大麥NRAMP全基因組鑒定及重金屬脅迫下基因表達 分析

李一涵 于浪柳 李春燕 張蒙蒙 張曉勤 方云霞 薛大偉

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州 311121）

多種重金屬在維持植物生理和生化功能穩(wěn)定等方面起著關(guān)鍵作用，如缺少銅（Cu）、錳（Mn）等金屬離子將導(dǎo)致植物生長緩慢、植株矮小等現(xiàn)象；而重金屬含量過高則又會對植物產(chǎn)生毒害，抑制細胞生長、光合作用等生理活動，進而影響植物的生長發(fā)育［1-2］。近年來，因重金屬大量排放導(dǎo)致的土壤重金屬污染問題愈發(fā)嚴峻，致使農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量不斷下降。大麥（Hordeum vulgare L.）是種植面積僅次于水稻、玉米、小麥的禾谷類糧食作物，具有食用、飼用、釀酒等多種用途［3］。重金屬污染會嚴重影響大麥正常的生理活動，使其產(chǎn)量下降，因此，研究重金屬脅迫下大麥的抗逆機理具有重要 意義。

NRAMP家族是一類重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白家族，此類蛋白廣泛存在于植物中［4］，在調(diào)控和維持植物體內(nèi)金屬離子的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，可有效緩解重金屬離子脅迫對植物生長發(fā)育的危害［5］。在錳、鐵缺乏條件下，將水稻膜轉(zhuǎn)運家族基因OsNramp6分別導(dǎo)入Fe2+和Mn2+轉(zhuǎn)運缺陷酵母突變體中，能夠回復(fù)突變菌株的異常表型，表明OsNramp6參與植物體內(nèi)鐵和錳的轉(zhuǎn)運［6］。在擬南芥中，AtNramp1的功能缺失突變體在低錳條件下生長減緩且錳積累量降低，可見AtNramp1是低錳條件下錳吸收的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白［7］。深入研究表明，NRAMP蛋白不僅對錳、鐵等微量元素的吸收分配發(fā)揮作用，還參與了植物對鎘（Cd）等重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運途徑中［8］。

目前已在擬南芥［9］、水稻［5］、大豆［10］、甘草［11］中分別鑒定到6、8、8和11個NRAMP基因，其調(diào)控吸收、轉(zhuǎn)運重金屬功能在模式植物擬南芥和水稻中研究最為深入，但大麥NRAMP基因的研究卻鮮有報道。

本研究采用生物信息學(xué)方法鑒定大麥NRAMP基因家族，對該家族成員的序列特征、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育以及差異表達等方面進行了分析，并研究Mn2+、Cd2+、Cu2+三種重金屬離子脅迫對大麥幼苗的生理生化指標及NRAMP家族基因表達的影響，以期了解上述3種重金屬離子與NRAMP家族基因表達調(diào)控之間的作用機制，為進一步明確NRAMP家族基因?qū)Υ篼溈怪亟饘倜{迫的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大麥品種Golden Promise（GP）。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將大麥種子用0.1% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗3-4次，置于暗處萌發(fā)24 h。種子萌發(fā)后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)盒，26℃恒溫培養(yǎng)室中水培（光周期14 h/10 h，光合有效輻射18 000 lx）。待幼苗長至一葉一心，進行重金屬離子脅迫處理。試驗設(shè)4個處理組，對照組用1/2 Hoagland培養(yǎng)液［12］培養(yǎng)，試驗組分別用含50 μmol/L MnCl2、50 μmol/L CdCl2、50 μmol/L CuCl2的1/2 Hoagland培養(yǎng)液進行脅迫處理，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。脅迫1、3和5 d后，選取幼苗葉片液氮冷凍，并于-80℃保存，用于總RNA提??；同時，脅迫處理3 d時取樣，用于生理指標 測定。

1.2.2 生理生化指標測定 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性與脯氨酸（proline，Pro）含量均采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定，具體測定步驟見說明書。

