鎘脅迫下梭魚草葉片轉(zhuǎn)錄組測序及苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因挖掘

辛建攀 李燕 趙楚 田如男

（南京林業(yè)大學風景園林學院，南京 210037）

工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展、生活污水的不合理排放及化石燃料燃燒等導致我國城鄉(xiāng)水體被重金屬污染，妨礙了水資源的利用。鎘（Cd）是污染水體中常見的重金屬污染物之一，分布廣泛、難降解，具有極強的生物毒性，能夠通過食物鏈積累與生物放大作用威脅人類及其他水生生物健康［1］。與物理、化學方法相比，植物修復技術(shù)因環(huán)境干擾小、二次污染易控制及成本低等優(yōu)勢而備受關(guān)注，被認為是當前重金屬污染環(huán)境修復領(lǐng)域的研究熱點之一。耐性植物種類的選擇是Cd污染水體進行植物綠色修復的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)之一。因此，深入研究植物防御Cd脅迫的分子機制可以為植物修復Cd污染提供理論參考。

梭魚草（Pontederia cordata）屬雨久花科（Pontederiaceae）梭魚草屬（Pontederia）多年生觀賞濕地植物，其根系發(fā)達、生物量大，頂生穗狀花序，小花藍紫色，具有很高的園林觀賞價值，是構(gòu)建人工濕地植被的優(yōu)良材料。該植物不但可以有效去除水體氮、磷［2-4］，并抑制藻類生長［5-6］，而且還能夠有效去除水體Cd、銅及鉛等重金屬［7-10］。研究表明，根系富集、細胞抗氧化還原系統(tǒng)的調(diào)控活性、非蛋白巰基肽含量等因素與梭魚草Cd脅迫耐性密切相關(guān)［10-12］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Cd能夠在轉(zhuǎn)錄水平上明顯改變梭魚草葉片中黃酮、類黃酮及花青素等次生代謝物生物合成相關(guān)基因的表達模式，同時一些差異表達基因顯著富集到苯丙烷代謝途徑，相似的結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)于重金屬脅迫下的杞柳（Salix integra）［13］和旱柳（S. matsudana）［14］等多種植物，表明苯丙烷代謝途徑參與梭魚草Cd脅迫響應。

苯丙烷代謝途徑是植物次生代謝途徑中的重要分支之一，是多數(shù)防御性次生代謝物（如黃酮類、木質(zhì)素及水楊酸等）的主要來源，能夠有效減緩細胞中活性氧的積累，避免細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理代謝功能被破壞，因此該途徑與植物非生物脅迫耐性密切相關(guān)［15-18］。鑒于此，本研究利用Illumina Hiseq測序平臺對Cd脅迫下梭魚草葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，并進一步挖掘苯丙烷代謝途徑中相關(guān)基因，為今后深入研究苯丙烷代謝途徑參與梭魚草防御重金屬植物毒性的分子機制奠定理論基礎(chǔ)，同時也為梭魚草在修復重金屬污染水體中的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

梭魚草根狀莖的萌蘗生長約2個月后，于5月份選取長勢一致、健康的植株（株高45-50 cm）并沖洗干凈，然后移植于盛有2 L 1/2 Hoagland營養(yǎng)液的塑料桶中進行適應性培養(yǎng)。每桶1株，共25株，培養(yǎng)周期為20 d，期間適時補充營養(yǎng)液至初始體積。適應性培養(yǎng)結(jié)束后，利用0.44 mmol/L Cd2+對植株脅迫處理，于0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h時采取植株頂端成熟葉片用于轉(zhuǎn)錄組測序，每個時間點設(shè)置3次生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 文庫構(gòu)建與Illumina HiSeq測序 采用Trizol試劑盒提取各時間點葉片總RNA，利用NanodropND 2000檢測RNA純度，同時使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA nano 6000分析試劑盒精確檢測RNA完整性。葉片RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。庫檢合格后，將cDA文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina HiSeq測序。

