基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究活血調(diào)脂方對(duì)糖尿病性脂肪肝糖脂代謝的作用

周濤濤徐定昌平菁張春枚孫繼佳王雨秾*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)學(xué)與物理教研室，上海201203）

中國(guó)的糖尿病性脂肪肝患者數(shù)量預(yù)計(jì)在未來(lái)的幾十年將大規(guī)模增加［1］，嚴(yán)重代謝紊亂帶來(lái)的健康問(wèn)題將引起巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)［2-8］，活血調(diào)脂方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝病科副主任醫(yī)師王雨秾副教授的經(jīng)驗(yàn)方，針對(duì)糖尿病性脂肪肝脾虛濕盛兼夾血瘀的特點(diǎn)配伍而成，在臨床診療中發(fā)現(xiàn)該方具有很好的降低糖尿病性脂肪肝患者肝脂肪水平的作用。

通過(guò)篩選活血調(diào)脂方中的有效成分以及糖尿病性脂肪肝的治療靶點(diǎn)，以建立藥物有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行GO 功能和KEGG 富集分析，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示并體外驗(yàn)證活血調(diào)脂方治療糖尿病性脂肪肝的作用機(jī)制。

1 方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 有效成分的收集與篩選 活血調(diào)脂方由丹參、西紅花、荷葉、絞股藍(lán)、土茯苓、蒼術(shù)、徐長(zhǎng)卿7 味藥配伍而成，分別通過(guò)TCMSP（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）、TCMID（http：／ ／119.3.41.228：8000／tcmid／search／）對(duì)藥物成分進(jìn)行收集，并補(bǔ)充《中藥大辭典》［9］收錄的成分，再與PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核驗(yàn)校 對(duì)。利 用 SwissADME（http：／ ／www.swissadme.ch／index.php）在線數(shù)據(jù)分析軟件，以Lipinski、ESOL Class、GI absorption、Bioavailability Score 為指標(biāo)，對(duì)活血調(diào)脂方中的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，Lipinski 取0；ESOL Class 為化合物溶解性指標(biāo)，在篩選時(shí)除去評(píng)價(jià)為“poorly soluble”的成分；Bioavailability Score 為口服利用度得分，取值≥0.55；“GI absorption”是評(píng)價(jià)化合物的胃腸道吸收的情況，保留評(píng)價(jià)為“high”的成分。

1.1.2 有效成分和疾病的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和識(shí)別 使用SEA（http：／ ／sea.bkslab.org／）、HitPick（http：mips.helmholtzmuenchen.de／proj／hitpick）和 SwissTargetPrediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／index.php）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。在DisGeNET（http：／ ／disgenent.org／home／）、DrugBank（https：／ ／go.drugbank.com／）、OMIM（https：／ ／omim.org／）和TTD（http：／ ／db.idrblab.net／ttd／）數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集2 型糖尿病和非酒精性脂肪性肝病相關(guān)的基因，使用Venny 2.1.0 在線分析系統(tǒng)（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）將2 個(gè)病從4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到的靶點(diǎn)基因取交集得到2 個(gè)病的交集基因，即得到糖尿病性脂肪肝的相關(guān)基因。

1.1.3 構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 將有效成分、藥物作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)基因輸入Cytoscape 3.8.1 構(gòu)建了活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，可視化有效成分和相關(guān)靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，并使用Network-Analyzer 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。

1.1.4 靶點(diǎn)GO 功能與KEGG 富集分析 引用R 語(yǔ)言數(shù)據(jù)包對(duì)疾病相關(guān)基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，并且根據(jù)P值和基因數(shù)目自動(dòng)生成GO 功能和KEGG 富集注釋圖。選取P＜0.01 的3 條核心通路運(yùn)用Cytoscape 3.8.1軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)與模塊分析 將有效成分與糖尿病性脂肪肝的交集基因?qū)隨TRING（https：／ ／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置Organism 參數(shù)為Homo Spaiens，將Combine Score 閾值取為0.4。使用Cytoscape 3.8.1 的CytoNCA 插件對(duì)KEGG 富集得到的3 條核心通路的關(guān)鍵蛋白基因進(jìn)行分析，得到關(guān)鍵蛋白基因的Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC、Netowork 評(píng)分。

