濕疹康凝膠制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)

雷雅婷 張也劉隆基黃丹羅堃嚴(yán)建業(yè)*李順祥*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙410208）

濕疹，中醫(yī)又稱為“濕瘡”［1］，大約有20%的兒童及10%的成人患有本病［2］，隨著生活水平提高及生活方式、體質(zhì)差異、環(huán)境改變，其發(fā)病率近年來有上升趨勢(shì)［3］。目前，治療濕疹，特別是嬰幼兒濕疹尚無特效藥，西醫(yī)大多采用皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑等［4］，雖能有效改善癥狀，但易復(fù)發(fā)，不良反應(yīng)較多，而中藥具有不良反應(yīng)少可有效減少?gòu)?fù)發(fā)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

濕疹康油劑是湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院用于治療濕疹的臨床驗(yàn)方，由蛋黃油、苦參生物堿提取物、冰片等組成，臨床療效肯定，而且無任何不良反應(yīng)，但存在易弄臟衣物、使用不便、生物利用度低等缺點(diǎn)，前期課題組已將其制成凝膠劑，對(duì)改善其生物利用度和用藥依從性、提高臨床療效具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法［5］來優(yōu)化濕疹康凝膠制備工藝，再通過HPLC 法對(duì)具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的苦參堿、氧化苦參堿進(jìn)行含量測(cè)定［6］，以期為該制劑開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為臨床治療嬰幼兒濕疹、濕疹性皮炎提供安全高效的外用新型制劑。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；KQ5200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP224C 分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；數(shù)顯電動(dòng)攪拌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；WGL-230B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；PHS-3C 型PH 計(jì)（杭州齊威儀器有限公司）；NDJ-8s 數(shù)顯黏度計(jì)（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；ELGA 超純水系統(tǒng)（英國(guó)ELGA Lab Water 公司）。

1.2 試劑與藥物 3 批濕疹康凝膠劑（自制，批號(hào)20191103、20191104、20200706）。鮮雞蛋（批號(hào)20191021、20200319，南縣頂香蛋雞養(yǎng)殖專業(yè)合作社）?？鄥ⅲㄅ?hào)20190807，眾益堂中藥材銷售有限公司）、冰片（批號(hào)20181107，福建省青松股份有限公司）經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定，分別為豆科植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根、合成冰片?？鄥A（批號(hào)110805-201709，純度≥98%）、氧化苦參堿（批號(hào)110780-201508，純度≥98%）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、無水乙醇為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Merck 公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠劑制備 取鮮雞蛋適量，煮熟取蛋黃，過24 目篩制粒，鼓風(fēng)干燥直至無水分逸出，取適量至圓底燒瓶中，加8、6 倍量95%乙醇回流提取2次，時(shí)間分別為2、1.5 h，紗布過濾，合并2 次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，得到蛋黃油。

取苦參粗粉適量，加10、8 倍量60%乙醇超聲提取2次，時(shí)間分別為1.5、1 h，棉花過濾，合并2 次濾液，濾液加1% HCl 調(diào)節(jié)pH 至3～4，抽濾，棄去沉淀；酸水液加10% NaOH 調(diào)節(jié)pH至10～11，抽濾，棄去沉淀；堿水液濃縮，置于烘箱中干燥，得浸膏，加水分散，棄去不溶物，三氯甲烷萃取3次，棄去水層，合并三氯甲烷層，回收三氯甲烷至干，于烘箱干燥，得到苦參生物堿提取物。

取適量甘油至干燥燒杯中，加入卡波姆940 攪拌均勻，再加入超純水充分溶脹，作為基質(zhì)Ⅰ，靜置過夜；將冰片加到蛋黃油中，攪拌均勻，作為基質(zhì)Ⅱ，將基質(zhì)Ⅰ加到基質(zhì)Ⅱ中，攪拌均勻，滴加聚山梨酯80，攪拌均勻，滴加丙二醇，攪拌均勻，加入溶有苦參生物堿提取物、山梨酸鉀的超純水，攪拌均勻，三乙醇胺調(diào)節(jié)pH 至6～7，一直攪拌直至呈乳膠狀，即得。

2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)確定

2.2.1 外觀 凝膠外觀應(yīng)光滑，均勻細(xì)膩，無分層，無團(tuán)塊，無氣泡，各項(xiàng)指標(biāo)均理想者為5分，根據(jù)均勻度、有無分層、有無團(tuán)塊氣泡及其大小給予不同分?jǐn)?shù)。

2.2.2 理化性質(zhì)

2.2.2.1 黏度 在室溫（25 ℃）下測(cè)定黏度，選用3號(hào)轉(zhuǎn)子，設(shè)定轉(zhuǎn)速為1.5 r／min，黏度在40 000～50 000 mPa·s 范圍內(nèi)者為5分，根據(jù)其實(shí)際數(shù)值給予不同分?jǐn)?shù)。

