聯(lián)氨基姜黃素對(duì)大鼠肝癌的防護(hù)作用及其機(jī)制

趙冀安 崔麗敏 馬艷榮 董梁 聶文佳 劉文聰 劉維麗

(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科，河北 石家莊 050013；2定州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 3急診科；4醫(yī)務(wù)處；5超聲科；6肝膽外科)

肝癌是人類最主要的惡性腫瘤之一〔1〕。由于診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步，在早期發(fā)現(xiàn)肝癌時(shí)，可以通過(guò)手術(shù)切除，射頻消融(RFA)和經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞(TACE)等進(jìn)行治療。然而，肝癌的頻繁復(fù)發(fā)往往會(huì)阻礙治療〔2〕，因?yàn)槭Ｓ嗟母闻K仍有致癌的可能〔3〕。通過(guò)回顧性研究發(fā)現(xiàn)常用的化療(全身化療、介入栓塞化療等)對(duì)肝癌患者的總體療效不佳，并不能提高患者生存率〔4〕。姜黃素(CUR)是姜黃的有效成分，在臨床試驗(yàn)中對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等癌癥有很強(qiáng)的抗腫瘤作用〔5,6〕。盡管CUR具有顯著的無(wú)毒性和良好的抗癌活性，但有研究表明，由于其在生理?xiàng)l件下的不穩(wěn)定性和生物利用度較低，限制了其在抗癌治療中的應(yīng)用〔7,8〕。為了保留CUR良好的藥用特性和安全性，同時(shí)提高其藥效，合成了一種CUR吡唑類似物，即聯(lián)氨基CUR(HZC)，并應(yīng)用于多種腫瘤細(xì)胞。Rathore等〔9〕通過(guò)一種有效的高效液相色譜法(HPLC)，同時(shí)測(cè)定腸灌注液中的HZC和酚紅的不同pH值，發(fā)現(xiàn)HZC具有良好的腸道通透性。既往研究證實(shí)HZC對(duì)于多種癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，尤其是HepG2細(xì)胞，在所有CUR類似物中，其半數(shù)有效量(ED50)值最低〔10〕。Wang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，HZC能有效抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3磷酸化程度，降低STAT3下游相關(guān)基因的表達(dá)，可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。DEN已經(jīng)確定是大鼠肝癌發(fā)生的強(qiáng)力藥物，在該致癌因子的作用下，通過(guò)自身細(xì)胞的突變、轉(zhuǎn)化和增殖形成的大鼠肝癌與人肝癌的發(fā)生過(guò)程相似〔12〕。SD大鼠與人肝癌的相似性已被廣泛接受，使其成為肝癌研究的理想模型〔13〕。本文探討HZC對(duì)二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝癌發(fā)生和發(fā)展的影響，并探究其發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供4 w齡雄性SD大鼠(體重100～110 g)80只。大鼠在恒溫(23℃)和恒濕(55%)的12 h光/暗循環(huán)的通風(fēng)室中，使其適應(yīng)動(dòng)物房的條件，并在24 w的整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，喂飼市售顆粒大鼠飼料和水。DEN、兔抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBL)試劑盒均購(gòu)自羅氏公司。

