖(C組)，HepG2-ASGPR siRNA+附子多糖(D組)，每組6只。
1.3附子多糖 采用文獻(xiàn)〔7〕方法提取附子多糖。用于動(dòng)物灌胃給藥時(shí)，附子多糖采用研磨法生理鹽水混懸使用；用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，附子多糖粉末用磷酸鹽緩沖液(PBS)或無血清培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度的多糖溶液，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用0.22 μm無菌濾器過濾即可。
1.4試劑與儀器 慢病毒載體(GFP標(biāo)簽)購自蘇州瑞昊生物技術(shù)有限公司，靶向沉默ASGPR的RNA干擾序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成〔10〕。RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，限制性內(nèi)切酶和連接酶均購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Axygen公司，β-actin和ASGPR抗體購自美國Santa Cruz公司，CCK-8試劑盒、真核細(xì)胞蛋白提取試劑盒、抗體稀釋液、聚偏氟乙烯(PVDF)/NC膜、ECL顯影試劑和二抗等均購自碧云天生物技術(shù)公司，超凈工作臺(tái)購自蘇凈公司，CO2培養(yǎng)箱購自三洋公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Western印跡電轉(zhuǎn)設(shè)備購自美國伯樂公司。
1.5方法
1.5.1重組慢病毒干擾載體與病毒制備 以RNAi序列為正義鏈，以其互補(bǔ)鏈為反義鏈，分別在正、反義鏈之間加入Loop(UUCAAGAGA)，同時(shí)在正義鏈5′端和反義鏈3′端加入不同酶切位點(diǎn)，從而形成siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA，將該shRNA序列及其互補(bǔ)序列利用連接酶與慢病毒載體進(jìn)行基因重組，重組載體記為lenti-ASGPR siRNA組；陰性對照RNAi序列處理相同，記為lenti-NC siRNA組。使用質(zhì)粒提取試劑盒制備重組慢病毒質(zhì)粒，然后使用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度和細(xì)胞生長狀態(tài)，收集病毒上清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.5.2HepG2細(xì)胞穩(wěn)定沉默ASGPR細(xì)胞株 獲得與鑒定慢病毒顆粒感染HepG2細(xì)胞，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀分選綠色熒光蛋白(GFP)陽性的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞GFP表達(dá)的陽性率，以確定是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然后提取細(xì)胞總蛋白，Western印跡檢測ASGPR表達(dá)量，利用抗ASGPR2抗體(1∶1 000)進(jìn)行一抗孵育，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔IgG二抗(1∶200)孵育，以確定ASGPR的表達(dá)是否成功被沉默。
1.5.3體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別收集對數(shù)期HepG2-NC siRNA和HepG2-ASGPR siRNA細(xì)胞，取少許進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，確定活細(xì)胞比例，確定生長良好后調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度按每孔加3×103個(gè)/100 μl細(xì)胞鋪至96孔板，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照50 μg/ml添加附子多糖，置于37℃，5%CO2孵育48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD450 nm時(shí)，各孔的吸光度值。
1.5.4裸鼠HCC原位移植瘤模型的建立 按照文獻(xiàn)〔11〕方法，取對數(shù)生長期HepG2-ASGPR siRNA和HepG2-NC siRNA細(xì)胞，分別用PBS制成單細(xì)胞懸液，濃度為5×105/ml，每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106/2 ml PBS，利用高壓水流動(dòng)力學(xué)的注射方法在5～8 s內(nèi)將細(xì)胞通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，注射后次日開始給予附子多糖(500 mg/kg)。4 w后處死小鼠，取出小鼠肝臟，計(jì)數(shù)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并稱重。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad prism5.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果使用FlowJo7.6 軟件處理作圖。
2 結(jié) 果
2.1慢病毒包裝GFP陽性細(xì)胞 視野下細(xì)胞均表達(dá)熒光強(qiáng)烈，且細(xì)胞生長良好，見圖1，說明病毒包裝成功，收集病毒上清并用0.22 μm的無菌濾器過濾，用于HepG2細(xì)胞感染。
