小麥麩皮粗多糖的基本結構特征、流變特性及其對體外消化酶抑制初探

王 鑫，陳什康，張 婷，柳芳偉，宋蕭蕭，殷軍藝

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

小麥麩皮是小麥加工過程中的主要副產(chǎn)物，約占谷物總重量的14%～19%[1]，具有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，每年產(chǎn)量可達3000萬噸以上。因原料價格低廉，主要用于豬飼料加工，很少用于食品深加工和再利用。小麥麩皮作為一種重要的膳食纖維來源，其主要活性物質(zhì)是非淀粉多糖，包括阿拉伯木聚糖(52%～70%)、纖維素(20%～24%)和β-葡聚糖(6%)[1]。相對于β-葡聚糖，阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan,AX)因其溶解性較低，結構復雜多樣，且易與其他細胞壁組分如蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、木酚素等相互作用，研究更為復雜，AX的深入研究對小麥麩皮的加工與利用有著重要的意義。

AX廣泛存在于谷物細胞壁中，是谷物細胞壁的重要組成成分，具有降血糖血脂[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和保護腸道[7]等生物活性，特別是緩解肝臟損傷以及促進腸道中益生菌的數(shù)量增長[8]。多糖的結構特征對其生物活性有著重要影響，包括分子量、單糖組成、連接方式、聚合度以及分支程度等[8]。此外，不同提取方式對多糖的結構特征有重要影響，AX的提取方式主要有熱水浸提、酶法提取與堿提法。AX通常以結合態(tài)的形式與蛋白質(zhì)和纖維素連接，不易提取，堿溶劑可以斷裂AX與細胞壁其他成分之間的酯鍵和氫鍵，釋放水相半纖維，除去糖醛酸和乙?；?，將分子間牢固的共價結合打斷，故堿液常用來提取小麥麩皮、米糠、玉米皮等谷物中的AX[10]。AX是以β-(1→4)糖苷鍵連接的D-吡喃木糖殘基為主鏈，α-1,2和α-1,3糖苷鍵連接的α-L-阿拉伯呋喃木糖基為側(cè)鏈連接而成的多糖，如圖1所示，A/X代表AX的支鏈化程度，表示AX中阿拉伯糖基無規(guī)則的連接在木聚糖主鏈上，A/X值越大代表支鏈化程度越高。

圖1 阿拉伯木聚糖的結構示意圖[11]Fig.1 Structural diagram of Arabinoxylan[11]

有研究表明，不同植物來源多糖具有不同的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性[12]。袁平川等[13]人研究發(fā)現(xiàn)牛蒡水提多糖具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活性，且動物實驗也表明具有量好的降血糖活性。因此，體外消化酶抑制實驗的研究有助于從食品角度開發(fā)降血糖產(chǎn)品。

目前，關于小麥麩皮阿拉伯木聚糖(Wheat bran arabinoxylan,WBAX)提取與結構分析的研究有很多，但基于黏度分析與體外消化酶抑制研究較少，同時，WBAX具有很好的降血糖功能，但其降血糖功能是否是通過抑制消化酶活性進而調(diào)節(jié)血糖目前尚未可知，因此，本研究旨在研究小麥麩皮阿拉伯木聚糖基本特征、流變特性、熱穩(wěn)定性和體外消化酶抑制，為今后相關研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮購于陜西省延安市，購買后再次干燥密封保存。

耐高溫α-淀粉酶和胰蛋白酶購于阿拉丁試劑有限公司；單糖標準品(L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、木糖、D-果糖、D-核糖、L-巖藻糖、D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)購于美國Sigma-Aldrich公司；不同分子量的葡聚糖標準品(T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000)購于美國Pharmacia公司；考馬斯亮藍G-250購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

E2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Dionex ICS 5000離子交換色譜儀、Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀、高速冷凍離心機、低溫保存箱，美國賽默飛世爾科技公司；Milli-Q超純水儀，美國密理博公司；ARES-G2型流變儀，美國TA公司；JSM 6701F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(配有能譜儀)，日本電子株式會社；T-9普析通分光光度計，北京普析通用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WBAX的制備