1.2動(dòng)物分組及給藥方法 根據(jù)需要將大鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組〔腹腔注射生理鹽水(80 mg/kg)〕、藥物對(duì)照組〔腹腔注射HZC(80 mg/kg)〕、模型組〔腹腔注射DEN(50 mg/kg)〕、干預(yù)組〔腹腔注射DEN(50 mg/kg)和HZC(80 mg/kg)〕。以上4組均給藥2次/w，12 w后停藥。待24 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3觀察與方法 實(shí)驗(yàn)持續(xù)24 w，每周末記錄體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)按照動(dòng)物倫理準(zhǔn)則對(duì)所有存活的大鼠進(jìn)行麻醉并處死。處死前通過(guò)心臟穿刺從所有組中采集血樣。將血樣以3 000 r/min離心3 min，然后分離血清并保持在-20℃，直到用于生化分析。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST、ALP、GGT、TBL水平。測(cè)量大鼠體重和肝臟重量，并計(jì)算肝臟指數(shù)(肝重/體重×100%)統(tǒng)計(jì)腫瘤數(shù)量。切取各組肝臟標(biāo)本。病理學(xué)觀察：肉眼觀察肝臟大體形態(tài),結(jié)節(jié)大小。鑒于大鼠肝癌多為分散的癌結(jié)節(jié)，致使計(jì)數(shù)腫瘤容易出現(xiàn)紕漏。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)方法，本文將腫物直徑大于6 mm的結(jié)節(jié)認(rèn)定為肝癌〔12〕。剪取的肝組織用甲醛溶液固定后脫水，56℃石蠟包埋，制備常規(guī)切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。肝癌的診斷和分級(jí)是根據(jù)細(xì)胞塊切片上的形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)確定的。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性呈棕黃色，顆粒狀或彌漫性分布。表達(dá)強(qiáng)度取決于染色強(qiáng)度(0：陰性；1：弱；2：中；3：強(qiáng))和陽(yáng)性細(xì)胞百分比(0：0%陽(yáng)性細(xì)胞；1：≤25%陽(yáng)性細(xì)胞；2：26%～50%陽(yáng)性細(xì)胞；3：>50%陽(yáng)性細(xì)胞)。兩數(shù)相加，最高分?jǐn)?shù)為6分。評(píng)分>2分表示標(biāo)志物的免疫組化認(rèn)定為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、方差分析或秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況比較 正常對(duì)照組和藥物對(duì)照組大鼠體重增長(zhǎng)較快，無(wú)死亡。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，模型組、干預(yù)組大鼠飲水和進(jìn)食開(kāi)始減少，精神萎靡，毛發(fā)干燥，體重增加緩慢且小于正常對(duì)照組和藥物對(duì)照組，但干預(yù)組上述癥狀較模型組輕。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，兩個(gè)對(duì)照組均無(wú)死亡。模型組死亡12只，干預(yù)組死亡2只，經(jīng)病理確診為肝癌。正常對(duì)照組、藥物對(duì)照組均未發(fā)生肝癌。模型組和干預(yù)組肝癌發(fā)病率分別為100.0%和20.0%。模型組平均癌結(jié)節(jié)數(shù)目〔(17.17±1.08)個(gè)〕較干預(yù)組〔(11.83±3.90)個(gè)〕明顯增多(P<0.05)。兩個(gè)對(duì)照組及二者與干預(yù)組體重、增重、肝重和肝臟指數(shù)均無(wú)顯著差異(均P>0.05)。與兩個(gè)對(duì)照組相比，模型組體重、增重明顯降低，肝重和肝臟指數(shù)明顯增高(P<0.05)。與模型組相比，干預(yù)組體重、增重明顯升高，肝重、肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組體重、增重、肝重及肝臟比較

2.2各組形態(tài)學(xué)改變 兩個(gè)對(duì)照組肝臟表面正常，邊緣銳利，色澤紅潤(rùn)，沒(méi)有出現(xiàn)增生結(jié)節(jié)。模型組邊緣不整齊，色澤灰白暗淡，可見(jiàn)表面出現(xiàn)大小不等的灰白色癌結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，結(jié)節(jié)切面有壞死及出血。干預(yù)組肝臟也可見(jiàn)白色癌結(jié)節(jié)，但與模型組相比，癌結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，且結(jié)節(jié)直徑較小，見(jiàn)圖1。

圖1 各組肝臟形態(tài)改變

2.3各組組織病理學(xué)改變 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞無(wú)變性壞死，細(xì)胞核清晰，肝索規(guī)整，且圍繞中央靜脈呈放射狀排列；藥物對(duì)照組顯示出中央靜脈和肝血竇輕到中度充血；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，細(xì)胞變性，結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核分裂及胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒增多，有大小不等的再生結(jié)節(jié)；干預(yù)組同模型組比較，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂和肝細(xì)胞變性程度較模型組明顯減輕，肝癌細(xì)胞排列相對(duì)有序，部分癌灶呈現(xiàn)片狀壞死，見(jiàn)圖2。

2.4各組免疫組化結(jié)果 正常對(duì)照組和藥物對(duì)照組肝組織中幾乎沒(méi)有出現(xiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞；模型組PCNA蛋白陽(yáng)性率為70.0%，核深染，提示細(xì)胞分裂和增殖旺盛；干預(yù)組PCNA蛋白陽(yáng)性率(13.3%)，與兩個(gè)對(duì)照組(0.0%、0.0%)比較顯著上升，但較模型組顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.5各組肝功能檢測(cè) 模型組和干預(yù)組的ALT、AST、ALP、GGT、TBL指標(biāo)明顯高于兩個(gè)對(duì)照組(P<0.05)。干預(yù)組的各項(xiàng)肝功能指標(biāo)較模型組明顯降低(P<0.05)。兩個(gè)對(duì)照組肝功能指差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 各組肝臟組織HE染色(×400)