1.1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)將有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中Degree 值大于19 的有效成分與KEGG 富集得到的3 條核心通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。在Pubchem 下載有效成分的2D 結(jié)構(gòu)，再使用ChemBio3D Ultra 14.0 軟件對(duì)2D 結(jié)構(gòu)按照最小自由能進(jìn)行優(yōu)化得到小分子配體文件。通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／ ／www1.rcsb.org／）得到核心靶點(diǎn)的pdb 結(jié)構(gòu)文件，再使用Pymol 軟件（https：／ ／pymol.org／2／）去除核心靶點(diǎn)pdb 結(jié)構(gòu)文件中的水分子和小分子配體得到蛋白受體文件。將小分子配體文件和蛋白受體文件導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6 軟件計(jì)算每對(duì)小分子配體和蛋白受體文件最佳結(jié)合的區(qū)域，通過(guò)AutoDock Vina 軟件（http：／ ／vina.scripps.edu／）進(jìn)行半柔性分子對(duì)接計(jì)算得到每對(duì)小分子和作用靶點(diǎn)的親和力值（affinity）。使用Discovery Stuido 2019 軟件繪制有效成分與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)像圖并標(biāo)注出結(jié)合位點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2 試劑與藥物 丹參（批號(hào)200914）、西紅花（批號(hào)202010）、絞股藍(lán)（批號(hào)201022）、荷葉（批號(hào)20201015）、土茯苓（批號(hào)200917）、蒼術(shù)（批號(hào)20201013）、徐長(zhǎng)卿（批號(hào)200812）均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院。鹽酸二甲雙胍（批號(hào)S30880）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；阿昔莫司（批號(hào)32200925）購(gòu)自魯南貝特制藥有限公司。GAPDH 抗體（批號(hào)AF1186）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)WB0123）購(gòu)自上海威奧生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（SOCS-3）抗體、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C（SREBP-1C）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)ab16030、ab28481、ab205718）購(gòu)自英國(guó) Abcam公司；脂聯(lián)素（Adiponectin）抗體、過(guò)氧物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、胰島素受體底物1（IRS-1）、磷酸化胰島素受體底物1（Phospho-IRS-1）、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、磷酸化糖原合成激酶-3（Phospho-GSK-3）、Akt、Phospho-Akt（批 號(hào) 2789T、2435T、3407T、2385T、12456T、5558T、4691T、4058T）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2.3 活血調(diào)脂方制備 參照臨床給藥劑量，稱取活血調(diào)脂方藥材丹參36 g，荷葉36 g，絞股藍(lán)84 g，蒼術(shù)24 g，土茯苓84 g，徐長(zhǎng)卿84 g，西紅花2 g，用蒸餾水充分浸沒(méi)煎煮2 h，湯液過(guò)濾除渣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度設(shè)置50 ℃，轉(zhuǎn)速40 r／min）將濾液濃縮至膏狀，將浸膏-80 ℃冷凍24 h后置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，得粉率為8.14%，收集干燥粉末樣品，-20 ℃密封保存。稱取1 g 活血調(diào)脂方凍干粉溶解于10 mL 去離子水中，充分震蕩搖勻，配制成100 mg／mL的活血調(diào)脂方母液，3 000 r／min 離心10 min，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成不同劑量。