1.2.2 組裝和功能注釋 為了確保轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及生物信息學的分析質(zhì)量，對測序得到的原始序列（raw reads）進行處理，（1）去除含有接頭（adapter）的reads；（2）去除N（無法確定堿基信息）比例大于10%的reads；（3）去除低質(zhì)量reads。采用Trinity對過濾獲得clean reads進行拼接，從而獲取后續(xù)生物信息學分析的參考序列［19］。

基因功能注釋采用七大數(shù)據(jù)庫：NR（NCBI non-redundant protein sequences）、NT（NCBI non-redundant nucleotide sequences）、PFAM（portein family）、KOG（eukaryotic ortholog groups）、Swiss Prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GO（gene ontology）。

1.2.3 基因表達量分析 根據(jù)Li等［20］的方法對reads和unigenes的比對結(jié)果進行統(tǒng)計，獲得每個樣品比對到每個基因上的readcount數(shù)目，并對其進行FPKM（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）轉(zhuǎn)換。采用DEGseq軟件進行差異基因篩選，差異基因的篩選條件為：表達差異倍數(shù)|log2fold change|＞1［fold change=SDt/CK，其中SDt為取樣時間點，CK為對照組（0 h）］，顯著性P-value＜0.05。同時，結(jié)合KEGG代謝通路分析，本研究對0 h、6 h、48 h時梭魚草葉片苯丙烷代謝途徑相關(guān)差異基因進行挖掘，從轉(zhuǎn)錄水平上判定梭魚草葉片響應Cd脅迫的動態(tài)變化過程。

1.2.4 差異表達基因的趨勢化分析 根據(jù)Ernst&Bar-Joseph的方法［21］，利用STEM（short time-series expression miner）軟件（設(shè)置P≤0.05為差異顯著的表達模式）對Cd脅迫下各時間點的差異表達基因進行趨勢分析。

1.2.5 編碼區(qū)序列（coding sequence，CDS）預測 按照Swiss-Prot和Nr蛋白庫的優(yōu)先級順序，將梭魚草葉片轉(zhuǎn)錄組unigenes進行Blast比對。從比對上的序列中提取出transcript開放閱讀框（open reading frames，ORF），并將CDS序列翻譯成氨基酸序列。未比對上或比對上未預測出結(jié)果的序列則采用Estscan（3.0.3）預測其ORF，根據(jù)CDS序列翻譯獲得氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝

本研究共建立了21個cDNA文庫，得到了970 961 618個raw reads。經(jīng)過嚴格的數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)量評估，共得到926 875 418個clean reads。所有錯誤率均低于0.10%，且GC值介于53.54%-54.41%。同時，不低于97.00%的clean reads在Q20水平上有較高分數(shù)；不低于93.00%的clean reads在Q30水平上有較高分數(shù)。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)生物信息分析。最后，共得到221 392個高質(zhì)量的unigenes，其總長度為388 100 176 bp，平均長度為1 753 bp，最大長度為25 638 bp，最小長度為201 bp。轉(zhuǎn)錄本和unigenes的長度分布見 （表1）。

表1 拼接轉(zhuǎn)錄本和unigenes的長度分布Table 1 Length distribution of assembled transcripts and unigenes

2.2 基因注釋和功能分類

為了對這些組裝的unigenes進行驗證和功能注釋，所有unigenes以臨界值小于1e-5比對到7個數(shù)據(jù)庫（表2）。在221 392個unigenes中，158 229個 （占總數(shù)的71.47%）unigenes和121 487個（占總數(shù)的54.87%）unigenes分別比對到NR和SwissProt，這兩個數(shù)據(jù)庫具有最多的unigenes注釋。

表2 梭魚草葉片unigene功能注釋Table 2 Unigene annotation of P. cordatas leaves

通過與NR比對注釋，可以獲取梭魚草基因序列與近緣物種基因序列的相似性。如圖1所示，梭魚草與小果野芭蕉（Musa acuminata）基因序列相似度最高（31.50%），其次是棕櫚（Elaeis guineensis）（19.70%）、海藻（Phoenix dactylifera）（15.80%）、菠 蘿（Ananas comosus）（6.60%）及 蘆 筍（Asparagus officinalis）（2.40%），它們均為單子葉植物。