參考黎芳[14]的方法提取多糖，稍作修改。稱取一定量小麥麩皮經(jīng)82%乙醇溶液(料液比為1:10，m:v)于室溫條件下浸泡24 h，冷卻后揮干乙醇得到小麥麩皮，再將小麥麩皮轉(zhuǎn)移至水中(料液比為1:10，m:v)并于52 ℃進行提取(2 h，重復3次)，冷卻后離心(4800 r·min-1,10 min)，收集固體殘渣，乙醇洗脫后烘干，得到脫脂小麥麩皮。將脫脂小麥麩皮置于0.5 mol NaOH溶液中(料液比為1:10，m:v)，60 ℃勻速攪拌2 h，離心分離(4800 r·min-1,10 min)后，收集上層清液用1 M HCl調(diào)節(jié)pH值至7，加入耐高溫α-淀粉酶(1%,w/w,酶活力：10萬 u·mL-1)于95 ℃下酶解3 h，離心分離混合液，收集上層清液，旋蒸濃縮后用95%乙醇進行沉淀，使其終濃度為80%，4 ℃靜置12 h，離心收集多糖沉淀(10000 r·min-1,10 min)，復溶旋蒸后采用蒸餾水于4 ℃下透析72 h，冷凍干燥得到WBAX。

1.3.2 基本化學組成分析

本研究多糖WBAX以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法測定中性糖含量[16]；以半乳糖醛酸為標準品，采用硫酸-咔唑法測定糖醛酸的含量[15]；以牛血清蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法測定總蛋白的含量[17]；采用Megazyme Tolal Srarch試劑盒中的AOAC official Method 996.11的方法測定淀粉含量。

1.3.3 均一性相對分子質(zhì)量測定

采用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)對WBAX的均一性及相對分子質(zhì)量進行分析。準確稱取適量樣品，將多糖樣品用0.02%的NaCl水溶液完全溶解配置成1 mg·mL-1的糖溶液，過0.22 μm水系濾膜后進樣檢測。同時，以Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000和Glc為標準品繪制標準曲線來計算樣品的相對分子質(zhì)量。

色譜條件：色譜柱采用UltrahydrogelTM保護柱(6 mm×40 mm)和UltrahydrogelTM線性凝膠柱(7.8 mm×300 mm)聯(lián)用；檢測器為示差檢測器(RID,2414)和紫外檢測器(VWD,2489)聯(lián)用，紫外波長設為280 nm；柱溫為35 ℃；流速為0.6 mL·min-1；進樣體積20 μL；數(shù)據(jù)采集時間為30 min。

1.3.4 單糖組成分析

單糖組成的方法參考以前的相關研究進行了一些修改[18]。采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(HPAEC-PAD)測定單糖組成。準確稱取5 mg多糖樣品，于冰浴條件下加入0.5 mL 12 mol·L-1硫酸溶液，攪拌30 min后，加入2.5 mL去離子水稀釋，然后轉(zhuǎn)移至100 ℃油浴鍋中并攪拌水解2 h。水解完全后進行充分冷卻，將水解液定容至50 mL容量瓶并稀釋5倍，過0.22 μm水系濾膜后進Dionex ICS 5000離子交換色譜系統(tǒng)進行檢測。

色譜條件：采用Dionex Carbo Pac PA20分析柱(3×150 mm)和Dionex Carbo Pac PA20保護柱(3×30 mm)串聯(lián)使用；采用三元梯度洗脫，流動相A、B、C分別為250 mmol·L-1NaOH溶液、超純水、1 mol·L-1NaOAc和10 mmol·L-1NaOH溶液混合液，流速為0.5 mL·min-1；柱溫為30 ℃，系統(tǒng)溫度25 ℃，進樣體積10 μL。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

將多糖樣品置于真空干燥12 h以上，取經(jīng)干燥的1～2 mg多糖樣品與KBr粉末研磨混合壓片，采用Thermo Nicolet 5700 FT-IR傅里葉紅外光譜儀在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進行掃描，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 WBAX表觀黏度分析

