奶山羊羔羊山羊痘的病理學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)診斷

王 娜，張 帆，宋 越，白 帆，戴伶俐，張月梅，李曉燕，周 淵，王建光，王根云，趙世華

（1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市動物疫病防控中心， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010020；3.內(nèi)蒙古盛健生物科技有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

山羊痘（goatpox）又稱羊天花，是由山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）感染引起的一種急性、熱性、接觸性傳染?。?-2］。 山羊痘病毒具有宿主特異性，常感染不同年齡、不同性別、不同品種的山羊，且羔羊多發(fā)，僅少數(shù)毒株可感染綿羊，偶見感染人［3-4］。 該病的流行無明顯季節(jié)性，山羊一般在冬末春初易感［5-7］。 感染該病的山羊體溫升高，呼吸急促，流黏性或膿性鼻液［5-6］，口、鼻、被毛下皮膚等部位出現(xiàn)丘疹、結(jié)節(jié)或水皰，逐漸擴散到內(nèi)臟，感染后期癥狀嚴(yán)重可致死， 整個病程持續(xù)21～28 d［8］?；疾⊙蜃杂鷮@得終身免疫［9］。

山羊痘在世界各地流行，主要集中于印度、孟加拉國、北美、中非等國家和地區(qū)［10］。近年來，隨著山羊養(yǎng)殖密度的增加， 該病已流行于我國部分地區(qū)，如內(nèi)蒙古、江蘇、貴州、重慶［11-14］。 不同山羊痘病毒毒株的毒力存在差異， 易感羊只的病死率較高，部分羊場羔羊的死亡率為100%［15］。 該病對我國養(yǎng)羊業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展造成威脅， 嚴(yán)重影響羊及其制品的出口。 世界動物衛(wèi)生組織將該病列為報告?zhèn)魅静?，我國也將其列為Ⅰ類動物疫?。?6-17］。

山羊痘病毒是雙股DNA 病毒，分子量約150kb，包含147 個開放閱讀框（ORF）。ORF074 編碼囊膜蛋白P32，該蛋白由319～324 個氨基酸組成，包含1 個重要的抗原決定簇，能刺激機體產(chǎn)生抗體［18］，是亞單位疫苗的首選可溶性蛋白。 P32 基因可作為山羊痘病毒分子生物學(xué)鑒定的靶基因。 該研究通過病理解剖學(xué)觀察、病理組織學(xué)檢查、血清學(xué)檢測以及病原PCR 鑒定方法，對內(nèi)蒙古某規(guī)?；躺窖蝠B(yǎng)殖場部分引進羔羊發(fā)生的疑似山羊痘進行綜合診斷， 以期為該地區(qū)養(yǎng)殖場控制山羊痘的發(fā)生及流行提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 待檢病料

2021 年9 月內(nèi)蒙古某規(guī)模化養(yǎng)殖場部分引進奶山羊羔羊出現(xiàn)精神萎靡、體溫升高、呼吸困難的臨床癥狀，全身皮膚出現(xiàn)紅色疹痘或水皰，鼻腔及眼周圍存在大量膿性分泌物， 疑似山羊痘病毒感染。發(fā)病羔羊無山羊痘病毒疫苗接種史。解剖1只臨床癥狀嚴(yán)重的羔羊，無菌采集血液、肺組織（編號：GTPV-YP1）、鼻拭子（編號：GTPV-YP2）、眼拭子（編號：GTPV-YP3）樣本各1 份，置于-20 ℃車載冰箱，帶回實驗室檢測。

1.1.2 主要試劑

病毒DNA 提取試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限責(zé)任公司；山羊痘病毒抗體高敏熒光檢測試劑盒， 購自成都微瑞生物科技有限責(zé)任公司；采血貯血器，購自三門縣民生醫(yī)藥器材有限公司；山羊痘病毒活疫苗， 購自重慶奧龍生物制品有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

