一種用于PCR的番茄DNA快速粗提方法

申恒 劉思慧 李躍 李敬濤 梁文星

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院 山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院， 青島 266109）

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)于植物的研究上升到分子水平。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可用于體外擴(kuò)增DNA，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及植物病理學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。在對(duì)植物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定時(shí)，離不開(kāi)分離基因組DNA，但研究目的不同，對(duì)DNA的質(zhì)量要求也不同。目前提取DNA的方法主要有CTAB法、微波法、SDS法、尿素法、乙酸銨等［1-4］，其中CTAB提取法可以穩(wěn)定高質(zhì)量的提取基因組，提取質(zhì)量較高［2-3］，但其步驟繁瑣，需要有機(jī)溶劑反復(fù)抽提，提取過(guò)程需在通風(fēng)櫥進(jìn)行，對(duì)提取環(huán)境和使用藥品有一定要求，對(duì)人體健康也有一定風(fēng)險(xiǎn)［5］。當(dāng)需要提取的DNA樣品份數(shù)較多時(shí)，使用傳統(tǒng)的CTAB提取法提取DNA的步驟繁瑣，消耗大量研究時(shí)間，效率較差。而有些研究對(duì)DNA的提取質(zhì)量要求不高，微量DNA就可通過(guò)PCR擴(kuò)增，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?］。Zou等［7］開(kāi)發(fā)了一種試紙條快速提取純化DNA的方法，但目前還未商業(yè)化開(kāi)發(fā)，所用試紙條也需要特殊處理，且在高通量篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，是否會(huì)存在提取純化DNA不穩(wěn)定的情況從而影響檢測(cè)結(jié)果也有待確定。最近的研究也報(bào)道了使用其它不同類型的膜材料快速提取核酸［8-14］，包括氧化鋁、基于纖維素的FTA濾膜，和基于二氧化硅的濾膜，這些方法雖然便捷簡(jiǎn)單但是目前仍然需要特定的配套材料，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下利用的不多。因此，探索一種更加實(shí)用、快速、便捷、穩(wěn)定、高效的粗提DNA方法仍然十分有必要。

本研究旨在優(yōu)化一種實(shí)驗(yàn)室條件下可簡(jiǎn)單、高效、快速的提取植物DNA方式，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。NaOH可以使植物細(xì)胞處于強(qiáng)堿環(huán)境下，使細(xì)胞裂解暴露DNA［15-16］。而利用高速離心可除去蛋白等雜質(zhì)，取上清液以 TE緩沖液中和，提供緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞［17］。本實(shí)驗(yàn)以番茄為材料，采取優(yōu)化的NaOH法提取植物組織DNA，并比較 CTAB法與NaOH-Tris法提取DNA的異同，同時(shí)測(cè)定提取DNA的濃度，并以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶比較兩種方法提取DNA的質(zhì)量差別，以此確定優(yōu)化的NaOH法提取DNA可穩(wěn)定、有效的進(jìn)行后續(xù)PCR分析。同時(shí)將NaOH提取DNA的方法應(yīng)用于番茄轉(zhuǎn)化子的快速篩選鑒定。此外，本研究還對(duì)番茄不同組織也進(jìn)行了DNA提取及PCR檢測(cè)，證明了該方法對(duì)植物粗提DNA用于PCR檢測(cè)的組織材料具有廣泛適用性。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用植物材料為番茄（Solanum lycopersicum cv. Alisa Craig［AC］）。將植物種子種植于草炭土∶蛭石比例為3∶1的土壤中，在28℃相對(duì)濕度為60%，光暗交替（光照16 h）的溫室內(nèi)培養(yǎng)4周左右。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 取新鮮健康番茄植物的葉片大約0.05 g，或者根、莖、葉柄等組織0.15 g組織，放入2 mL離心管中，加入 1粒直徑 5 mm 鋼珠或磁珠，蓋上蓋，放入液氮中冷凍，之后用全自動(dòng)樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-48）快速研磨 90-120 s，至粉狀。

1.2.2 DNA提取方法

1.2.2.1 CTAB法 （1）在植物粉末中加入1mL 2% CTAB 的提取液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇，pH8.0），加入研磨珠，劇烈振蕩，于65℃水浴加熱40 min，期間每隔20 min左右搖動(dòng)1次，充分混合樣品與提取液。（2）將樣品于室溫下12 000 r/min，離心7 min，吸上清（約0.7 mL）在通風(fēng)廚中加入等體積的氯仿，反復(fù)顛倒，充分混勻后室溫下12 000 r/min，離心10 min。（3）吸上清液（約0.5 mL）于新的離心管中，加入等體積的異戊醇輕搖混勻，置于-20℃冰箱 20-30 min。（4）室溫下12 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留沉淀。（5）用75%乙醇洗沉淀2次，自然風(fēng)干DNA。（6）DNA干燥后，加入40 μL ddH2O 溶解DNA，然后保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2.2 NaOH法 在粉末中加入500 μL 不同濃度（0.25 mol/L，0.5 mol/L或0.75 mol/L）的NaOH顛倒混勻，靜置不同時(shí)間（0、5、10、20、40、及60 min）后，室溫下12 000 r/min離心10 min。取10 μL上清液轉(zhuǎn)移到新鮮管中，加入90 μL的TE buffer（100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）中和，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 DNA濃度測(cè)定 應(yīng)用核酸蛋白測(cè)定儀（BioPhotometer D30），將提取的植物DNA樣品做適當(dāng)稀釋后測(cè)量DNA含量。