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油酸鈉、棕櫚酸鈉、活血調(diào)脂方對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率的影響 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96 孔板中，用含不同劑量油酸鈉、棕櫚酸鈉、活血調(diào)脂方的培養(yǎng)基孵育24 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）在37 ℃繼續(xù)孵育4 h，棄去孔內(nèi)液體后，加入150 μL 二甲基亞砜，并通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）值?；趯?duì)照組的結(jié)果，將獲得的OD值進(jìn)行歸一化處理，并計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.3.2 活血調(diào)脂方對(duì)HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型的影響 參考文獻(xiàn)［10］報(bào)道配制棕櫚酸鈉溶液，對(duì)照組不作處理；模型組用含有指定劑量棕櫚酸鈉溶液孵育24 h；活血調(diào)脂方組在棕櫚酸鈉溶液孵育24 h 后給予不同劑量活血調(diào)脂方繼續(xù)孵育24 h，二甲雙胍組則加2.5 mmol／L 二甲雙胍。對(duì)照組、模型組、活血調(diào)脂方組、二甲雙胍組均取半數(shù)給予100 nmol／L 胰島素刺激，另一半不作處理，同時(shí)在無(wú)血清的高糖培養(yǎng)基再孵育4 h，比較各組間細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。葡萄糖水平檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 活血調(diào)脂方對(duì)HepG2 細(xì)胞脂肪肝模型的影響 參考文獻(xiàn)［11］報(bào)道配制油酸鈉溶液，細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素／鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)。對(duì)照組不作處理；模型組用指定劑量油酸鈉溶液孵育24 h；活血調(diào)脂方組在油酸鈉溶液處理24 h后給予不同劑量活血調(diào)脂方再繼續(xù)孵育24 h，陽(yáng)性組則加1 mmol／L 阿昔莫司。甘油三酯檢測(cè)和油紅O 染色（×100）參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 以每孔3.5×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6 孔板，設(shè)置對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組（二甲雙胍組或阿昔莫司組）和活血調(diào)脂方低、中、高劑量組。對(duì)照組正常孵育；模型組使用指定劑量棕櫚酸鈉或油酸鈉溶液孵育24 h；活血調(diào)脂方組在棕櫚酸鈉或油酸鈉溶液處理24 h 后給予不同劑量活血調(diào)脂方再繼續(xù)孵育24 h，陽(yáng)性組則加2.5 mmol／L 二甲雙胍或1 mmol／L 阿昔莫司。收集各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至NC膜，脫脂牛奶封閉2 h，分別加入GAPDH（1∶1 000）、IRS-1（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）、p-GSK-3β（1∶ 1 000）、Akt（1∶ 1 000）、p-Akt（1∶1 000）、SREBP-1C（1∶ 1 000）、SOCS-3（1∶ 1 000）、Adiponectin（1∶1 000）和PPARγ（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000），37 ℃孵育2 h，ECL 發(fā)光試劑盒顯影，使用ImageJ 1.8.0_172 軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 活血調(diào)脂方中的有效成分 從TCMSP、TCMID、《中藥大辭典》 中共獲得成分347個(gè)，其中丹參53個(gè)，荷葉11個(gè)，絞股藍(lán)36個(gè)，西紅花43個(gè)，蒼術(shù)93個(gè)，土茯苓61個(gè)，徐長(zhǎng)卿50 個(gè)。利用SwissADME 對(duì)成分進(jìn)行篩選后得到198 個(gè)有效成分。

