基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)研究益氣解毒方治療鼻咽癌的分子機(jī)制

鄒攀 程博 鐘文良伍永慧羅晶婧范婧瑩熊雨藺婷王賢文何迎春*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙410208； 2.湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410208； 3.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410208； 4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007）

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽黏膜被覆上皮及小涎腺的惡性腫瘤［1］，世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示2018 年新增鼻咽癌病例近13萬(wàn)，死亡病例達(dá)7 萬(wàn)余例［2］，流行病學(xué)研究［3］表明其可能與EB 病毒感染［4］、遺傳易感性［5］、有害環(huán)境因素的暴露［6］、特殊飲食習(xí)慣等因素有關(guān)。盡管鼻咽癌在我國(guó)南方地區(qū)為高發(fā)性疾病，但包括局部調(diào)強(qiáng)放療、化療［7］、分子靶向治療［8］、手術(shù)、免疫治療［9］等治療方法并沒(méi)有顯著改善患者的預(yù)后。因此，迫切需要尋求新的輔助治療方法，建立用于鼻咽癌生存風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的新生物標(biāo)記或模型，以期為患者提供更有效和個(gè)性化的治療。

我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)近年來(lái)成為綜合癌癥治療的選擇之一。正氣虧虛、氣虛染毒被認(rèn)為是鼻咽癌的發(fā)生的內(nèi)因，在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，氣虛染毒既是始動(dòng)環(huán)節(jié)，也是貫穿始終的基本病機(jī)，遂其基本治法為“益氣解毒”［10］。益氣解毒方是本課題組研究和應(yīng)用了20 多年的經(jīng)驗(yàn)方，由黃連、黃芪、黨參、天花粉、茯苓、白花蛇舌草、甘草7 味中藥組成，以補(bǔ)益正氣的黃芪和清熱解毒的黃連作為君藥；黨參補(bǔ)益肺氣；白花蛇舌草清熱解毒、散癌祛毒；天花粉和茯苓相互配合，健脾養(yǎng)陰，充養(yǎng)其身，全方補(bǔ)瀉共用、氣陰雙補(bǔ)，共奏益氣解毒、平和抗毒之效，其在臨床應(yīng)用多年并取得良好療效［11］。

中醫(yī)機(jī)制很難用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段闡明，基于此，本研究將從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度闡明益氣解毒方與鼻咽癌相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)和代謝物、作用通路之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，以揭示鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制，并試圖闡述益氣解毒方防治鼻咽癌的分子機(jī)制，為促進(jìn)人們對(duì)藥物機(jī)制的新理解提供新的視角。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人鼻咽癌細(xì)胞CNE2（低分化），購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 藥物 益氣解毒方組方藥材黃芪30 g、茯苓15 g、黨參15 g、天花粉10 g、黃連10 g、白花蛇舌草10 g、甘草6 g，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，水提物具體制備方法參考課題組前期研究［12］，所有飲片均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定為正品，密封保存于-20 ℃下。注射用順鉑（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)P4394-25MG）。

1.3 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Cytiva 公司，批號(hào)AF29546230）；胎牛血清（美 國(guó) Gibco 公司，批號(hào)42A0378K）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)F4135、P3539）；PBS 緩沖液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)WHO1111906XP）；DMSO（德國(guó)Biofroxx公司，批號(hào)EZ6789B103）；兔抗NF-κB、Cyclin D1、P21（批 號(hào) 4370S、2978T、2947T），鼠抗 β-actin（批 號(hào)2896T），山羊抗兔、抗小鼠二抗（批號(hào)7076P4、7074P2）（美國(guó)CST 公司）。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma 公司）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；恒溫水浴箱（美國(guó)Pharmacia 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；ELX800 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；冷柜、冰箱、超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；渦旋振蕩器（美國(guó)SBP 公司）。

2 方法

2.1 益氣解毒方有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）是一個(gè)獨(dú)特的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)，包括化學(xué)物質(zhì)、靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，涉及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug likeness，DL）、藥物相似度、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等天然化合物的藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）特性［13］。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索益氣解毒方所含7 味中藥，即“黃連”“黃芪”“天花粉”“白花蛇舌草”“茯苓”“黨參”“甘草”，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件篩選化學(xué)成分［14］。

2.2 化學(xué)成分潛在作用靶標(biāo)預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)相關(guān)靶點(diǎn)（related targets）搜索功能欄進(jìn)行檢索，獲得潛在藥物靶標(biāo)，將潛在藥物靶標(biāo)導(dǎo)入U(xiǎn)niProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／ ／www.uniprot.org／）中進(jìn)行靶點(diǎn)基因名稱校正，得到官方名稱（剔除非人源靶點(diǎn)），獲得藥物活性成分相關(guān)候選靶點(diǎn)。

