雪糕中的菌落總數(shù)測(cè)量不確定度評(píng)定

劉 暢，趙新宇

（1.鞍山市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心-食藥所，遼寧鞍山 114021；2.輝山乳業(yè)（沈陽）銷售有限公司研發(fā)部，遼寧沈陽 110121）

冷凍飲品是人們?cè)谙娜绽锵罱饪实氖走x，然而冷凍飲品的生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)較多，且產(chǎn)品裸露在空氣中時(shí)間較長，生產(chǎn)過程中很容易受到微生物污染[1-2]。在食品安全評(píng)價(jià)中，菌落總數(shù)作為食品檢測(cè)中最常見的衛(wèi)生指標(biāo)，通常用于表明細(xì)菌污染的程度[3]。但由于微生物的特殊性，其在樣品中的分布并不均勻，所以檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在較大的分散性。不確定度是指由于存在不可避免的誤差，對(duì)被測(cè)量值不能肯定的程度。不確定度越小，測(cè)量值與被測(cè)量的真實(shí)值越接近[4]。為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，本文將依據(jù)菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)市售某品牌的同一批次雪糕進(jìn)行菌落總數(shù)的檢測(cè)，并采用bottom-up 方法與食品微生物測(cè)量不確定度評(píng)估指南對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售某品牌雪糕；平板計(jì)數(shù)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；0.85%生理鹽水，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

百級(jí)潔凈室；FZ-20001 電子天平，上海凡展衡器有限公司；YXQ-LS-100S Ⅱ蒸汽壓力滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；SPX-250F-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

用滅菌鑷子除去包裝紙，將冰棍/雪糕部分放入無菌均質(zhì)袋中，木棒留在袋外，捏緊袋口，用力抽出木棒，置45 ℃水浴15 min，溶化后立即進(jìn)行檢驗(yàn)[5]。

1.3.2 檢測(cè)過程

以無菌吸管吸取25 mL 樣品置于225 mL 生理鹽水均質(zhì)袋中，充分混勻，制成1 ∶10 的樣品勻液；用1 mL 無菌吸管吸取樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入9 mL 生理鹽水試管中，振搖試管混合均勻，制成1 ∶100 的樣品勻液，倍比稀釋；分別吸取1 mL 樣品勻液于兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，及時(shí)將約20 mL 冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻；待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板于（36±1）℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 菌落總數(shù)計(jì)數(shù)

如果只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每mL 樣品中菌落總數(shù)結(jié)果；如果有兩個(gè)連續(xù)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，按式（1）進(jìn)行計(jì)算[6]。

式中：N為樣品中菌落數(shù)，CFU/mL；ΣC為平板菌落數(shù)之和，CFU/mL；n1為第一稀釋度平板個(gè)數(shù)；n2為第二稀釋度平板個(gè)數(shù)；d為稀釋因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

本實(shí)驗(yàn)以市售某品牌同一批次的10 個(gè)雪糕為樣品，固定設(shè)備，培養(yǎng)基、試劑同一批次，單人兩次開展檢測(cè)，每個(gè)樣品做3 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，最終得到20 個(gè)檢測(cè)結(jié)果。由于無菌室的潔凈度、培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)箱的溫度波動(dòng)以及檢測(cè)人員的操作水平等分量的不確定度不能依靠直接測(cè)量或統(tǒng)計(jì)學(xué)的方式進(jìn)行評(píng)定，因此本實(shí)驗(yàn)僅考慮次級(jí)取樣、倍比稀釋、傾注平皿和再現(xiàn)性檢測(cè)結(jié)果所帶來的不確定度因素。

2.2 不確定度分量

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）中規(guī)定，樣品制備中使用的量筒和分度吸管等玻璃量具均有相應(yīng)的最大允差，見表1[6-7]。

表1 玻璃量具的最大允差

2.2.1 次級(jí)取樣引入的不確定度

以無菌吸管吸取25 mL 樣品置于225 mL 生理鹽水均質(zhì)袋中，充分混勻，制成1 ∶10 的樣品勻液；次級(jí)取樣過程中使用的玻璃量具為A 級(jí)25 mL分度吸管和量出式250 mL 量筒，由表1 可知，A 級(jí)25 mL 分度吸管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

吸取25 mL 樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

量出式250 mL 引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

量取225 mL 生理鹽水引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則次級(jí)取樣引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 倍比稀釋引入的不確定度

用1 mL 無菌吸管吸取樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入9 mL 生理鹽水試管中，振搖試管混合均勻，制成1 ∶100 的樣品勻液，倍比稀釋；此過程使用的玻璃量器為A 級(jí)1 mL 分度吸管和A 級(jí)10 mL 分度吸管，同2.1.1。

A 級(jí)1 mL 分度吸管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

吸取1 mL 樣品稀釋液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

A 級(jí)10 mL 分度吸管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

吸取9 mL 生理鹽水引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

本實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品做3 個(gè)稀釋度，因此倍比稀釋2 次，則倍比稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.3 傾注平皿引入的不確定度

分別吸取1 mL 樣品勻液于兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，及時(shí)將約20 mL 冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻；本實(shí)驗(yàn)不考慮培養(yǎng)基的體積和溫度所引入的不確定度，所以此過程的不確定度僅為A 級(jí)1 mL 分度吸管所引入，3 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平行，共引入6 次，則傾注平皿引入的不確定度為

2.2.4 再現(xiàn)性檢測(cè)引入的不確定度

通過不同時(shí)間的兩次實(shí)驗(yàn)（以A 和B 表示），對(duì)10 個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果見表2，依照標(biāo)準(zhǔn)，先將檢測(cè)結(jié)果的單位從CFU/mL 轉(zhuǎn)換為lg(CFU/mL)，再計(jì)算再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SR。

表2 再現(xiàn)性檢測(cè)引入的不確定度

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4 擴(kuò)展不確定度U

在 包 含 因 子 為2（ 置 信 水 平95%）時(shí)，U=2uc(y)=0.094 lg(CFU/mL)。

2.5 結(jié)果報(bào)告

本次雪糕中的菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果平均值為8 600 CFU/mL，對(duì)數(shù)形式表示為2.9 lg(CFU/mL)；按照食品微生物學(xué)測(cè)量不確定度評(píng)估指南，本次測(cè)量不確定度結(jié)果是8.6×103CFU/mL[6.4×102，9.8×102]，以對(duì)數(shù)形式表示為（2.9±0.094）lg(CFU/mL)。

3 結(jié)論

食品中微生物檢測(cè)由于自然污染物的不規(guī)律分布及動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，造成同一批次的獨(dú)立樣品間檢測(cè)結(jié)果差異顯著。本次檢測(cè)未能引入的分量，在日常檢測(cè)中應(yīng)考慮到其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。如無菌室的潔凈度、商品化即用型培養(yǎng)基、檢測(cè)使用的設(shè)備及實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)水平等。只有時(shí)刻保持細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度，才能完成上述所有質(zhì)量控制工作，進(jìn)而對(duì)不同基質(zhì)的多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行不確定度的評(píng)定。