1.2.4 PCR擴(kuò)增以及電泳檢測(cè) 本研究選取番茄的SlPR1基因（F：5′-ATGCAAAATTCACCCCAAGAC-3′；R：5′-GTAAGGACGTTGTCCGATCC-3′）或SlActin基因序列（F：5′-TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3′；R：5′-GTCTGGTCCATCCATTGTCC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)采用20 μL反應(yīng)體系，基因組DNA取2 μL作為模板，利用1.1×T3 Super PCR Mix（TSE030）聚合酶按照產(chǎn)品推薦的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)紫外投射顯示電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 利用堿裂解法對(duì)番茄轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 鑒定 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了基于CRISPR-Cas9的PR1基因雙靶點(diǎn)編輯載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對(duì)番茄子葉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并在篩選標(biāo)記培養(yǎng)上，進(jìn)行篩選，獲得T0代基因編輯轉(zhuǎn)化子。隨后對(duì)獲得的植物轉(zhuǎn)化子移栽到土壤中，生長(zhǎng)4周左右，取新鮮葉片，利用NaOH-Tris的方法進(jìn)行粗提DNA，然后利用SlPR1基因進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)基因編輯情況，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)紫外投射顯示電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取流程比較

在樣品基本一致的前提下，獲得液氮研磨的粉狀組織后，利用NaOH法提取的DNA的用時(shí)較短，約0.5 h，而利用CTAB法提取DNA用時(shí)較長(zhǎng)，累計(jì)約2.5 h。NaOH法提取DNA不僅節(jié)約時(shí)間，且所用危險(xiǎn)試劑數(shù)量少，無(wú)需使用氯仿及異丙醇等有機(jī)試劑抽提，毒性低，對(duì)人身更加安全，因此本研究將開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單的NaOH法進(jìn)行番茄基因組提取及PCR檢測(cè)（表1）。

表1 NaOH法及CTAB法提取番茄DNA的比較Table 1 Comparison of NaOH and CTAB method for extracting S. lycopersicum DNA

2.2 不同NaOH濃度提取番茄基因組

通過(guò)利用不同NaOH濃度提取的番茄DNA進(jìn)行條件篩選，結(jié)果（圖1）顯示番茄用0.25 mol/L NaOH提取的量約520 μg/mL，用0.5 mol/L NaOH提取的量約為810 μg/mL，用0.75 mol/L NaOH提取的量約740 μg/mL。結(jié)果說(shuō)明，本研究所用不同濃度NaOH均可以提取番茄基因組，但利用0.5 mol/L的NaOH提取濃度最高，因此推薦0.5 mol/L的NaOH進(jìn)行番茄基因組提取。

圖1 不同NaOH濃度提取番茄基因組的核酸定量檢測(cè)Fig. 1 Quantitative detection of extracted genomic DNA from S. lycopersicum with different NaOH concentrations

2.3 不同NaOH處理時(shí)間提取番茄基因組PCR檢測(cè)

通過(guò)利用0.5 mol/L的NaOH濃度提取的番茄DNA進(jìn)行處理?xiàng)l件篩選，結(jié)果（圖2）顯示NaOH處理5-20 min PCR檢測(cè)條帶清晰，最佳NaOH處理時(shí)間為10 min。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，條帶減弱，結(jié)果說(shuō)明NaOH處理5 min后可以進(jìn)行中和，均可以提取番茄基因組，但NaOH處理10 min效果最好，因此推薦NaOH的最佳處理時(shí)間為10 min。

圖2 不同NaOH處理時(shí)間對(duì)番茄基因組PCR檢測(cè)Fig. 2 PCR detection of S. lycopersicum genome with different NaOH treatment time

2.4 利用NaOH法和CTAB法提取番茄DNA濃度 比較

通過(guò)利用NaOH法及CTAB法提取的DNA進(jìn)行濃度檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示番茄用NaOH法提取的量平均約630 μg/mL，用CTAB法提取的量平均約為2 700 μg/mL。結(jié)果說(shuō)明，CTAB法提取的植物DNA的量比利用NaOH提取的量要多4倍左右，兩種方法提取的DNA的總量具有顯著性差異。但NaOH法提取的量滿足常規(guī)PCR需求，本研究提取番茄基因組可以用NaOH法提取。