2.3 益氣解毒方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將益氣解毒方藥物活性成分、靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape3.6.0 軟件［15］中，應(yīng)用Network Analyzer（網(wǎng)絡(luò)分析）計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)參數(shù)，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)以分析益氣解毒方中重要成分和靶點(diǎn)。

2.4 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鼻咽癌差異基因篩選 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）是一個(gè)由基因表達(dá)數(shù)據(jù)、芯片和微陣列組成的公共功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，以在GEO DataSets 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Nasopharyngeal carcinoma ”為關(guān)鍵詞，輸入類型為“Series”，研究類型為“Expression profiling by array”，研究對(duì)象為“Homo sapiens”，篩選獲得GPL6480 數(shù)據(jù)集，包含原發(fā)性鼻咽癌腫瘤樣品18例，非癌性鼻咽組織樣品 18例，下載 GPL6480-9577.txt 及GSE53819_series_ matrix.txt.gz 兩個(gè)文檔。使用R 軟件（版本3.4.1，http：／ ／www.r-project.org）的Bioconductor（http：／ ／www.bioconductor.org）軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，利用Perl 語(yǔ)言將探針?biāo)降谋磉_(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為基因符號(hào)水平數(shù)據(jù)，R 語(yǔ)言limma 軟件包［16］對(duì)鼻咽癌組織和非癌組織芯片數(shù)據(jù)的差異基因進(jìn)行分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，篩選條件設(shè)定為logFC＝1，Padj＝0.05。

2.5 活性成分-鼻咽癌靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用R 語(yǔ)言軟件venny.R 插件繪制益氣解毒方潛在藥物靶標(biāo)與鼻咽癌差異表達(dá)基因靶點(diǎn)韋恩圖，Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，Network analyzer 功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)或化合物，邊表示活性成分靶點(diǎn)與鼻咽癌靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系，識(shí)別益氣解毒方中潛在的活性分子成分和靶點(diǎn)。

2.6 益氣解毒方治療鼻咽癌的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將益氣解毒方藥物作用靶標(biāo)和 差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，采用cytoscape 中的BisoGenet 插件繪制其與鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)PPI 互作網(wǎng)絡(luò)，抽取交集網(wǎng)絡(luò)，即得益氣解毒方治療鼻咽癌的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA 進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)，依次通過(guò)分析度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree、betweenness 均超過(guò)所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，以節(jié)點(diǎn)傳遞信息量與傳遞效率［17］，作為后續(xù)研究的“關(guān)鍵靶標(biāo)”［18］。為了探索差異表達(dá)基因的功能關(guān)聯(lián)，本研究還應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／string-db.org／）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，將最高的置信度（0.4）作為最小的所需交互得分，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化。

2.7 基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用R 語(yǔ)言軟件中clusterProfilerGO 軟件包及Perl 語(yǔ)言中的id2symbol 插件，對(duì)活性成分與鼻咽癌的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析（http：／ ／www.geneontology.org），其主要用于描述基因產(chǎn)物的功能，含有大量的基因注釋術(shù)語(yǔ)，包括細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）［19］；再應(yīng)用R 語(yǔ)言中的clusterProfilerKEGG 軟件包進(jìn)行KEGG 通路富集分析用于識(shí)別功能和代謝途徑，根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度以探索差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能［20］，探究益氣解毒方治療鼻咽癌的可能生物功能及信號(hào)通路機(jī)制。

2.8 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，以4×104／mL 密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，分為對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、益氣解毒方組（2.0、1.0、0.5、0.25 g／L 益氣解毒方提取物）、順鉑組（4.0 mg／L 順鉑），每孔加入200 μL 含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、36、48 h 后棄原培養(yǎng)液，每孔加入50 μg／mL MTT 溶液100 μL，繼續(xù)孵育4 h 后于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.9 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE-2細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取5×105個(gè)細(xì)胞接種至T25 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、益氣解毒方組（0.5、1.0 g／L 益氣解毒方提取物）、順鉑組（4 μmol／L 順鉑），加入相應(yīng)藥物干預(yù)36 h，參考文獻(xiàn)［21］報(bào)道的方法進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、掃膜，并分析信號(hào)值，檢測(cè)NF-κB、Cyclin D1、P21蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，以（）表示，單因素設(shè)計(jì)和多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 有效成分篩選及ADME 分析 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)OB、DL 等ADME 參數(shù)篩選得到有效成分黃連11種，黃芪13種，黨參17種，白花蛇舌草3種，茯苓6種，天花粉2種，甘草106種，共計(jì)131 種（對(duì)各藥物無(wú)效成分進(jìn)行剔除）。通過(guò)相關(guān)靶點(diǎn)搜索功能欄獲得潛在藥物靶點(diǎn)2 417個(gè)，其中黃連287個(gè)，黃芪300個(gè)，黨參214個(gè)，白花蛇舌草71個(gè)，茯苓30個(gè)，天花粉5個(gè)，甘草1 510 個(gè)。