高速離心機（型號：pico 17），賽默飛世爾科技（中國） 有限責(zé)任公司產(chǎn)品； 恒溫水浴鍋（型號：SH-WB-6GDN3）， 韓國三興有限責(zé)任公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床（型號：TS-2112B），上海比朗儀器制造有限責(zé)任公司產(chǎn)品；旋渦振蕩器（型號：VM-10），大韓科學(xué)有限公司產(chǎn)品；PCR 儀（型號：ABI9902）、電泳儀（型號：HE99X）、全自動凝膠成像儀（型號：Type T2A），美國伯樂有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 病理解剖與病理組織切片觀察

解剖發(fā)病山羊， 無菌采集病死羊的肺臟病變樣本，立即用10%福爾馬林固定。病理切片于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心制作。

1.2.2 血清抗體檢測

1.2.2.1 血液采集與血清制備

使用一次性無菌采血器采集病羊頸靜脈血液，標(biāo)記羊耳標(biāo)號， 常溫放置1 h 或37 ℃靜置30 min，然后冷藏保存。 將采集的血液樣本3 000 r/min 離心10 min，取上層清亮液體進行檢測。

1.2.2.2 高敏熒光法檢測山羊痘病毒抗體

試樣加入檢測卡后， 試樣中的山羊痘病毒抗體與標(biāo)記熒光微球的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)， 形成免疫復(fù)合物。該復(fù)合物隨樣液流至檢測線，被包被的特異性抗原捕獲并形成雙抗原夾心免疫結(jié)合物。該結(jié)合物的量與試樣中山羊痘病毒抗體的量正相關(guān)， 經(jīng)高敏熒光免疫分析儀測定結(jié)合物中示蹤物的熒光強度， 即可確定試樣中山羊痘病毒抗體的含量或免疫效價。

試劑盒和血清樣本恢復(fù)至室溫， 取待檢血清10 μL，加入490 μL 的稀釋液，旋渦振蕩器混勻，取80 μL 混勻液加入檢測卡， 避光靜置15 min 上機檢測。 抗體效價≤16，判定抗體保護水平陰性；抗體效價＞16， 判定抗體保護水平陽性；10≤抗體效價＜16，判定抗體保護水平可疑。 檢測抗體效價與山羊痘病毒抗體含量成正比。

1.2.3 山羊痘病毒分子生物學(xué)檢測

1.2.3.1 待檢樣本病毒基因組DNA 提取

在1 份病肺組織中加入約3 倍體積的生理鹽水進行充分勻漿，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，留上清液； 在2 份拭子樣品中加入600 μL 生理鹽水，反復(fù)吹打，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，留上清液；取山羊痘病毒活疫苗懸液、1 份肺組織研磨液、2 份拭子樣品處理液各200 μL， 病毒基因組DNA 提取操作步驟按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒說明書，提取后的病毒基因組DNA 置于-20 ℃保存。

1.2.3.2 P32 基因PCR 擴增及序列分析

根據(jù)參考文獻［19］ 設(shè)計P32 基因PCR 擴增引物，上游引物（GTPV-P32-F ）序列： 5′-CACCGAATTCACCATGGCAGATATCCCATTATAT-3′，下游引物（GTPV-P32-R）序列：5′-GATGGCGGCCG CAACTATATACGTAAATAAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 預(yù)期擴增產(chǎn)物片段大小為983 bp。 以“1.2.3.1”項下提取的山羊痘病毒基因組DNA 作為模板進行PCR 擴增。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 次循環(huán)；72 ℃保持7 min。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：PCR mix 12.5 μL，上游引物（GTPV-P32-F）0.5 μL，下游引物（GTPV-P32-R）0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。 陰性對照以ddH2O 為模板， 陽性對照以提取的山羊痘病毒活疫苗DNA 為模板。 PCR 擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后， 低溫寄送生工生物工程（上海） 股份有限公司測序。 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 模塊進行P32 基因序列比對，利用MegAlign 8.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理學(xué)診斷

2.1.1 病理解剖學(xué)觀察

剖檢可見病羊口腔、鼻腔、喉頭、氣管黏膜有大小不一的圓形疹痘；肺部明顯水腫，伴有卡他性肺炎；肺臟表面存在紅色疹痘，切開后呈不透明、灰白色膠凍樣；瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃黏膜均出現(xiàn)疹痘（見圖1）。