1.2.3 總RNA提取和cDNA的合成 利用RNA植物提取試劑盒（TIANGEN）提取葉片總RNA，再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ReverTra Ace qPCR RT Kit，TOYOBO）中的方法將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。產(chǎn)物用于實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 大麥NRAMP基因家族的生物信息學(xué)分析

1.2.4.1 NRAMP家族基因的鑒定和結(jié)構(gòu)分析 利用HMMER在線獲取大麥的NRAMP蛋白候選序列，再借助NCBI Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對候選序列進行篩選和去冗余，以獲得非冗余的大麥NRAMP基因及蛋白序列。借助Ex-PASy（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件預(yù)測理論氨基酸長度、理論等電點、相對分子質(zhì)量等［13］。從EnsemblPlants（http://plants.ensembl.org/ index.html）數(shù)據(jù)庫中獲取基因在染色體上的位點信息，并分別利用MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）、MEME（http://meme-suite.org/）及Gene Str ucture Display Server 2.0（http://gsds.gao-lab.org/）在線繪制染色體定位圖、大麥NRAMP蛋白的保守基序和NRAMP基因家族成員的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式圖。利用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對大麥NRAMP蛋白進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.4.2 NRAMP基因家族進化樹的構(gòu)建 利用MEGA7軟件中的鄰接法（neighbour-joining）對10個NRAMP基因、6個來自NCBI已確定功能的擬南芥AtNramp基因及7個水稻OsNramp基因的蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。模型選擇為p-distance，校驗參數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1 000，其余參數(shù)保持 默認［14］。

1.2.5 大麥NRAMP基因表達譜繪制及候選基因的 篩選 在IPK（https://galaxy-web.ipk-gatersleben.de/） 網(wǎng)站下載相應(yīng)RNA-seq數(shù)據(jù)，包括EMB、ROO1、LEA、INF1、INF2、NOD、CAR5、CAR15等多個階段的表達量信息。將FPKM值作為NRAMP基因的表達譜數(shù)據(jù)源，核對整理后采用軟件MeV繪制表達量熱圖，依據(jù)表達量篩選候選基因［15］。

1.2.6 NRAMP基因的表達分析 遵循熒光定量PCR的引物設(shè)計原則設(shè)計10對引物（表1）。利用引物定量分析10個NRAMP基因的表達量，相對表達量用2-ΔΔCt（Livak法）計算，每個樣品重復(fù)4次。根據(jù)qRT-PCR的試驗結(jié)果，用SigmaPlot v10.0作圖，并利用IBM SPSS Statistics 20將每組數(shù)據(jù)分別與對照組進行2個獨立樣本t檢驗 （*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）。

表1 熒光定量PCR擴增引物Table 1 Primers for qRT- PCR analysis

2 結(jié)果

2.1 重金屬離子脅迫對大麥幼苗生理指標的影響

POD的活力變化反映植株受到的脅迫狀況。3種重金屬分別處理大麥幼苗3 d后，Mn2+、Cd2+和Cu2+處理組的POD活性比對照組分別提高了9.83、9.17和2.36倍，其中，前2組的POD活性差異達到了極顯著水平（圖1-A），表明不同重金屬離子脅迫處理對大麥幼苗POD活性均有影響，但影響幅度不同，其中，Mn2+和Cu2+脅迫處理對大麥幼苗POD活性的影響最顯著。MDA是反應(yīng)細胞膜脂過氧化及膜結(jié)構(gòu)受損程度的重要指標。通過測量處理3 d的大麥幼苗中的MDA含量，Mn2+、Cd2+和Cu2+處理組的MDA含量均明顯提高（圖1-B），表明3種重金屬均對幼苗的膜結(jié)構(gòu)造成了損傷。Pro含量測定結(jié)果（圖1-C）顯示，脅迫處理3 d后，3個處理組的Pro含量均有所提高，其中，Cu2+處理組Pro含量顯著升高，Mn2+處理組Pro含量差異極顯著增加。由此可見，3種重金屬離子脅迫處理均導(dǎo)致大麥幼苗通過大量積累脯氨酸來降低重金屬毒害，提高自身的抗逆能力。

圖1 重金屬離子脅迫處理對大麥幼苗葉片生理指標的影響Fig. 1 Effects of heavy metal ion stress on the physiological indexes of barley seedling leaves