將WBAX樣品充分溶解于去離子水中，磁力攪拌均勻后靜置12 h以上。測定不同濃度(1%,2%,3%,4%和5%，w/v)和不同溫度(5 ℃,15 ℃,25 ℃,35 ℃,45 ℃和55 ℃)下流體類型和穩(wěn)定流動行為。用ARES-G2流變儀測定多糖的表觀黏度(夾具直徑為40 mm，間隙為0.046 mm)，剪切速率為0.1～1000 s-1測試。設有平行實驗，平行測定3次。

1.3.7 熱穩(wěn)定性分析

稱取適量樣品放入熱重分析儀中進行測試，分析不同溫度處理多糖的熱穩(wěn)定性。測試條件：掃描溫度：20 ℃～600 ℃；升溫速度：10 ℃/min；N2流速：20 mL·min-1。

1.3.8 固體形貌分析

稱取一定量的多糖樣品，將樣品配制成0.5 mg·mL-1的溶液，充分溶解后于液氮中預凍10 min，立刻轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱，冷凍干燥得到多糖樣品，噴金后于掃描電鏡下觀察，通過XT Microscope Control軟件采集圖譜。

1.3.9 體外消化酶抑制效果初探

1.3.9.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參考李安琪[19]等的方法并進行適當修改。于96孔板中加入40 μL樣品或陽性對照阿卡波糖，加入α-葡萄糖苷酶20 μL，于恒溫搖床中37 ℃孵育5 min后，加入50 μL底物，于恒溫搖床中37 ℃孵育60 min，結束后加入50 μL碳酸鈉溶液即可終止反應，于405 nm處測定吸光度值。A-葡萄糖苷酶抑制試驗重復3次，抑制率計算公式如下：

式中：A1,A2,A3和 A4分別為405 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.3.9.2 α-淀粉酶抑制活性測定

參考Sun[20]等的方法并進行部分修改。于0.5 mL凍存管中加入25 μL樣品或陽性對照阿卡波糖，加入耐高溫的α-淀粉酶25 μL，于恒溫搖床中37 ℃孵育10 min后，加入25 μL底物，于恒溫搖床中37 ℃孵育10 min，加入25 μL顯色劑DNS，沸水浴5 min，冷卻至室溫，反應液用蒸餾水稀釋2.5倍，于540 nm處測定吸光度值。抑制率計算公式如下：

式中：A1、A2、A3和 A4分別為540 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

樣品進行平行測定3次，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對獨立樣本進行單因素方差分析，采用Tukey法進行兩兩比較，P<0.05認為數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。

2 結果分析

2.1 WBAX基本理化性質(zhì)

對WBAX的基本理化性質(zhì)進行分析，結果如表1所示。由表可知，小麥麩皮阿拉伯木聚糖的中性糖含量為83.4%，整體的純度較高。

表1 小麥麩皮阿拉伯木聚糖WBAX基本理化分析(平均值±標準偏差，n=3)Tab.1 Physicochemical properties of WBAX (mean±SD,n=3)

2.2 相對分子質(zhì)量

采用HPGPC測定多糖的相對分子質(zhì)量。多糖的相對分子量Mw與分配系數(shù)Kαv存在如下關系：

Kav=-blogMw+C(式中b、C為常數(shù))

以T-2000、T-500、T-70、T-50、T-10的葡聚糖以及Glc標準品為標樣，得到標準曲線方程為Kav=-0.242 0 logMw+1.5642，R2=0.993 6。