圖1 Unigene的NR比對同源性分析Fig.1 Sequence homology of the unigenes against NR database

在所有的unigenes中，共有98 391個unigenes（44.44%）被注釋到GO。GO可以分為3個本體，包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）與 分 子 功 能（molecular function，MF）。其中，共有270 742個unigenes被分到25個BP功能組，175 020個unigenes被分到20個CC功能組，125 388個unigenes被分到10個MF功能組（圖2）。在BP中，前3個功能組分 別 為“cellular process”“metabolic process”“single-organism process”，占該組unigenes總數(shù)的比例分別為22.06%、20.08%和16.16%。在CC中，共有19.17%、19.17%、12.90%、12.56%、11.10%、10.24%、7.00%的unigenes被分別歸類為“cell”“cell part”“organelle”“macromolecular complex”“membrane”“membrane part”“organelle part”。在MF中，最前面的兩個亞類分別為“binding”（45.87%）和“catalytic activity”（36.66%），其比例明顯高于其他亞類，如“antioxidant activity”（0.39%）和“metallochaperone activity”（0.03%）。

圖2 Unigenes在GO 分類下一層級的分布Fig.2 Distribution of unigenes to GO level 2

與KOG分類相關(guān)的注釋序列可用來評價轉(zhuǎn)錄文庫的完整性和注釋過程的有效性。共有49 597個unigenes歸屬于KOG分類（圖3）。在這25個KOG類別中，最大組為“posttranslational moification，protein turnover，chaperones”，其unigenes數(shù)量為6 827個（13.76%），其 次 是“general function prediction only”（13.00%）、“translation，ribosomal structure and biogenesis”（9.22%）和“signal transduction mechanis- ms”（7.96%）。然而，“cell motility”和“extracellular structures”是最小功能組，其unigenes數(shù)量占比分別為0.06%和0.09%。

圖3 Unigenes的KOG功能注釋分布情況Fig.3 Distribution of unigenes for KOG functional annotation

以padj＜0.05且|log2foldchange|＞1為篩選閾值，利用DESeq2將所有unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對分析。在221 392個unigenes中，共有54 087個unigenes明顯匹配到該數(shù)據(jù)庫中，并被分為19個KEGG途徑。這些途徑包括5個亞組，依次是“metabolism”“genetic information processing”“cellular processes”“environmental information processing”“organismal systems”，其所含的unigenes數(shù)量分別為31 186個（57.66%）、14 268個（26.38%）、3 621個（6.70%）、2 582個（4.77%）、2 430個（4.49%）（圖4）。

圖4 Unigenes的KEGG功能注釋的分布情況Fig.4 Distribution of unigenes for KEGG functional annotation

2.3 差異表達基因的趨勢分析

如圖5所示，Cd脅迫期間梭魚草葉片差異基因（20 025個）的表達模式可以分為6種。其中，豐度最大的表達模式是Cluster 3，共有5 832個差異表達基因表現(xiàn)出一致的表達趨勢，在Cd脅迫3 h、12 h和24 h時，這些基因均上調(diào)；在1 h、6 h和48 h時維持在初始水平。Cluster 5的豐度次之，該模式中共有3 733個差異表達基因富集；與0 h相比，Cd處理1-48 h時差異基因均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，并具有較高的表達量，其可能在梭魚草應對Cd脅迫中具有重要作用。Cluster 1由3 153個差異表達基因組成，這些基因（除48 h外）的表達量均低于初始水平。Cluster 2共由2 642個差異表達基因組成，這些基因在Cd處理6 h、12 h和24 h時維持在初始水平，而在其他時間點的表達均下調(diào)。Cluster 0共由2 631個差異表達基因，其隨著各處理時間的延長呈下調(diào)趨勢。Cluster 4模式中差異表達基因數(shù)量最少，這些基因在12 h和24 h時維持在初始水平，而在其他時間點均上調(diào)表達。