2.1.2 活血調(diào)脂方治療疾病的靶點(diǎn)基因 通過(guò)SEA、HitPick、SwissTargetPrediction 得到有效成分的靶點(diǎn)基因411個(gè)。通過(guò)DisGeNET、DrugBank、OMIM、TTD 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到糖尿病性脂肪肝相關(guān)基因234 個(gè)。通過(guò)取交集得到活血調(diào)脂方治療糖尿病性脂肪肝的54 個(gè)作用靶點(diǎn)，并在GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)所有靶點(diǎn)基因再次核驗(yàn)。

2.1.3 構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 建立有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）更加全面地揭示活血調(diào)脂方治療糖尿病性脂肪肝的有效成分和作用靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系。其中，藍(lán)色是有效成分，紅色是有效成分作用于糖尿病性脂肪肝的靶點(diǎn)基因。該網(wǎng)絡(luò)顯示了1 107 個(gè)節(jié)點(diǎn)和404 條邊，具有更大的度值和更多邊緣的節(jié)點(diǎn)發(fā)揮更加重要的作用，用Cytoscape 3.8.1 軟件中的Network Analyzer 插件進(jìn)行分析選取Degree 值大于19 為核心成分，具體見(jiàn)表1。

圖1 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

表1 核心成分表

2.1.4 GO 功能分析 使用R 語(yǔ)言clusterProfiler 數(shù)據(jù)包得到活血調(diào)脂方作用靶點(diǎn)的GO 功能分析注釋圖（圖2A），基于P＜0.05 得到1 381 個(gè)GO 條目，其中生物進(jìn)程1 262個(gè)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)34個(gè)，分子功能85 個(gè)。在生物進(jìn)程中，交集靶點(diǎn)主要富集在脂肪酸代謝過(guò)程、對(duì)異源生物刺激的反應(yīng)、類固醇代謝過(guò)程等條目；在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，交集靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞頂端部分、神經(jīng)細(xì)胞體、膜筏等條目；在分子功能中，交集靶點(diǎn)主要富集在血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、鐵離子結(jié)合等條目。

2.1.5 KEGG 富集分析 使用R 語(yǔ)言clusterProfiler 數(shù)據(jù)包得到活血調(diào)脂方作用靶點(diǎn)的KEGG 富集分析注釋圖，基于P＜0.05 得到32 條通路，圖2B 上顯示P＜0.01 的15 條通路主要與癌癥、免疫、氧化應(yīng)激、代謝、生物降解、耐藥性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒性疾病等內(nèi)容相關(guān)。在15 條通路中PPAR信號(hào)通路、非酒精性脂肪性肝病、胰島素抵抗這3 條通路與疾病關(guān)系最為密切，圖2C 顯示了靶蛋白在預(yù)測(cè)通路上的分布，紅色表示靶蛋白，藍(lán)色為體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的重要位點(diǎn)，并使用Cytoscape 3.8.1 軟件構(gòu)建這3 條通路的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖2D），在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了后續(xù)的機(jī)制驗(yàn)證。

圖2 GO 功能分析和KEGG 富集分析

2.1.6 PPI 核心網(wǎng)絡(luò) 使用STRING 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），共有節(jié)點(diǎn)54個(gè)，220 條邊，每個(gè)節(jié)點(diǎn)平均有8.15 條邊，局部聚類系數(shù)為0.394。使 用Cytoscape 3.8.1 的CytoNCA 插件對(duì)KEGG 富集得到的3 條核心通路的關(guān)鍵蛋白基因進(jìn)行評(píng)分，關(guān)鍵蛋白基因的得分情況見(jiàn)表2。

表2 靶點(diǎn)蛋白評(píng)分表

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.7 分子對(duì)接 通過(guò)分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)活血調(diào)脂方中的核心有效成分quercetin（槲皮素）、3beta-hydroxyatractylon、kaempferol（山柰酚）、alpha-eudesmol（α-桉葉醇）、［（4S）-2-oxo-4-［（E）-1-oxobut-2-en-2-yl］-3，4-dihydropyran-5-yl］acetate、isorhamnetin（異鼠李素）、resveratrol（白藜蘆醇）、myristic acid（肉豆蔻酸）與7 個(gè)關(guān)鍵通路蛋白GSK3B、INSR、GLUT1、LXRA、PI3K、PPARγ、FABP 的親和力值小于-5 kcal／mol，如表3 所示，說(shuō)明這些有效成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合穩(wěn)固［12］，能夠改善或治療糖尿病性脂肪肝。選擇親和力值小于-7 kcal／mol 的關(guān)鍵蛋白和活性分子繪制對(duì)接模式圖，見(jiàn)圖4。