如圖2所示，WBAX具有較寬的相對分子量分布，出現(xiàn)兩個明顯的洗脫峰Peak-Ⅰ和Peak-Ⅱ，且Peak-Ⅰ的含量比Peak-Ⅱ更高，根據(jù)不同組分的保留時間，依據(jù)葡聚糖標準曲線方程求得兩個峰的相對分子質(zhì)量分別為112和51 kDa，這個結果與Lv[12]等所報道的堿提小麥麩皮阿拉伯木聚糖分子量基本一致(107 kDa)，但不同種屬和產(chǎn)地均會造成不同差異。

t/min圖2 WBAX高效凝膠滲透色譜Fig.2 HPGPC profiles of WBAX

2.3 單糖組成分析

單糖組成結果如表2所示，WBAX中主要為阿拉伯糖和木糖，含量分別為30.3%和37.8%，另有極少量的葡萄糖(1.6%)、半乳糖(2.8%)、葡萄糖醛酸(1.9%)和半乳糖醛酸(0.5%)。阿拉伯糖與木糖的摩爾比(A/X)為0.8，代表了阿拉伯木聚糖高度支化[21]。Revanappa[11]等人研究發(fā)現(xiàn)不同來源小麥麩皮中阿拉伯木聚糖的分支程度有較大差異，A/X值分別為1.16，1.14，0.80，0.65，且A/X的大小主要取決于小麥麩皮的種類和來源以及提取方法[22,23]。通常，堿法提取得到的多糖的A/X值高于熱水提取法得到的A/X值[24]。

表2 小麥麩皮阿拉伯木聚糖WBAX的單糖組成(平均值±標準偏差，n=3)Tab.2 Monosaccharide copmpositions of WBAX (mean±SD,n=3)

2.4 紅外光譜分析

WBAX的紅外光譜如圖3所示，WBAX在3400和2924 cm-1處有明顯的吸收峰，分別為多糖羥基的伸縮振動峰[25-26]和甲基或亞甲基碳氫的伸縮振動峰[27]；1411 cm-1處的吸收峰為C-H的彎曲振動，由此推斷WBAX是糖類化合物[27]。1044 cm-1處的吸收峰為阿拉伯木聚糖的典型特征峰，上述結果表明，WBAX為典型的阿拉伯木聚糖[29]。

λ/cm-1圖3 WBAX傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of WBAX

2.5 表觀黏度分析

2.5.1 質(zhì)量分數(shù)對WBAX表觀黏度的影響

WBAX的表觀黏度隨剪切速率的變化如圖4所示，WBAX是典型的非牛頓流體[30]，具有剪切變稀的流體行為，這種現(xiàn)象歸因于多糖的隨機線圈的形成。當剪切速率增加時，多糖的分子鏈被破壞，導致分子鏈的取向變得更加隨機[31]，因此相鄰鏈之間的相互作用減少，從而降低了黏度[32]。除此之外，隨著多糖質(zhì)量分數(shù)的增加，表觀黏度逐漸增加，說明其表觀黏度和流體行為受多糖濃度的影響[33]，主要由于多糖濃度增加時，多糖的分子數(shù)量及分子間強度增大[34]。

Shear rate/s-1圖4 質(zhì)量分數(shù)對WBAX的表觀黏度的影響Fig.4 The effect of polysaccharide concentration on apparent viscosity of WBAX

2.5.2 溫度對WBAX表觀黏度的影響

由圖5可知，當溫度變化時，4%的多糖溶液均為具有剪切稀化的非牛頓流體[30]。多糖的表觀黏度隨溫度的升高而降低，由于分子的動力學運動隨溫度的升高而更加活躍，從而促進了多糖鏈的解纏，分子間相互作用力減弱，因此導致樣品黏度降低[35]。

Shear rate/s-1圖5 溫度對4% WBAX的表觀黏度的影響Fig.5 The effect of temperature on apparent viscosity of 4% WBAX

2.6 熱穩(wěn)定性分析

圖6是小麥麩皮阿拉伯木聚糖的熱解失重曲線。多糖中存在大量的親水基團，可以吸附一定的水量，當溫度升高時，水分蒸發(fā)，使得多糖樣品質(zhì)量有所減少[36]。30 ℃～132 ℃是WBAX熱解過程中的失水階段，質(zhì)量損失緩慢，約為3.8%；第二階段為熱解準備階段(132 ℃～244 ℃)，失重率變化很小，約為3.2%；當溫度在306 ℃時，有明顯的失重臺階，失重率超過42.7%，表明樣品在本階段受熱大量分解，生成揮發(fā)性物質(zhì)，導致質(zhì)量發(fā)生明顯下降；第四階段為碳化階段(306 ℃～600 ℃)，由于碳的熱分解作用，使其質(zhì)量逐漸降低。結果表明，WBAX在30 ℃～132 ℃溫度范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，可用于高溫加工的食品中。