圖5 Cd脅迫下梭魚草葉片差異基因的表達趨勢Fig.5 Tendency graphs of differentially expressed genes in P. cordata’s leaves with cadmium exposure

2.4 梭魚草響應Cd脅迫過程中葉片次生代謝物合成途徑相關(guān)酶的鑒定

如表3所示，Cd脅迫下梭魚草葉片unigenes參與苯丙素、萜類化合物骨架、類固醇、類黃酮、花青 素、玉米素及油菜素內(nèi)酯等生物合成相關(guān)的31個次生代謝通路。其中，苯丙素生物合成（ko00940）代謝通路中unigenes數(shù)量最多，為696條；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（ko00280）、萜類化合物骨架生物合成（ko00900）、類胡蘿卜素生物合成（ko00906）代謝通路中的unigenes數(shù)量依次次之。參與油菜素內(nèi)酯生物合成（ko00905）、二萜生物合成（ko00904）、咖啡因代謝（ko00232）、花青素生物合成（ko00942）、甜菜紅堿生物合成（ko00965）、異黃酮生物合成（ko00943）及吲哚生物堿生物合成（ko00901）等代謝通路的unigenes數(shù)量較少。

表3 Cd脅迫下梭魚草葉片轉(zhuǎn)錄組unigenes次生代謝KEGG通路注釋Table 3 Unigenes for KEGG pathway annotation involved in the secondary metabolites in the leaves of P. cordata with cadmium exposure

2.4.1 木質(zhì)素生物合成相關(guān)的差異表達基因 木質(zhì)素單體生物合成代謝通路首先是莽草酸生物合成代謝通路，其次是經(jīng)苯丙氨酸經(jīng)脫氨基、甲基化、羥基活化等過程的苯丙烷代謝途徑，然后是對羥基肉桂酸及其輔酶A脂類化合物氧化還原為木質(zhì)素單體，最后強化脫氫聚合生成木質(zhì)素，此過程涉及到苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、查耳酮合酶（CHS）、過氧化物酶（POD）、肉桂酸脫氫酶（CAD）及咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）等多種酶的參與。在6_0 h組中，編碼對-羥基苯基丙烷此類型木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶共有3個，包括1條4CL序列（Log2fold change=-9.48）、POD序列（Log2fold change=2.71）及CAD序列（Log2fold change=-5.87）（圖6）。在48_0 h組中，梭魚草葉片中與愈創(chuàng)木基木質(zhì)素生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶共有2個，包括3條C4H序列（Log2fold change=5.22-7.89）和1條CSE序列（Log2fold change=2.26）。在48_6 h組中，梭魚草葉片中編碼愈創(chuàng)木基木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶共有5個，包括2條PAL序列（Log2fold change=5.22；6.17），1條咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）序列（Log2fold change=3.93），6條C4H序列（Log2fold change=6.19-7.84），1條CSE序列（Log2fold change=2.26）及4條4CL序列（Log2fold change=2.23-9.69）（表4）。

圖6 Cd脅迫下梭魚草葉片木質(zhì)素與黃酮類化合物生物合成途徑Fig.6 Lignins and flavonoids biosynthesis pathways in the leaves of P. cordata with cadmium exposure

2.4.2 黃酮類生物合成相關(guān)的差異表達基因 黃酮類化合物是一類含有C6-C3-C6基本結(jié)構(gòu)骨架的化合物，起源于苯丙烷代謝途徑，涉及到查耳酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、二氫黃酮3-羥化酶（F3H）等多種酶。在6_0 h組中，梭魚草葉片中編碼黃酮類生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶僅有1個，為二氫黃酮3-羥化酶（F3H）（Log2fold change=-2.59）。在48_0 h組中，梭魚草葉片中編碼黃酮類化合物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶有3個，包括3條C4H序列（Log2fold change=5.22-7.89）、1條 黃 酮 醇3-O-甲 基 轉(zhuǎn)移酶（F3OMT）序列（Log2fold change=4.39）和1條（類黃酮-3，5′羥化酶）F3′ 5′H序列（Log2fold change=-2.29）。在48_6 h組中，梭魚草葉片中編碼在黃酮類化合物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶有5個，包括6條C4H序 列（Log2fold change=6.19-7.84），1條咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）序列（Log2fold change=3.93），1條花青素合酶（ANS）序列（Log2fold change=8.73），1條IFS序列（Log2fold change=-3.67）及3條花青素-3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶序列（3GT）（Log2fold change=3.13-10.90）（表4）。