2.2.2.2 粘附力 按照NaKamura［7］報(bào)道的方法，將100 g 熱瓊脂（1%）或黏蛋白（2%）溶液（溶劑為pH ＝7.0 的磷酸鹽緩沖液）均勻涂抹于20 cm×20 cm 的玻璃板上，在4～8 ℃下放置3 h，在溫度22 ℃、相對(duì)濕度77%下平衡1 h，再將凝膠滴于玻璃板的一端并呈90°放置，測(cè)定在0.5、1、2、3、4、5 h 的移動(dòng)距離，最小者為5分，根據(jù)其實(shí)際數(shù)值給予不同分?jǐn)?shù)。

2.2.2.3 涂展性 凝膠應(yīng)易涂于皮膚上，能快速鋪展，無油膩感，較為舒適，各項(xiàng)指標(biāo)均理想者為5分，根據(jù)鋪展難易、速度、舒適感給予不同分?jǐn)?shù)。

2.2.2.4 pH值在室溫（25 ℃）下取凝膠2 g，加入20 mL水，正反方向攪拌5 min，測(cè)定pH值，在6～7 范圍內(nèi)者為5分，根據(jù)其實(shí)際數(shù)值給予不同分?jǐn)?shù)。

2.2.2.5 保濕率 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道，精密稱取凝膠適量，干燥至恒定質(zhì)量m0，均勻涂布于載玻片上，置于溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（43.16±0.39）%的恒溫恒濕密閉干燥器中24 h 后取出，精密稱定質(zhì)量mt，計(jì)算保濕率，公式為保濕率＝（mt／m0）×100%，最高值者為5分，根據(jù)其實(shí)際數(shù)值給予不同分?jǐn)?shù)。

2.2.3 穩(wěn)定性 參考文獻(xiàn)［9］報(bào)道。

2.2.3.1 離心穩(wěn)定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，3 000 r／min 離心15 min，有分層現(xiàn)象為0分；未分層者繼續(xù)離心15 min，有分層現(xiàn)象為1分；未分層者繼續(xù)離心15 min，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.3.2 耐熱穩(wěn)定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，50 ℃恒溫箱內(nèi)放置48 h，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.3.3 耐寒穩(wěn)定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，-20 ℃冰箱中放置48 h，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.3.4 耐冷穩(wěn)定性 取5 g 凝膠至5 mL 玻璃離心管中，4 ℃冰箱中放置48 h，不分層為5分，輕度分層為3分，明顯分層為1 分。

2.2.4 綜合評(píng)分計(jì)算 凝膠外觀應(yīng)光滑細(xì)膩，具有一定的黏度，能粘附在皮膚上，使有效成分更充分地發(fā)揮藥效，在常溫時(shí)保持膠狀，不干涸或液化，并在運(yùn)輸貯存過程中要具有一定的穩(wěn)定性。因此，對(duì)“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下指標(biāo)賦予權(quán)重，公式分別為理化性質(zhì)＝（黏度評(píng)分＋粘附力評(píng)分＋涂展性評(píng)分＋pH 評(píng)分＋保濕率評(píng)分）× 20%、穩(wěn)定性＝（離心穩(wěn)定性評(píng)分＋耐熱穩(wěn)定性評(píng)分＋耐寒穩(wěn)定性評(píng)分＋耐冷穩(wěn)定性評(píng)分）× 25%，綜合評(píng)分＝外觀× 0.2 ＋理化性質(zhì)× 0.5 ＋穩(wěn)定性× 0.3。

2.3 單因素試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法，改變凝膠劑中某一種物料成分的用量，固定其他用量不變，制備凝膠劑［10］，以“2.2.4”項(xiàng)下綜合評(píng)分為指標(biāo)，對(duì)卡波姆940、蛋黃油、甘油、聚山梨酯80、丙二醇用量、pH 值進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)卡波姆940、蛋黃油、聚山梨酯80 用量對(duì)制備工藝的影響較大，三者范圍分別為0.9%～1.1%、40%～60%、2%～5%。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇卡波姆940 用量（X1）、蛋黃油用量（Χ2）、聚山梨酯80 用量（X3）作為影響因素，“2.2.4”項(xiàng)下綜合評(píng)分（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法［11］優(yōu)化制備工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到方程為Y＝4.82 ＋0.000X1-0.39X2＋ 0.19X3＋ 0.025X1X2-0.025X1X3＋0.050X2X3-0.，方差分析見表3。由此可知，模型F為109.75，P＜0.000 1，表明其影響極顯著；失擬項(xiàng)P＝0.788 0＞0.05，表明模型無失擬現(xiàn)象，可用于預(yù)測(cè)。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析［12］，結(jié)果見圖1。由此可知，綜合評(píng)分隨著卡波姆、蛋黃油、聚山梨酯80 用量增加均呈先升后降的趨勢(shì)，以蛋黃油、聚山梨酯80 用量更明顯。最終確定，最優(yōu)工藝卡波姆940 用量1.00%，蛋黃油用量47.59%，聚山梨酯80 用量4.13%。