T/℃圖6 WBAX的TG圖Fig.6 Termal gravimetric spectrum of WBAX

2.7 SEM表征

為了獲取多糖的固體形貌，采用掃描電鏡的方法獲取不同放大倍數(shù)下WBAX的表觀形貌。圖7為放大5000倍(A)和10000倍(B)的WBAX的SEM圖。由圖7可知，WBAX主要存在片狀、球狀和絲狀等結構。

(a) 5 000×

(b) 10 000×圖7 WBAX的SEM圖Fig.7 SEM images of WBAX

2.8 體外消化酶抑制效果分析

2.8.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

圖8為陽性對照阿卡波糖及WBAX對α-葡萄糖苷酶的抑制率折線圖。由圖可知，陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率曲線平滑，抑制率隨濃度的增大而增大，呈現(xiàn)較強的規(guī)律性，運用SPSS軟件計算其IC50(抑制率為50%時抑制劑的濃度)值為9.99 mg·mL-1，而WBAX對α-葡萄糖苷酶的活性有較弱的抑制效果，抑制率與多糖濃度關系的規(guī)律性不明顯[19]。

ρ/(mg·mL-1)圖8 阿卡波糖及WBAX對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果Fig.8 Inhibitory effect of acarbose and WBAX on α-glucosidase activity

2.8.2 α-淀粉酶抑制活性測定

圖9為陽性對照阿卡波糖和多糖WBAX對α-淀粉酶抑制率的折線圖。由圖可知，陽性對照阿卡波糖對α-淀粉酶抑制率曲線平滑，具有較強的規(guī)律性，抑制率隨阿卡波糖濃度的增加而增大，其IC50為0.43 mg·mL-1。WBAX對α-淀粉酶的抑制率有一定的規(guī)律性，但較陽性對照阿卡波糖相比，抑制能力有限。有研究表明，小麥麩皮阿拉伯木聚糖具有降血糖活性，AX可通過促進胰島素的分泌，上調(diào)脂肪磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的表達，促進線粒體脂肪酸氧化以及脂肪組織對葡萄糖的利用來降低血糖[37]。多糖的降血糖活性機制涉及多個方面，并不是簡單的消化酶抑制。因此，與本研究結果結合，小麥麩皮阿拉伯木聚糖可能是從多個方面調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝，而不是簡單地通過抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性來達到對血糖的調(diào)控[38]。

ρ/(mg·mL-1)圖9 阿卡波糖及WBAX對α-淀粉酶活性的抑制效果Fig.9 Inhibitory effect of acarbose and WBAX on α-amylase activity

3 結論

本研究以WBAX為研究對象，系統(tǒng)研究了其基本結構特征、流變特性及體外消化酶抑制活性。結果表明，WBAX是以阿拉伯糖(30.3%)和木糖(37.8%)為主的非淀粉類中性糖，且具有較高的支化度(A/X=0.8)；流變結果表明，WBAX的表觀粘度隨剪切速率的增大而減小，是典型的非牛頓流體，且隨著溫度的增加，表觀黏度逐漸降低；熱穩(wěn)定性結果表明，WBAX在30 ℃～132 ℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，可為產(chǎn)品熱加工提供數(shù)據(jù)支撐。同時，由體外消化酶抑制實驗分析結果可知，WBAX對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較弱，規(guī)律性不明顯，α-淀粉酶抑制率曲線平滑，有較強的規(guī)律性，但抑制效果有限，可能由于多糖純度、糖含量、單糖組成、分子質(zhì)量等不同所導致。由于多糖結構的復雜性，WBAX的結構與活性之間的構效關系尚不清楚。因此，WBAX的特定結構和構象對其生物活性的影響研究成為重點，同時本研究可為WBAX深加工以及WBAX降血糖活性機制研究提供理論依據(jù)。