圖1 發(fā)病羔羊臨床癥狀及病理解剖學(xué)特征

2.1.2 病理組織學(xué)檢查

采集發(fā)病羊只肺臟組織， 制作石蠟切片。 經(jīng)HE 染色可見肺泡間質(zhì)變寬，腔內(nèi)存在脫落的上皮細(xì)胞； Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生， 并化生為腺泡樣狀；支氣管腔內(nèi)存在大量的炎性細(xì)胞（見圖2）。

圖2 發(fā)病羊只肺部病理組織切片（HE，100×）

2.2 血清學(xué)診斷

采集的1 份病羊血清經(jīng)山羊痘病毒抗體高敏熒光檢測試劑盒檢測，抗體效價為108，大于16，提示山羊痘病毒抗體檢測呈強陽性。

2.3 分子生物學(xué)診斷

選取3 份臨床樣品及1 份山羊痘病毒疫苗提取基因組DNA，進行P32 基因PCR 擴增，均獲得983 bp 的擴增產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致（見圖3）。 陽性擴增產(chǎn)物測序后，通過BLAST 比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4），并進行同源性分析（見圖5）。 結(jié)果顯示， 肺組織（GTPV-YP1）、 鼻拭子（GTPVYP2）樣本P32 基因序列遺傳關(guān)系密切，處于同一分支， 與山羊痘病毒中國分離株KC951854.1、Oman 分離株MN072621.1 親緣關(guān)系最近，同源性達到100%；GTPV-YP1 和GTPV-YP2 與GTPV-YP3處于不同分支，同源性均為98.7%，且GTPV-YP3與山羊痘病毒中國分離株 EF514892.1、HM572329.1、JN596275.1、MG817382.1 親 緣 關(guān) 系最近，同源性達到99.0%。

圖3 發(fā)病羊只臨床樣本P32 基因PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果

圖4 基于山羊痘病毒P32 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于山羊痘病毒P32 基因的同源性分析

3 討論

山羊痘發(fā)病快、傳染性強、死亡率高，易造成妊娠母羊流產(chǎn)［20］。該病已流行于世界各地，且在我國多個省份流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。雖然養(yǎng)殖場和牧戶定期對羊只進行山羊痘病毒疫苗接種，但該病在局部地區(qū)仍有散發(fā)，可能由于疫苗皮內(nèi)注射操作時出現(xiàn)漏針，未達到免疫效果。

該研究通過臨床癥狀初步確定該場部分羊只疑似感染山羊痘病毒，剖檢可見口腔、鼻腔、喉頭、氣管以及瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃黏膜出現(xiàn)紅色疹痘，為典型的山羊痘癥狀。無菌采集發(fā)病羊只的肺組織、鼻拭子、眼拭子各1 份，通過P32 基因進行山羊痘病毒的分子生物學(xué)鑒定。 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，3 份臨床樣本中的山羊痘病毒P32 基因與野毒感染株屬于同一分支，親緣關(guān)系較近，與疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；3 份臨床樣本與牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒的P32 基因處于不同分支， 但同源性較高，均大于97.7%。 綜合分析，接種山羊痘病毒疫苗可能會有效預(yù)防結(jié)節(jié)性皮膚病， 有望用于結(jié)節(jié)性皮膚病的防控。

據(jù)了解，該場發(fā)病羔羊從主產(chǎn)區(qū)引進，經(jīng)長途調(diào)運至該場飼養(yǎng)，因群體由不同養(yǎng)殖戶收購后合群，部分羊只的山羊痘病毒疫苗基礎(chǔ)免疫情況并不確定，再加上綜合應(yīng)激因素導(dǎo)致群發(fā)。 因此，調(diào)運前加強免疫和抗體監(jiān)測預(yù)警可有效預(yù)防該病發(fā)生。

4 結(jié)論

經(jīng)病理解剖學(xué)觀察、病理組織學(xué)檢查、血清學(xué)檢測以及病原PCR 鑒定，確定引起該場引進奶山羊羔羊發(fā)病的原因為山羊痘病毒感染。