圖4 活血調(diào)脂方治療糖尿病性脂肪肝的重要靶點(diǎn)與活性成分的分子對(duì)接

表3 Vina 分子對(duì)接結(jié)果表

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 油酸鈉、棕櫚酸鈉、活血調(diào)脂方對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率的影響 如圖5 所示，與對(duì)照組比較，0.8（低劑量）、1.2（中劑量）、1.6 mg／mL（高劑量）活血調(diào)脂方、1 mmol／L油酸鈉和150 μmol／L 棕櫚酸鈉的處理對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響（P＞0.05），生存率均大于90%，表明沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性，可以用于造模和給藥。

圖5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.2 活血調(diào)脂方對(duì)HepG2 細(xì)胞糖脂代謝的影響 如圖6～7 所示，與未添加胰島素刺激的對(duì)照組比較，胰島素增加了細(xì)胞的葡萄糖消耗（P＜0.05），棕櫚酸鈉處理的模型組對(duì)胰島素的刺激敏感性下降，并且葡萄糖消耗量相比于對(duì)照組下降了15.6%，這表明棕櫚酸鈉誘導(dǎo)成功建立了胰島素抵抗模型。與模型組比較，活血調(diào)脂方中、高劑量組細(xì)胞葡萄糖消耗增加（P＜0.05），并且胰島素刺激后葡萄糖消耗也增加（P＜0.05），表明中、高劑量活血調(diào)脂方增加HepG2 細(xì)胞的葡萄糖攝入，同時(shí)改善了胰島素敏感性；活血調(diào)脂方低劑量組葡萄糖消耗增加（P＜0.05），但胰島素刺激后葡萄糖消耗情況無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

圖6 活血調(diào)脂方對(duì)糖代謝的影響

通過(guò)GPO-PAP 酶法檢測(cè)不同濃度活血調(diào)脂方對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪肝模型中TG 水平和脂質(zhì)積累的影響。如圖7A 所示，模型組的TG 水平約為對(duì)照組的3.7 倍。與模型組比較，低劑量給藥組的TG 水平降低約15.4%，中劑量約為24.6%，高劑量約為47.2%。此外，通過(guò)顯微鏡觀察油紅O 染色后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的差異，如圖7B 所示，與對(duì)照組比較，模型組染色更深，表明模型組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累增加，而中藥給藥組之間的著色程度隨著藥物劑量的增加而遞減。

圖7 活血調(diào)脂方對(duì)糖脂代謝的影響

2.2.3 活血調(diào)脂方對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響 如圖8 所示，與對(duì)照組比較，棕櫚酸鈉誘導(dǎo)的模型組p-IRS-1 和p-Akt 表達(dá)降低（P＜0.05），p-GSK-3β 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，活血調(diào)脂方組細(xì)胞p-IRS-1、p-Akt 表達(dá)升高（P＜0.05），p-GSK-3β 表達(dá)降低（P＜0.05）；與活血調(diào)脂方低劑量組比較，活血調(diào)脂方中、高劑量組細(xì)胞p-IRS-1、p-Akt 表達(dá)升高（P＜0.05），p-GSK-3β 的表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，活血調(diào)脂方改善了胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)，使得糖異生減少，肝糖原合成增加，減少了脂肪酸的合成。

圖8 活血調(diào)脂方對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響

2.2.4 活血調(diào)脂方對(duì)脂代謝通路的影響 如圖9 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞SREBP-1C、SOCS-3、PPARγ 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，活血調(diào)脂方各劑量組細(xì)胞Adiponectin、PPARγ 表達(dá)升高（P＜0.05），SOCS-3、SREBP-1C 表達(dá)降低（P＜0.05）；與活血調(diào)脂方低劑量組比較，活血調(diào)脂方中、高劑量組細(xì)胞SREBP-1C、SOCS-3 表達(dá)降低（P＜0.05），Adiponectin 表達(dá)升高（P＜0.05），活血調(diào)脂方中劑量組PPARγ 表達(dá)升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，活血調(diào)脂方減少了脂肪酸的從頭合成，增加了脂肪酸的燃燒和能量的消耗，并改善胰島素抵抗。