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

再按照上述優(yōu)化工藝平行制備3 份凝膠，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由此可知，綜合評(píng)分與預(yù)測(cè)值接近，偏差均小于2%，表明模型預(yù)測(cè)性良好，工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests（n＝3）

2.5 質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 外觀性狀觀察 根據(jù)2020 版《中國(guó)藥典》四部制劑通則0114［13］，發(fā)現(xiàn)凝膠均勻細(xì)膩，在常溫下保持凝膠狀，不干涸或液化，黏度適中，易涂布于皮膚，不下沉、結(jié)塊。

2.5.2 pH 值測(cè)定 取3 批凝膠至燒杯中，每批2 g，加20 mL 超純水?dāng)嚢? min，測(cè)定pH，每批3次，測(cè)得平均pH 值分別為6.47、6.52、6.50。

2.5.3 離心穩(wěn)定性考察 取3 批凝膠至10 mL 離心管中，每批5 g，3 000 r／min 離心30 min 后取出，發(fā)現(xiàn)無分層、藥物析出、出現(xiàn)沉淀等現(xiàn)象，表明制劑離心穩(wěn)定性良好。

2.5.4 黏度測(cè)定 在室溫（25 ℃）下測(cè)定3 批凝膠黏度，選用3 號(hào)轉(zhuǎn)子，設(shè)定轉(zhuǎn)速為1.5 r／min，測(cè)得黏度均在40 000～50 000 mPa·s 范圍內(nèi)。

2.6 苦參堿、氧化苦參堿含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件 Hypersil HN2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-無水乙醇-3%磷酸，梯度洗脫，程序見表5；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表5 梯度洗脫程序Tab.5 Gradient elution programs

2.6.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品苦參堿0.006 2 g、氧化苦參堿0.006 0 g，加入3 mL乙腈，制成兩者質(zhì)量濃度分別為2.07、2.00 mg／mL的貯備液，分別吸取36、113 μL，乙腈定容至3 mL，即得（苦參堿、氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為25、75 μg／mL）。

2.6.3 供試品溶液制備 參考文獻(xiàn)［14］報(bào)道，精密稱取凝膠1.0 g，置于具塞三角錐形瓶中，加濃氨試液l mL、三氯甲烷20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，放冷，三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液至蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.6.4 陰性樣品溶液制備 精密稱取缺苦參堿、氧化苦參堿的陰性樣品1.0 g，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.6.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖2。由此可知，供試品溶液色譜圖在對(duì)照品溶液相應(yīng)位置有相同色譜峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.6 方法學(xué)考察

2.6.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各10 μL，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得苦參堿、氧化苦參堿方程分別為Y＝5 247.4X-5 147.9（r＝1.000 0）、Y＝4 831.4X-13 230（r＝0.999 9），分別在2.5～50.0、7.5～150.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.6.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取凝膠適量，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得苦參堿、氧化苦參堿峰面積RSD 分別為0.56%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批凝膠，按“2.6.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得苦參堿、氧化苦參堿含量RSD 分別為1.51%、1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得苦參堿、氧化苦參堿峰面積RSD 分別為1.16%、1.94%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的凝膠6份，每份約0.5 g，精密稱定，加入一定量對(duì)照品溶液，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，苦參堿、氧化苦參堿平均加樣回收率分別為96.66%、99.33%，RSD 分別為0.90%、2.13%。

2.6.7 樣品含量測(cè)定 精密稱取3 批凝膠，每批1.0 g，平行3份，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定10 μL，計(jì)算含量，結(jié)果見表6。

表6 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

在給藥系統(tǒng)制備工藝優(yōu)化中，常需考察多個(gè)因素的多個(gè)水平，為減少試驗(yàn)次數(shù)，并考察不同因素之間的相互作用［15］，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化濕疹康凝膠制備工藝，發(fā)現(xiàn)卡波姆940、蛋黃油、聚山梨酯80 用量過少或過多都會(huì)影響?zhàn)ざ?、涂展性、?xì)膩度等。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，按最優(yōu)工藝制備的濕疹康凝膠劑綜合評(píng)分高，而且與預(yù)測(cè)值接近，表明模型擬合度高，具有良好的預(yù)測(cè)能力，為該制劑開發(fā)提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

苦參堿、氧化苦參堿作為苦參主要有效成分，具有抗皮膚炎癥和變態(tài)反應(yīng)、防止皮膚疤痕形成等作用，臨床上廣泛用于濕疹治療［16］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)對(duì)最優(yōu)工藝所制得濕疹康凝膠中苦參堿、氧化苦參堿含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)便快速，可用于該制劑質(zhì)量控制，并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。