3.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)收集131 種有效成分的2 417 個(gè)藥物靶點(diǎn)，打開(kāi)UniprotKB 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行修正得到官方基因名。將活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名、官方基因名3 列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于Excel 表格中，刪除重復(fù)項(xiàng)，得到2 082 條對(duì)應(yīng)關(guān)系，將官方基因名單獨(dú)列出去后，得到潛在作用靶點(diǎn)239 個(gè)。

3.3 鼻咽癌相關(guān)疾病靶點(diǎn) 分析GEO 芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中GPL6480 數(shù)據(jù)集，包含原發(fā)性鼻咽癌腫瘤樣品18例，非癌性鼻咽組織樣品18 例。通過(guò)R 語(yǔ)言limma 軟件包共鑒定出2 078 個(gè)差異表達(dá)基因，其中864 個(gè)（41.58%）上調(diào)，1 214 個(gè)（58.42%）下調(diào)，差異表達(dá)基因見(jiàn)圖1，圖1A 共列出40 個(gè)變化最為明顯的基因，可能與鼻咽癌致病密切相關(guān)。

圖1 癌與癌旁組織差異表達(dá)基因

3.4 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用R 語(yǔ)言軟件venny.R 插件將2 078 個(gè)差異表達(dá)基因與Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的239 個(gè)益氣解毒方的潛在作用靶點(diǎn)繪制韋恩圖，共篩選出50 個(gè)共同靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物活性成分-鼻咽癌靶標(biāo)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)或化合物，邊表示活性成分靶點(diǎn)與鼻咽癌靶標(biāo)之間的相互作用，再通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，Network analyzer 功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，見(jiàn)圖3。

圖2 益氣解毒方活性成分靶點(diǎn)與鼻咽癌疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 益氣解毒方活性成分-鼻咽癌靶點(diǎn)基因互作網(wǎng)絡(luò)

3.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 采用Cytoscape 軟件的BisoGenet 工具包繪制益氣解毒方入血活性成分的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)直接或間接相關(guān)靶點(diǎn)1 872個(gè)，靶點(diǎn)間相互關(guān)系40 157個(gè)，再以CytoNCA 工具包抽取上述PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的交集，設(shè)定DC 值＞61、BC 值＞600 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩院Y選，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白404個(gè)，篩選出TOP 基因54個(gè)，見(jiàn)圖4。應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)平臺(tái)輸入韋恩圖獲得的共同靶點(diǎn)名稱，選擇“high confidence：0.4”模式下構(gòu)建的PPI 互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖5，節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示功能相關(guān)性。應(yīng)用count.R 插件統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻次前30 的蛋白靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)較高者有VEGFA、JUN、IL1B、CCND1、ICAM1等，可能作為益氣解毒方治療鼻咽癌的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

圖4 益氣解毒方關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的目標(biāo)篩選策略

圖5 益氣解毒方共同靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

圖6 益氣解毒方共同蛋白靶點(diǎn)出現(xiàn)頻次

3.6 生物功能（GO）分析通過(guò)R 語(yǔ)言軟件 “clusterProfiler”軟件包將50 個(gè)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析，按照生物學(xué)分類為分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）。由圖7 可知，差異表達(dá)基因的BP 主要集中在脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌起源分子反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、上皮細(xì)胞發(fā)育；MF 主要集中在細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、趨化因子受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合等；CC 主要集中在細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、線粒體外膜、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞器外膜部分。

圖7 益氣解毒方共同作用靶點(diǎn)GO 功能分析柱狀圖

3.7 治療鼻咽癌核心通路篩選 采用R 語(yǔ)言軟件進(jìn)行KEGG 富集分析，根據(jù)FDR＜0.01 篩選了20 條途徑，見(jiàn)圖8A，基于TNF 信號(hào)通路的潛在靶點(diǎn)見(jiàn)圖8B（紅色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)或與潛在靶點(diǎn)相關(guān)的酶及化合物），KEGG 與基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖8C，表明益氣解毒方治療鼻咽癌的機(jī)制是通過(guò)作用于多條信號(hào)通路、靶點(diǎn)、途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。排除廣泛通路后，表1 中列出了富集靶點(diǎn)數(shù)目≥5 的信號(hào)通路，可知差異表達(dá)基因主要富集于IL-17、腫瘤壞死因子、NF-κB、Toll 樣受體信號(hào)通路中。