圖3 不同方法提取番茄基因組的核酸定量檢測(cè)Fig. 3 Quantitative detection of extracted genomic DNA from S. lycopersicum with different methods

2.5 堿裂解法和CTAB法粗提DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果比較

為了進(jìn)一步確定上述步驟中NaOH提取的DNA滿足PCR分子檢測(cè)的質(zhì)量需求，健康番茄葉片組織利用NaOH和CTAB法提取DNA后，我們利用番茄病程相關(guān)蛋白基因SlPR1檢測(cè)NaOH法提取的基因組，利用CTAB法提取的基因組作為對(duì)照。結(jié)果（圖4）表明，NaOH法提取基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，目標(biāo)基因條帶清晰特異，基本與CTAB法提取基因組進(jìn)行的PCR一致，因此可以利用NaOH法提取番茄基因組，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。

圖4 不同方法提取基因組的PCR檢測(cè)Fig. 4 PCR detection of extracted genome by different methods

2.6 堿裂解法對(duì)番茄轉(zhuǎn)化子葉片粗提DNA的PCR鑒定

為了進(jìn)一步確定上述步驟中NaOH提取及PCR檢測(cè)可用于番茄轉(zhuǎn)化子的鑒定，健康番茄轉(zhuǎn)化子葉片組織利用NaOH法提取DNA后，利用番茄病程相關(guān)蛋白基因SlPR1檢測(cè)NaOH法提取的T0代轉(zhuǎn)基因番茄的基因組，理論上基因編輯成功的靶基因會(huì)因基因缺失而使靶標(biāo)基因變小。PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，目標(biāo)基因SlPR1在轉(zhuǎn)化子1和4中出現(xiàn)清晰特異的小條帶，暗示該植株可能為雜合的轉(zhuǎn)基因番茄。

圖5 利用NaOH方法提取番茄轉(zhuǎn)化子葉片基因組并進(jìn)行PCR檢測(cè)Fig. 5 PCR detection of the extracted leaf genome of S. lycopersicum transformants using NaOH method

2.7 堿裂解法對(duì)番茄轉(zhuǎn)化子葉片DNA的PCR檢測(cè)及測(cè)序鑒定

為了確定上述步驟中NaOH鑒定番茄轉(zhuǎn)化子的確定性，轉(zhuǎn)化子1號(hào)及4號(hào)葉片組織利用NaOH法和CTAB法提取DNA后，同樣利用SlPR1檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因番茄的基因組，兩種方法PCR檢測(cè)結(jié)果一致，均出現(xiàn)了截短的小條帶，表明NaOH法提取的DNA滿足轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定（圖6-A），對(duì)轉(zhuǎn)化子1號(hào)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)只有在DNA剪切位點(diǎn)后面的序列與野生型序列不一致（圖6-B），同時(shí)在該位點(diǎn)以后出現(xiàn)套峰，由于T0代植株具有雜合現(xiàn)象，因此該位點(diǎn)后的測(cè)序結(jié)果會(huì)出現(xiàn)套峰，這也基本確定SlPR1確實(shí)發(fā)生了基因編輯，可進(jìn)行后續(xù)進(jìn)行種子分離純化。該結(jié)果說(shuō)明，可以利用NaOH法提取番茄基因組，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番茄的PCR檢測(cè)。

圖6 番茄轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)及轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證Fig. 6 PCR detection and sequencing verification of S. lycopersicum transformants

2.8 堿裂解法對(duì)番茄不同組織DNA提取及PCR 檢測(cè)

利用2.3中所述的NaOH法提取健康番茄的不同組織基因組DNA，利用番茄內(nèi)參基因SlActin進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖7）顯示，番茄不同組織樣品的DNA提取良好，均可作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，且PCR特異性強(qiáng)。說(shuō)明NaOH法可對(duì)番茄根、莖、葉等不同組織進(jìn)行DNA提取，對(duì)樣品不具有組織選擇性。

圖7 番茄幼苗不同組織DNA提取及PCR檢測(cè)Fig. 7 DNA extraction and PCR detection from the different tissues of S. lycopersicum seedlings

2.9 堿裂解法提取植物DNA及PCR流程

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，番茄基因組DNA提取及PCR檢測(cè)主要包括以下流程（圖8）：取番茄的任何組織（根、莖、葉、葉柄、頂稍等）適量；通過(guò)液氮進(jìn)行組織破碎；利用0.5 mol/L NaOH法快速提取DNA，然后利用TE緩沖液中和；進(jìn)行PCR檢測(cè)。

圖8 番茄組織DNA提取及PCR檢測(cè)簡(jiǎn)單流程Fig. 8 Schematic diagram illustrating the process of DNA extraction and PCR detection from S. lycopersicum tissues