2.2HepG2不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中GFP和ASGPR的表達(dá)情況 lenti-NC siRNA組和lenti-ASGPR siRNA組HepG2細(xì)胞均成功表達(dá)GFP，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)99%以上。A組ASGPR蛋白表達(dá)水平(0.989±0.008)顯著高于B組(0.473±0.011，P<0.001)。見圖2。
圖1 293T細(xì)胞包裝慢病毒后的細(xì)胞熒光(×100)
圖2 Western印跡檢測AGSPR2水平
2.3RNA干擾ASGPR表達(dá)后，附子多糖對肝癌細(xì)胞體外增殖的影響 A組與B組細(xì)胞株增殖無明顯差異(P>0.05)。C組OD450值顯著低于A組， D組OD450值顯著低于B組(P<0.05)，表明附子多糖對可顯著抑制肝癌細(xì)胞的體外增殖。D組細(xì)胞的OD450值顯著高于C組細(xì)胞的OD450值(P<0.05)，表明ASGPR表達(dá)的缺失，使附子多糖的體外抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力下降，推測ASGPR可能在附子多糖抗肝癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。見表1。
2.4RNA干擾ASGPR表達(dá)后，附子多糖對裸鼠肝癌成瘤的影響 利用高壓水流動(dòng)力學(xué)建立肝癌原位移植瘤模型，見表1和圖3，模型建立成功。C組與A組相比， D組與B組相比，在腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、肝臟重量顯著下降(P<0.05)，表明附子多糖可顯著抑制裸鼠肝癌成瘤。而D組腫瘤結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)和肝臟重量顯著高于C組(P<0.05)，表明干擾ASGPR表達(dá)后，附子多糖的體內(nèi)抑癌能力下降，該結(jié)果與體外抑瘤趨勢一致，充分表明ASGPR在附子多糖抗肝癌中的重要作用。
表1 各組OD450、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、肝臟重量比較
圖3 附子多糖對各組HCC的影響
3 討 論
溫陽散寒中藥對許多晚期癌癥患者出現(xiàn)的陽虛寒凝臨床表現(xiàn)有較好療效。附子來源于毛茛科多年生草本植物烏頭，有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效，臨床用于治療各種亡陽癥、虛寒癥、寒痹癥等。附子多糖是附子的多糖類成分，是附子發(fā)揮作用的主要成分之一。
肝細(xì)胞表面存在多種糖鏈識(shí)別受體,如甘露糖受體、半乳糖受體等〔12〕。ASGPR是一種跨膜蛋白，是主要表達(dá)在肝竇狀隙和基底外側(cè)細(xì)胞表面的受體。人肝癌細(xì)胞系HepG2能高表達(dá)ASGPR，其表達(dá)的ASGPR約為22.5萬個(gè)〔13〕，是研究ASGPR的理想細(xì)胞。ASGPR的胞外結(jié)構(gòu)域含有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域,能識(shí)別和結(jié)合半乳糖殘基和 N-乙酰半乳糖胺殘基,當(dāng)與特異的糖殘基結(jié)合后,即發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞作用〔14，15〕。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖可靶向肝臟富集,且可能通過 ASGPR 介導(dǎo)進(jìn)入肝臟細(xì)胞〔16〕，從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。
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1.3附子多糖 采用文獻(xiàn)〔7〕方法提取附子多糖。用于動(dòng)物灌胃給藥時(shí)，附子多糖采用研磨法生理鹽水混懸使用；用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，附子多糖粉末用磷酸鹽緩沖液(PBS)或無血清培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度的多糖溶液，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用0.22 μm無菌濾器過濾即可。
1.4試劑與儀器 慢病毒載體(GFP標(biāo)簽)購自蘇州瑞昊生物技術(shù)有限公司，靶向沉默ASGPR的RNA干擾序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成〔10〕。RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，限制性內(nèi)切酶和連接酶均購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Axygen公司，β-actin和ASGPR抗體購自美國Santa Cruz公司，CCK-8試劑盒、真核細(xì)胞蛋白提取試劑盒、抗體稀釋液、聚偏氟乙烯(PVDF)/NC膜、ECL顯影試劑和二抗等均購自碧云天生物技術(shù)公司，超凈工作臺(tái)購自蘇凈公司，CO2培養(yǎng)箱購自三洋公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Western印跡電轉(zhuǎn)設(shè)備購自美國伯樂公司。
1.5方法