圖8 益氣解毒方治療鼻咽癌的信號(hào)通路

3.8 益氣解毒方對(duì)CNE2 細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，不同質(zhì)量濃度益氣解毒方水提物處理CNE2 細(xì)胞24、36、48 h后，細(xì)胞活性均受到抑制（P＜0.05），并呈劑量和時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖9。

圖9 益氣解毒方對(duì)CNE2 細(xì)胞增殖的抑制作用

3.9 益氣解毒方對(duì)CNE2 細(xì)胞NF-κB、Cyclin D1、P21 蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)Cytoscape 軟件分析可知，Cyclin D1（CCND1 基因的編碼產(chǎn)物）、P21（CDKN1A 基因編碼的蛋白）是益氣解毒方共同蛋白靶點(diǎn)，NFκB 是益氣解毒方治療鼻咽癌核心通路之一。如圖10 所示，與對(duì)照組比較，各劑量益氣解毒方組NF-κB、Cyclin D1、P21 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 益氣解毒方對(duì)CNE2 細(xì)胞NFκB、Cyclin D1、P21 蛋白表達(dá)的抑制作用

4 討論

鼻咽癌的病理類型大部分為低分化和未分化，高度惡性且易轉(zhuǎn)移，目前尚無(wú)用于臨床的特異性分子標(biāo)記物，因此，有必要闡明與腫瘤預(yù)后和侵襲性獨(dú)立相關(guān)的分子機(jī)制。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和微陣列技術(shù)的迅猛發(fā)展，與鼻咽癌緊密相關(guān)的差異表達(dá)基因圖譜分析越來(lái)越多，為挖掘預(yù)防和治療鼻咽癌的潛在診療靶標(biāo)提供新方法。本研究從GEO提取基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，隨后進(jìn)行了PPI 網(wǎng)絡(luò)分析、GO 分析、KEGG 途徑富集分析，以預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的分子機(jī)制。

本研究共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因2 078個(gè)，并篩選出VEGFA、JUN、IL1B、CCND1、ICAM1 在內(nèi)的差異表達(dá)中心基因。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，刺激腫瘤血管生成并驅(qū)動(dòng)腫瘤的進(jìn)展［22］；IL-1B 在原發(fā)腫瘤中的表達(dá)已被確定為預(yù)測(cè)乳腺癌患者［23］發(fā)生骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加的潛在生物標(biāo)志物；CCND1即Cyclin D1，全稱G1／S-特異性周期蛋白-D1，其過(guò)表達(dá)導(dǎo)致有絲分裂異常繞過(guò)關(guān)鍵細(xì)胞檢查點(diǎn)致細(xì)胞快速生長(zhǎng)并最終促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［24］；ICAM-1 即細(xì)胞間黏附分子-1，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個(gè)黏附分子，在控制腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用［25］。這些中心基因提示鼻咽癌的發(fā)生可能涉及腫瘤微環(huán)境的發(fā)生引起局部組織炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致基因突變發(fā)生細(xì)胞異常分裂，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

益氣解毒方是本課題組田道法教授研發(fā)，經(jīng)藥監(jiān)部門批準(zhǔn)以“益氣解毒顆?！眲┬妥鳛獒t(yī)院制劑的抗鼻咽癌中藥復(fù)方，在臨床療效確切。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)研究益氣解毒方治療鼻咽癌的分子機(jī)制，GO 分析表明，益氣解毒方治療鼻咽癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及活性氧代謝過(guò)程、上皮細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等生物過(guò)程。KEGG 通路分析表明，48 個(gè)共同靶點(diǎn)主要分布在TNF、IL-17、NF-κB 等信號(hào)通路，NF-κB 通常起調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和炎癥作用［26］，在許多腫瘤過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖都需要NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)［27］，在鼻咽癌中LMP1［28］通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子的結(jié)合激活NF-κB［29］；IL-17 細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞相互作用改變腫瘤微環(huán)境［30］，IL-17 還可通過(guò)p38 絲裂原激活的蛋白激酶／NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲［31］。這些通路主要在細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮作用，預(yù)測(cè)益氣解毒方可能通過(guò)調(diào)控多個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程來(lái)治療鼻咽癌。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)初步挖掘、分析益氣解毒方多靶點(diǎn)防治鼻咽癌可能的作用機(jī)制，獲得了益氣解毒方的作用靶點(diǎn)和有效成分，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了益氣解毒方治療鼻咽癌的分子機(jī)制，為進(jìn)一步驗(yàn)證本課題組之前的實(shí)驗(yàn)研究及后續(xù)深層次的藥效研究提供良好的基礎(chǔ)。