2.2 NRAMP基因家族的生物信息學(xué)分析

2.2.1 NRAMP基因家族的分子特征 通過冗余序列的剔除以及二次結(jié)構(gòu)的校驗，共得到10條大麥NRAMP蛋白序列，確定其為NRAMP基因家族成員，將其命名為HvNramp1-HvNramp10。對HvNramp1-HvNramp10進行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，除HvNramp5、HvNramp7、HvNramp9外，其余HvNramp氨基酸長度與分子量均接近，分別介于515-606 aa和55.88-66.31 kD。水稻NRAMP基因家族中的7個基因編碼分子量為55.8-59.7 kD，具有500-588 aa［16］。表明大麥HvNramp與水稻OsNramp成員在理化性質(zhì)上較為相似（表2）。HvNramp蛋白所有成員均有5-12個跨膜結(jié)構(gòu)域，9個HvNramp蛋白定位于細胞質(zhì)膜，1個HvNramp蛋白（HvNramp8）定位于細胞核 （表2），表明大麥的HvNramp成員可能普遍參與重金屬的跨膜轉(zhuǎn)運。

表2 大麥NRAMP蛋白理化性質(zhì)及染色體定位Table 2 Physicochemical properties and chromosome location of NRAMP protein in barley

2.2.2 NRAMP基因家族成員保守域序列分析 通過對HvNramp蛋白序列保守性分析（圖2-A），得到了10個保守基序。HvNramp蛋白分別含1-9個基序，基序數(shù)目為9的成員有6個，表明多數(shù)基因保守域完整且相似，可能存在相似的功能。此外，除HvNramp8外，其余所有成員都含有基序1和基序2。

2.2.3 NRAMP基因家族成員鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 利用10條HvNramp蛋白序列、6條擬南芥蛋白序列及7條水稻蛋白序列共同構(gòu)建進化樹（圖2-B）。根據(jù)擬南芥NRAMP蛋白分組［17］及蛋白保守基序的相似性將進化樹分為5個亞家族，依次命名為亞家族I-V。其中，HvNramp8的保守基序較為特殊，且其在進化樹中單獨處于一個分枝，故將其單獨列為一個亞家族；亞家族 II中包括大麥HvNramp10、擬 南 芥AtNramp1、AtNramp6及 水 稻OsNramp3；HvNramp5、HvNramp7的保守基序較為相似，屬于同一亞家族；亞家族 IV中包括大麥HvNramp1、HvNramp4、HvNramp9及 水 稻 中 的OsNramp1、OsNramp4、OsNramp5、OsNramp6；亞家族Ⅴ中包括大麥中的HvNramp2、HvNramp3、HvNramp6，擬南芥中的AtNramp2、AtNramp3、AtNramp4、AtNramp5及水稻中的OsNramp2、OsNramp7。

2.2.4 NRAMP基因家族成員的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析 內(nèi)含子-外顯子的結(jié)構(gòu)可能會影響到潛在的特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)［18］。大麥NRAMP家族基因內(nèi)含子較長，外顯子較短，為展現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)，手動去除了過長的內(nèi)含子冗余序列后繪制基因結(jié)構(gòu)圖（圖2-C）。內(nèi)含子的長度與相應(yīng)基因的表達水平有著較強的負相關(guān)性，低水平表達基因的內(nèi)含子長度大于高水平表達基因的內(nèi)含子?；蚪Y(jié)構(gòu)與亞家族分類結(jié)果有一定的相關(guān)性，除亞家族Ⅲ的HvNramp5、HvNramp7分別含有5和1個外顯子差異較大外，其余亞家族基因外顯子數(shù)量均相近，如亞家族 IV的HvNramp1、HvNramp4、HvNramp9分 別 含 有8、12和9個外顯子；亞家族Ⅴ的HvNramp2、HvNramp3、HvNramp6分別含有4、3和4個外顯子。

圖2 大麥NRAMP基因家族蛋白保守基序、基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Conserved sequences，gene structure and phylogenetic analysis of barley NRAMP gene family