表4 Cd脅迫下梭魚草葉片中編碼木質(zhì)素與黃酮類生物合成相關(guān)酶的unigenesTable 4 Unigenes enconding enzyme involved in lignin and flavonoid biosynthesis in the leaves of P. cordata with cadmium exposure

2.5 CDS序列分析

如圖7和圖8所示，隨著序列長度的增加，unigene數(shù)量呈減少趨勢。梭魚草葉片unigenes通過Blast比對得到168 355條CDS序列。其中，其中長度介于101-1 000 nt的序列有124 583條，占總數(shù)的74.00%；長度介于1 001-2 000 nt的序列有32 375條，占總數(shù)的19.23%。同時，未比對上unigenes則通過Estscan軟件預測其ORF，共得到84 673條序列，其長度介于50-13 530 nt。如圖7所示，CDS序列長度主要集中在50-900 nt之間，共有80 634條，占比為84.32%。

圖7 Cd脅迫下梭魚草葉片所有unigenes的Blast分析CDS長度分布Fig.7 Blast CDS length distribution of unigenes in the leaves of P. cordata with cadmium exposure

圖8 Cd脅迫下梭魚草葉片所有unigenes的Estscan分析CDS長度分布Fig.8 Estscan CDS length distribution for transcriptome in the leaves of P. cordata with cadmium exposure

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序為研究重金屬脅迫下植物細胞生理代謝途徑和挖掘抗逆基因等提供了豐富信息。本研究通過對Cd脅迫下梭魚草葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了221 392條高質(zhì)量的unigenes，其中共有170 175個unigenes被成功注釋到數(shù)據(jù)庫中，但仍有23.13%的unigenes沒有獲得比對結(jié)果，這可能與序列片段過短、注釋信息缺乏及物種特異性等因素有關(guān)［22］。N50值越大且長度不低于800 bp，表明轉(zhuǎn)錄組序列完整性較好；Q30不低于80.00%時，即可認為轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量可靠［23-24］。梭魚草葉片unigenes平均長度為1 753 bp，N50為2 609 bp，明顯高于趕黃草［25］（Penthorum chinense）（1 119 bp；1 601 bp）、張溪香芋（Colacasia escuenla ‘Zhang Xi’）［26］（875.11 bp；1 658 bp）、 百 香 果（Passiflora edulia）［27］（1145 bp；1 991 bp）及 滇 黃 精［28］（Polygonatum kingianum）（770.38 bp；1 350 bp）等多種植物。同時，本研究所得到的Q30均大于91.00%，表明梭魚草葉片轉(zhuǎn)錄組測序和拼接質(zhì)量較高，可以確保unigenes功能注釋能獲得較為準確、可靠的比對結(jié)果，因此可利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，共有49 597條unigenes歸屬于25個KOG分類，其中注釋到“secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism”（次生代謝物生物合成、運輸和分解代謝）類群的unigenes共有785條。KEGG通路注釋結(jié)果表明，Cd脅迫下梭魚草葉片unigenes參與黃酮類、萜類及生物堿等次生代謝物生物合成相關(guān)的31個次生代謝通路，相似的結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)于蘋果［29］（Malus domestica）、多裂駱駝蓬［30］（Peganum mulstecutm）及夏枯草（Prunella vulgaris）［31］等植物。Unigenes注釋信息的完成為今后進一步考察次生代謝途徑在梭魚草防御重金屬脅迫中的作用及其機制提供了理論基礎(chǔ)。