3 討論

提取植物基因組DNA，是對(duì)植物進(jìn)行分子生物學(xué)研究的重要的環(huán)節(jié)。有關(guān)植物DNA的提取方法很多，常采用CTAB提取法、SDS提取法等化學(xué)法破除細(xì)胞壁，再與有機(jī)溶劑抽提相結(jié)合的方式［2，18-19］。 這些方法所提取的DNA質(zhì)量高，穩(wěn)定性好，但步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，在樣本所需量較大時(shí)，耗費(fèi)大量研究時(shí)間，效率低。在后續(xù)許多研究中，部分實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA的質(zhì)量要求并非極其嚴(yán)格，可通過(guò)RCR對(duì)基因?qū)崿F(xiàn)擴(kuò)增即可達(dá)到研究目的。因此本研究提出了一種用NaOH和Tris pH8.0快速粗提植物DNA的方式，并將其與傳統(tǒng)CTAB法做對(duì)比。用兩種方式提取DNA的過(guò)程：（1）在耗時(shí)方面，CTAB法多次離心靜置，反復(fù)用有機(jī)溶劑抽提，其中還包括短時(shí)間的低溫儲(chǔ)藏，完成提取需2.5-3 h，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。在樣本需求量大時(shí)，提取時(shí)長(zhǎng)增加。NaOH-Tris法，操作簡(jiǎn)單，省去有機(jī)溶劑反復(fù)抽提和低溫下冷藏靜置，更無(wú)需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，節(jié)省了大量時(shí)間。除去抽真空干燥處理，完成提取只需0.5 h，耗時(shí)較少。（2）在試劑方面，CTAB法所使用藥品復(fù)雜多樣，所需的氯仿異丙醇等藥物均具有一定毒性，易對(duì)環(huán)境造成污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)室有一定要求。而本實(shí)驗(yàn)提出的方法使用藥品單一，所用NaOH和Tris屬于實(shí)驗(yàn)室常備藥品，成本低，安全系數(shù)高。（3）在操作方面，CTAB法步驟繁瑣，在提取過(guò)程中易出現(xiàn)操作失誤而導(dǎo)致DNA提取質(zhì)量差，NaOH-Tris法步驟單一，減少了過(guò)程出錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)。（4）通過(guò)電泳條帶的亮度比較，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，兩種方式所提DNA質(zhì)量并無(wú)太大差別，均可滿足常規(guī)PCR檢測(cè)。利用NaOH法提取DNA進(jìn)行分子檢測(cè)在苔蘚、真菌及動(dòng)物細(xì)胞等物種中都展開(kāi)了一系列應(yīng)用［15-16，20-21］，體現(xiàn)了NaOH法在DNA提取過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)。

此外，本研究利用該方法對(duì)植物轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選鑒定，進(jìn)一步確定了NaOH方法在提取DNA過(guò)程中的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)室目前也利用該方法成功鑒定了植物幾十個(gè)轉(zhuǎn)化子，獲得多個(gè)突變體，但有關(guān)該方法的具體操作流程并沒(méi)有報(bào)道。同時(shí)，為了進(jìn)一步分析該方法對(duì)其它植物組織DNA提取的普適性，我們還提取了根、莖、葉柄等組織，并進(jìn)行了PCR鑒定。這些結(jié)果表明該方法也能夠?qū)χ参锒喾N不同組織實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的DNA提取，并應(yīng)用于基因克隆及PCR檢測(cè)，近年來(lái)，實(shí)驗(yàn)室常使用該方法提取其它植物DNA并進(jìn)行基因克隆，目的基因從200-2 000 bp均能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定克隆，說(shuō)明該方法提取的DNA質(zhì)量完整性較好，不會(huì)因?yàn)閷?duì)DNA損傷影響PCR擴(kuò)增。然而，本方法使用的NaOH是一種強(qiáng)堿，對(duì)DNA會(huì)造成一定損害，因此NaOH在使用過(guò)程中時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，且盡量不要?jiǎng)×一旌?，盡可能保證細(xì)胞破碎加入NaOH后10 min內(nèi)完成離心，并最終以TE buffer （100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）中和［17］，否 則可能因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件使基因組DNA片段慢慢斷裂，嚴(yán)重破壞DNA完整性，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行有效基因克隆。而EDTA的加入，可以螯合Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子，抑制部分DNase的活性和抑制微生物生長(zhǎng)，以便延長(zhǎng)提取DNA的保存期限。

4 結(jié)論

用NaOH和Tris提取植物DNA是一種安全、廉價(jià)、簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA提取方法，可用于常規(guī)基因克隆及轉(zhuǎn)基因植物的快速篩選鑒定，利用該方法可進(jìn)一步節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間及成本，具有廣泛的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。