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1.5.3體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別收集對數(shù)期HepG2-NC siRNA和HepG2-ASGPR siRNA細(xì)胞，取少許進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，確定活細(xì)胞比例，確定生長良好后調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度按每孔加3×103個(gè)/100 μl細(xì)胞鋪至96孔板，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照50 μg/ml添加附子多糖，置于37℃，5%CO2孵育48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD450 nm時(shí)，各孔的吸光度值。
1.5.4裸鼠HCC原位移植瘤模型的建立 按照文獻(xiàn)〔11〕方法，取對數(shù)生長期HepG2-ASGPR siRNA和HepG2-NC siRNA細(xì)胞，分別用PBS制成單細(xì)胞懸液，濃度為5×105/ml，每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106/2 ml PBS，利用高壓水流動(dòng)力學(xué)的注射方法在5～8 s內(nèi)將細(xì)胞通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，注射后次日開始給予附子多糖(500 mg/kg)。4 w后處死小鼠，取出小鼠肝臟，計(jì)數(shù)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并稱重。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad prism5.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果使用FlowJo7.6 軟件處理作圖。
2 結(jié) 果
2.1慢病毒包裝GFP陽性細(xì)胞 視野下細(xì)胞均表達(dá)熒光強(qiáng)烈，且細(xì)胞生長良好，見圖1，說明病毒包裝成功，收集病毒上清并用0.22 μm的無菌濾器過濾，用于HepG2細(xì)胞感染。
2.2HepG2不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中GFP和ASGPR的表達(dá)情況 lenti-NC siRNA組和lenti-ASGPR siRNA組HepG2細(xì)胞均成功表達(dá)GFP，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)99%以上。A組ASGPR蛋白表達(dá)水平(0.989±0.008)顯著高于B組(0.473±0.011，P<0.001)。見圖2。
圖1 293T細(xì)胞包裝慢病毒后的細(xì)胞熒光(×100)
圖2 Western印跡檢測AGSPR2水平
2.3RNA干擾ASGPR表達(dá)后，附子多糖對肝癌細(xì)胞體外增殖的影響 A組與B組細(xì)胞株增殖無明顯差異(P>0.05)。C組OD450值顯著低于A組， D組OD450值顯著低于B組(P<0.05)，表明附子多糖對可顯著抑制肝癌細(xì)胞的體外增殖。D組細(xì)胞的OD450值顯著高于C組細(xì)胞的OD450值(P<0.05)，表明ASGPR表達(dá)的缺失，使附子多糖的體外抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力下降，推測ASGPR可能在附子多糖抗肝癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。見表1。
2.4RNA干擾ASGPR表達(dá)后，附子多糖對裸鼠肝癌成瘤的影響 利用高壓水流動(dòng)力學(xué)建立肝癌原位移植瘤模型，見表1和圖3，模型建立成功。C組與A組相比， D組與B組相比，在腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、肝臟重量顯著下降(P<0.05)，表明附子多糖可顯著抑制裸鼠肝癌成瘤。而D組腫瘤結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)和肝臟重量顯著高于C組(P<0.05)，表明干擾ASGPR表達(dá)后，附子多糖的體內(nèi)抑癌能力下降，該結(jié)果與體外抑瘤趨勢一致，充分表明ASGPR在附子多糖抗肝癌中的重要作用。
表1 各組OD450、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、肝臟重量比較
圖3 附子多糖對各組HCC的影響
3 討 論
溫陽散寒中藥對許多晚期癌癥患者出現(xiàn)的陽虛寒凝臨床表現(xiàn)有較好療效。附子來源于毛茛科多年生草本植物烏頭，有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效，臨床用于治療各種亡陽癥、虛寒癥、寒痹癥等。附子多糖是附子的多糖類成分，是附子發(fā)揮作用的主要成分之一。
肝細(xì)胞表面存在多種糖鏈識(shí)別受體,如甘露糖受體、半乳糖受體等〔12〕。ASGPR是一種跨膜蛋白，是主要表達(dá)在肝竇狀隙和基底外側(cè)細(xì)胞表面的受體。人肝癌細(xì)胞系HepG2能高表達(dá)ASGPR，其表達(dá)的ASGPR約為22.5萬個(gè)〔13〕，是研究ASGPR的理想細(xì)胞。ASGPR的胞外結(jié)構(gòu)域含有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域,能識(shí)別和結(jié)合半乳糖殘基和 N-乙酰半乳糖胺殘基,當(dāng)與特異的糖殘基結(jié)合后,即發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞作用〔14，15〕。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖可靶向肝臟富集,且可能通過 ASGPR 介導(dǎo)進(jìn)入肝臟細(xì)胞〔16〕，從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。
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