2.2.5 NRAMP基因家族成員的表達量預(yù)測分析 利用10個大麥NRAMP基因在不同組織中的表達數(shù)據(jù)，繪制熱圖，探究NRAMP家族成員的表達特征。結(jié) 果（圖3）表 明，HvNramp1、HvNramp3、HvNramp6、HvNramp7、HvNramp8在各個組織和果實的不同發(fā)育階段中均有較高程度的表達，被聚類為 高 表 達；而HvNramp2、HvNramp4、HvNramp5、HvNramp9、HvNramp10表達量相對較低，被聚類為低表達。HvNramp表達具有組織差異，在胚胎、根及葉中多數(shù)高表達，而在花序組織中表達較低。

圖3 大麥NRAMP基因的表達譜分析Fig. 3 Expression profile analysis of NRAMP gene family in barley

2.2.6 NRAMP基因家族成員的染色體定位分析 根據(jù)EnsemblPlants上獲得的NRAMP基因位置信息，繪制了基因的染色體定位圖（圖4），10個HvNramp分布于大麥的3H、4H、5H、7H四條染色體上且多集中在染色體近末端。分布在第4染色體上的基因最多，為4個；分布在第3染色體上的基因最少，僅有1個。著絲粒和近著絲粒區(qū)域易發(fā)生序列變化和結(jié)構(gòu)重塑，是植物新基因發(fā)生和起始的熱點區(qū)，并且著絲粒區(qū)域內(nèi)的基因有著向外逃離的進化趨勢［19］。本研究中所有NRAMP基因都位于遠著絲粒區(qū)。由此推測大麥NRAMP基因進化歷程較長，功能較為穩(wěn)定。

圖4 大麥NRAMP家族基因在染色體上的分布Fig. 4 Distribution of barley NRAMP family genes on chromosomes

2.3 NRAMP基因家族成員在重金屬離子脅迫條件下的表達分析

NRAMP編碼的蛋白具有吸收和轉(zhuǎn)運重金屬的功能，為對篩選基因進行重金屬逆境脅迫驗證，利用qRT-PCR對Mn2+、Cd2+、Cu2+脅迫下大麥幼苗中10個HvNramp的表達進行檢測，因HvNramp6、HvNramp7、HvNramp10在大麥幼苗葉片中的表達過低，最終僅對其余7個基因的相對表達量進行了分析。

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，Mn2+脅迫下，HvNramp1、HvNramp2的表達量顯著升高，分別提高了1.33和1.10倍；Cd2+脅迫下，HvNramp8的表達量下降了16%，與對照間存在極顯著差異，其他基因表達量雖然略有提高，但與對照間的差異不顯著；而Cu2+脅迫時7個基因表達量均上調(diào)，其中HvNramp1、HvNramp2、HvNramp5、HvNramp9在Cu2+脅迫下表達量顯著升高，分別提高了2.93、4.48、1.03和3.51倍（圖5）。結(jié)果表明，除了HvNramp3 外，其他6個HvNramp均是大麥苗期響應(yīng)重金屬脅迫的基因。

圖5 3種重金屬離子脅迫下7個大麥NRAMP家族基因相對表達分析Fig. 5 Relative expression analysis of seven barley NRAMP family genes under three heavy metal ion stresses