苯丙烷代謝途徑是植物體內(nèi)多種防御性次生代謝產(chǎn)物（如黃酮類、木質(zhì)素及水楊酸等）的主要來源。本研究中，梭魚草葉片苯丙烷代謝途徑是受Cd脅迫影響最為顯著的次生代謝途徑，相似的結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)于逆境中的大豆［32］、棉花［33］及牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthum）［34］等多種植物，表明苯丙烷代謝途徑在植物抵抗非生物脅迫中可能發(fā)揮了重要防御作用。PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，可為木質(zhì)素和黃酮類化合物的生物合成提供代謝底物［16］。在48_6 h組中，梭魚草葉片中有2條上調(diào)表達的PAL序列被鑒定出來，這可能有利于增強PAL酶活性，從而促進下游次生代謝物的合成與積累［35］。高等植物PAL家族中這種僅有少量基因表達而其余同源基因沉默的現(xiàn)象［35］也被發(fā)現(xiàn)于趕黃草［25］、夏枯草［31］及八爪金龍［36］（Ardisia crispa）等多種植物。

C4H、4CL也是木質(zhì)素與黃酮類化合物生物合成途徑中上游階段的關(guān)鍵酶，可催化肉桂酸形成對-香豆酸輔酶A。在48_0 h和48_6 h組中，梭魚草葉片中共有6條差異表達的C4H序列被鑒定出來，其中主要表達的序列有1條，這可能有利于增強整條代謝通路的通量。作為一類復雜的酚類聚合物，木質(zhì)素在植物應對重金屬脅迫中發(fā)揮了重要的防御作用［37-38］。木質(zhì)素生物合成起始于苯丙氨酸，進入苯丙酸途徑后經(jīng)過一系列的脫氨基、羥基化、甲基化與還原等步驟生成木質(zhì)素單體，然后經(jīng)POD、漆酶和酚酶的催化作用聚合為高分子木質(zhì)素［39］。我們發(fā)現(xiàn)，對-羥基苯基木質(zhì)素生物合成過程中，差異表達的4CL、CAD和POD基因均下調(diào)表達；作為單子葉植物體內(nèi)主要的木質(zhì)素類型，梭魚草葉片中與愈創(chuàng)木基木質(zhì)素生物合成相關(guān)的CSE、4CL及CCoAMOT基因上調(diào)表達，推測該植物可能通過調(diào)控愈創(chuàng)木基木質(zhì)素的生物合成以吸附葉片細胞中過量的Cd2+［40］。黃酮類化合物作為一類重要的抗逆性物質(zhì)，在植物抵御重金屬脅迫過程中發(fā)揮了抗氧化作用［17，41］。CHS、F3H、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、二氫黃酮醇4-還原酶（FDR）及無色花青素雙加氧酶（LDOX）等多種酶參與植物黃酮類化合物的生物合成。本研究通過進一步篩選從各處理組梭魚草葉片中共獲得了15個與黃酮類化合物生物合成的差異表達基因，共編碼8個關(guān)鍵酶。其中，包括1個苯丙烷代謝公共途徑所需酶（C4H）和7個黃酮類化合物生物合成所需酶（ANS、3GT、IFS、F3H、F3′ 5′H、F3OMT、CCoAMOT），其中PAL、C4H、ANS、3GT、CCoAMOT、F3OMT及POD基因上調(diào)表達，這可能與葉片中Cd積累與解毒過程有關(guān)［17，42-43］，可以作為今后梭魚草防御Cd植物毒性機制研究的方向之一。本研究對Cd脅迫下梭魚草葉片進行了轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了梭魚草葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，為深入研究次生代謝途徑在梭魚草防御重金屬植物毒性中的作用機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

在Cd脅迫下，梭魚草葉片unigenes參與萜類化合物、類黃酮類、生物堿等化合物生物合成相關(guān)的31個次生代謝通路，同時葉片差異表達基因具有3個顯著的表達模式。Cd脅迫下梭魚草葉片苯丙烷代謝途徑中共有26個差異表達基因分別編碼3個苯丙烷公共代謝途徑關(guān)鍵酶和9個黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵酶，其中CSE、CCoAMOT及3GT等基因在防御Cd脅迫中可能具有重要作用。