表2 各組ALT、AST、ALP、GGT和TBL水平比較

3 討 論

肝臟是大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)、藥物和致癌物質(zhì)代謝的主要器官〔14〕。有研究報(bào)道，給予DEN的大鼠食物攝取減少和隨后的體重增重減少可能由于骨骼肌和脂肪組織的丟失，甚至蛋白質(zhì)消耗引起的〔15〕。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道同對(duì)照組相比，給予DEN的大鼠體重顯著減少，而肝臟重量會(huì)顯著增加是由于肝臟癌結(jié)節(jié)〔16〕，與本研究結(jié)果一致。

PCNA是一種細(xì)胞增殖活性標(biāo)志物，可用來(lái)反映腫瘤細(xì)胞核惡性程度，分化越差指標(biāo)越高〔17〕。PCNA表達(dá)增強(qiáng)提示肝組織增生異常。本研究結(jié)果提示DEN可明顯誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生發(fā)展，而HZC對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型的發(fā)生具有防護(hù)作用。

DEN導(dǎo)致的肝臟損傷一般會(huì)影響肝細(xì)胞功能，肝細(xì)胞受損使血清酶釋放入血而出現(xiàn)升高改變〔18〕。ALT、AST、ALP、GGT和TBL是反映肝功能損害的敏感指標(biāo)〔19〕。ALT反映肝細(xì)胞損傷最為敏感，即使輕微肝功能損傷，數(shù)值也會(huì)抬高，而且通常伴隨AST升高〔20〕。ALP與管狀區(qū)的脂質(zhì)膜密切相關(guān)，不管是肝內(nèi)還是肝外的損害都會(huì)導(dǎo)致ALP活性升高〔21〕。GGT是一種膜結(jié)合酶，一般位于膽管內(nèi)上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是肝膽疾病的敏感指標(biāo)之一。GGT在血清中增高可能由于這種酶從細(xì)胞膜中釋放至血液循環(huán)中，提示致癌物導(dǎo)致細(xì)胞膜損害〔22〕。當(dāng)發(fā)生肝癌時(shí)，大鼠血清中GGT顯著升高是因?yàn)樵撁笍馁|(zhì)膜釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，表明由于致癌作用導(dǎo)致細(xì)胞膜受損。TBL反映肝細(xì)胞損害程度和預(yù)后，其增高可能是由于致癌劑的毒性作用損害了肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞，致使中央靜脈周圍的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷產(chǎn)生出血而形成的〔23〕。這與本研究一致。通過(guò)使用HZC治療使這些酶活性較模型組降低，表明HZC保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，從而降低酶泄漏。提示HZC通過(guò)降低ALT、AST、ALP、GGT和TBL活性對(duì)肝臟有保護(hù)作用。

環(huán)氧化酶(COX)-2是COX的一種主要類型，與肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其在肝硬化、肝癌患者肝組織中的表達(dá)均高于正常肝組織〔24〕。COX-2被證明通過(guò)免疫反應(yīng)抑制、凋亡抑制、血管生成調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞侵襲來(lái)影響致癌作用，在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用〔25〕。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織COX-2過(guò)度表達(dá)的患者預(yù)后較差〔26〕。研究表明，在許多腫瘤中COX-2過(guò)度表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，而COX-2抑制劑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。COX-2是預(yù)防和治療炎癥性疾病和癌癥的重要靶基因。COX-2啟動(dòng)子區(qū)域包括2個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB結(jié)合位點(diǎn)，CUR通過(guò)干擾NF-κB激活抑制COX-2表達(dá)，從而預(yù)防癌癥的發(fā)生〔27〕。Selvam等〔28〕設(shè)計(jì)了一系列的CUR衍生物，發(fā)現(xiàn)吡唑類衍生物HZC具有對(duì)COX-2的抑制、抗氧化和抗炎活性，該研究結(jié)果表明，HZC較CUR相比，COX-2的選擇性顯著增強(qiáng)，并具有明顯的抗炎活性，吡唑環(huán)取代CUR的β-二酮片段可顯著提高COX-2的選擇性。原因是HZC含有2個(gè)甲氧基，其抗COX-2活性能力高于CUR。本研究認(rèn)為HZC作用的分子機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB通路及減少COX-2中NF-κB調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。提示HZC通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)來(lái)干擾NF-κB的活性，因此具有較好的抗腫瘤活性。

綜上，HZC降低了DEN對(duì)大鼠肝臟的毒性，從而降低了DEN的發(fā)生率、腫瘤數(shù)量、肝臟重量、肝臟指數(shù)、肝臟標(biāo)志酶，增加了生存率和體重。證實(shí)HZC對(duì)DEN誘導(dǎo)的SD大鼠肝癌具有防護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。