圖9 活血調(diào)脂方對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝通路的影響

3 討論

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明活血調(diào)脂方可以增加葡萄糖的攝入改善胰島素抵抗同時(shí)減少肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的堆積，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果提示活血調(diào)脂方可能通過(guò)胰島素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、PPAR 信號(hào)通路這三條通路調(diào)節(jié)糖脂代謝，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)路徑IRS-1／AKT／GSK-3β 在胰島素抵抗的發(fā)生中起關(guān)鍵作用［13］。脂聯(lián)素是一種抗炎脂肪因子，可以減少肝糖原生成并增加脂肪酸氧化，有助于治療和預(yù)防糖尿病性脂肪肝，PPARγ 的激活可以顯著抑制脂多糖引起的炎癥反應(yīng)，同時(shí)增加脂聯(lián)素的表達(dá)［14］。SOCS-3 的過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致胰島素抵抗和肝臟脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SREBP-1C 的增加，對(duì)SOCS-3 表達(dá)的抑制作用可以改善胰島素敏感性降低肝脂肪水平和血脂水平［15］。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病性脂肪肝其成因可歸為內(nèi)外因2 部分，外因多是貪食高粱肥甘之味，生濕釀痰；內(nèi)因則主要是脾失健運(yùn)，肝失疏泄。病位主要涉及肝脾，病久則五臟皆受累，多見(jiàn)脾虛濕盛兼夾血瘀，治宜健脾祛濕，活血降脂?；钛{(diào)脂方由丹參、荷葉、絞股藍(lán)、西紅花、蒼術(shù)、土茯苓、徐長(zhǎng)卿7 味藥物組成。丹參是近20 年來(lái)中醫(yī)藥治療糖尿病性脂肪肝使用頻次最高的藥物［16］，尚濤等［17］發(fā)現(xiàn)丹參可在改善胰島素抵抗基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善脂代謝和肝功能。絞股藍(lán)提取液可以通過(guò)增強(qiáng)線粒體磷脂的穩(wěn)定性進(jìn)而預(yù)防脂質(zhì)蓄積和氧化應(yīng)激，對(duì)糖尿病性脂肪肝患者有益［18］。荷葉可以增強(qiáng)大鼠的脂質(zhì)代謝并降低血液中甘油三酯水平［19］。蒼術(shù)的揮發(fā)油可以實(shí)現(xiàn)體外降血糖，是治療高血糖的潛在藥物［20］。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)還發(fā)現(xiàn)土茯苓和西紅花均含有槲皮素；肉豆蔻酸存在于土茯苓、西紅花、徐長(zhǎng)卿等藥物中；另外西紅花中還富含異鼠李素、山柰酚等活性成分?；钛{(diào)脂方主要組分能夠調(diào)控GSK3B、INSR、PI3K、PPARγ 等54 個(gè)靶點(diǎn)，介導(dǎo)PPAR 信號(hào)通路、非酒精性脂肪性肝病、胰島素抵抗等32 條通路，參與脂肪酸代謝過(guò)程、對(duì)異源生物刺激的反應(yīng)、類固醇代謝過(guò)程等生物進(jìn)程從而治療糖尿病性脂肪肝。本研究通過(guò)生物信息學(xué)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證了活血調(diào)脂方治療糖尿病性脂肪肝的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，活血調(diào)脂方是治療糖尿病性脂肪肝的一種“多成分，多靶點(diǎn)，多路徑”的臨床復(fù)方，其作用機(jī)制主要是改善糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，本研究為中醫(yī)復(fù)方治療糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病提供新思路和新方法，為后續(xù)研究復(fù)方調(diào)控糖尿病性脂肪肝提供新的理論依據(jù)并指導(dǎo)臨床用藥。