3 討論

重金屬離子刺激植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使其生成較多的過氧化物酶、過氧化氫酶與超氧化物歧化酶等抗氧化酶，植物的抗氧化酶可清除過多的氧自由基，通常作為植物抵抗重金屬脅迫的重要指標［20］。本研究中，3種重金屬離子處理下的大麥幼苗葉片中POD活性較對照組均顯著提高，尤其以Mn2+、Cd2+脅迫組升高最顯著。表明3種重金屬離子處理激發(fā)了大麥的抗氧化反應(yīng)，刺激抗氧化酶的產(chǎn)生以去除重金屬脅迫產(chǎn)生的氧基自由基，其中POD活性對錳、鎘脅迫較敏感。MDA是植物受到逆境脅迫后膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA含量的高低能夠反映細胞膜脂過氧化的程度和植物受逆境傷害程度的強弱［20］。本研究中，與對照組相比，各處理組的MDA含量均顯著高于對照組，表明重金屬離子脅迫處理對大麥幼苗具有毒害作用，其中Mn2+、Cd2+脅迫的毒害作用更強，Cu2+脅迫的毒害作用相對較弱。植株積累的脯氨酸可以通過滲透調(diào)節(jié)增強自身的抗逆性［21］，其在一定程度上能夠衡量植物抗逆性，含量越高抗性越強。本研究中，處理組大麥幼苗葉片的Pro含量均高于對照組，其中Mn2+處理時上升最顯著，Cu2+次之，Cd2+最低。3種重金屬離子處理組中大麥幼苗Pro含量均有顯著上升，這表明在重金屬離子脅迫條件下，大麥幼苗通過大量積累脯氨酸來降低重金屬毒害，從而提高自身的抗逆能力。

大麥對重金屬離子脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)生的一系列生理生化變化，是由復(fù)雜的內(nèi)在分子機制來調(diào)控的。本研究在大麥全基因組范圍內(nèi)共鑒定到10個NRAMP基因，對該家族成員進行理化特性分析發(fā) 現(xiàn)，蛋白的保守基序有1-9個不等，且不同的HvNramp蛋白序列、氨基酸長度均有較大的差異。已有研究表明，NRAMP家族蛋白的亞細胞定位位置基本可以分為兩類，其一主要定位于細胞質(zhì)膜，負責(zé)元素的吸收；其二主要定位于液泡膜，負責(zé)元素的再利用［19］。亞細胞定位預(yù)測9個基因定位于細胞質(zhì)膜，推測HvNramp主要與重金屬離子的跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。先前有研究表明NRAMP家族基因編碼膜整合蛋白分子，一般具有10-12個跨膜區(qū)TM，且TM1-8具有高度同源性［22］，但在最新研究中發(fā)現(xiàn)甘蔗NRAMP基因家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)位于6-12的情況［23］，這與本研究中大麥HvNramp蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)較為相近。已有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtNramp1、 AtNramp2、AtNramp3、AtNramp4［7，24-26］均 對Mn2+的吸收和轉(zhuǎn)運起到關(guān)鍵作用，水稻OsNramp1、OsNramp2、OsNramp5、OsNramp6［7，27-29］均 與Cd2+的吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)。本研究中，在Mn2+脅迫下，HvNramp1、HvNramp2表達水平顯著上調(diào)，暗示它們可能參與Mn2+的吸收和轉(zhuǎn)運；在Cd2+脅迫下，除HvNramp8表達量顯著下調(diào)外，其余基因均上調(diào)，這與先前的結(jié)果相似［30］，表明大麥HvNramp可能參與Cd2+的吸收與轉(zhuǎn)運；在Cu2+脅迫下，發(fā)現(xiàn)6個基因表達量均顯著上調(diào)，其中，HvNramp1、HvNramp2、HvNramp5的響應(yīng)最強烈，暗示NRAMP基因家族可能還參與Cu2+的吸收與轉(zhuǎn)運，在水稻中也有類似的報道［31］。因此，2個Mn2+脅迫下的顯著上調(diào)基因、6個Cd2+脅迫下的上調(diào)基因、6個Cu2+脅迫下的顯著上調(diào)基因可初步認定為大麥HvNramp抵御重金屬脅迫的相關(guān)基因。近年來，土壤重金屬污染形勢愈發(fā)嚴峻，重金屬脅迫會對植物體造成毒害作用，NRAMP基因家族相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物特別是農(nóng)作物可能得到廣泛研究，有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

在50 μmol/L的Mn2+、Cd2+、Cu2+脅迫處理下，大麥幼苗體細胞內(nèi)可能出現(xiàn)了積極的保護作用來抵御重金屬離子的毒害，大麥NRAMP基因家族通過吸收和轉(zhuǎn)運重金屬離子來調(diào)控和維持植物體內(nèi)金屬離子的穩(wěn)態(tài)，對大麥抗重金屬脅迫具有重要作用。