復(fù)方紅黃口含片成型工藝優(yōu)化及其耐缺氧作用研究

李婉玉 李琳馬慧萍魯艷梅 石曉峰*張朋朋張家旭董學(xué)鳳葉倩女

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州730050； 3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科全軍高原損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730050）

復(fù)方紅黃口含片由紅景天、黃芪、黃精、枸杞子4 味中藥組成，方中君藥紅景天是防治缺氧和高原反應(yīng)的最常用中藥；補(bǔ)氣養(yǎng)陰的黃芪和滋陰益腎的黃精、枸杞子可減緩紅景天苦寒藥性，同時(shí)增強(qiáng)補(bǔ)益功效，并且三者具有耐缺氧、抗疲勞、抗氧化應(yīng)激等作用［1-3］。

缺氧威脅人體健康，并且城市上班族等腦力工作者因?yàn)橛媚X過度、缺乏鍛煉等原因容易產(chǎn)生腦供血不足、氧氣利用不足的亞健康問題，故開發(fā)具有耐缺氧功能的產(chǎn)品具有很大的應(yīng)用前景。目前，有上述作用的藥物和保健品以西藥、紅景天提取物或其他單味中藥為主［4-6］，并且耐缺氧、抗疲勞雙功能保健品中膠囊、飲品占比較大，片劑較少［7］。

本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究［8-9］的基礎(chǔ)上，研發(fā)出適應(yīng)當(dāng)下快節(jié)奏生活需求、口感優(yōu)良、服用攜帶方便、具有耐缺氧作用的口含片，并以外觀、口感、硬度、崩解時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化其成型工藝，再通過常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其耐缺氧作用，以期為該復(fù)方開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 紅景天（批號(hào)20190127，隴南市惠康中藥材有限公司）；黃芪（批號(hào)20180711）、黃精（批號(hào)20180823）、枸杞子（批號(hào)20180823）（安寧杏林藥材批發(fā)部），經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院石曉峰主任藥師檢驗(yàn)鑒定為正品，均符合2020 版《中國(guó)藥典》 一部規(guī)定。無水乳糖（河南春祥化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)18102206）；微晶纖維素（山東光大科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20171201）；阿斯巴 甜（江蘇漢光甜味劑有限公司，批號(hào)W17032015）；硬脂酸鎂（安徽山河藥用輔料有限公司，批號(hào)170130）。復(fù)方丹參滴丸（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)190709）。BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20201010）；總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20201211）、總超氧化物歧酶（T-SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210116）、還原型谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200930）、過氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200818）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200831）、過氧化氫（H2O2）檢測(cè)測(cè)試盒（批號(hào)20210119）、NO 化學(xué)法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20200808）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。無水乙醇為分析純。

1.2 儀器 YC-010 型多功能提取濃縮回收機(jī)組（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）；HH-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DGZ-76型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；CX-100 型快速開蓋萬能高速粉碎機(jī)（上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司）；TDP-1.5 型單沖壓片機(jī)（上海綠翊機(jī)械制造有限公司）；SY-3D型片劑四用測(cè)定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；AE260 型電子天平（萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；JXFSTPRP-24 型全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司）；3K15 型低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；SpectraMax i3 型全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性Balb／c 小鼠150只，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，使用許可證號(hào)SYCK（軍）2020-0040，飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫度23～27 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，維持飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始實(shí)驗(yàn)，其間自由進(jìn)食進(jìn)水。

2 方法

2.1 制備工藝研究

2.1.1 浸膏粉制備 按處方比例稱取紅景天、黃芪、黃精、枸杞子，其中紅景天、黃芪加14 倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次138 min，濾過，藥渣與藥液分開備用；黃精、枸杞子與藥渣合并，加入按比例稱取的原處方飲片質(zhì)量的10 倍量水煎煮提取3次，每次2.94 h，濾過，濾液備用，將醇提藥液濃縮至無醇味后與水煎液合并，濃縮，制得浸膏，干燥，粉碎，過120 目篩，即得。

2.1.2 口含片制備 按配方稱取“2.1.1”項(xiàng)下浸膏粉和輔料，過120 目篩，再加入一定比例甜味劑，混合均勻后加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，濕法制軟材，過18 目篩制粒，在50 ℃下烘干，加入適量硬脂酸鎂混勻壓片，即得。

2.1.3 指標(biāo)檢測(cè) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，以口含片外觀、口感、硬度、崩解時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，四者權(quán)重分別為0.2、0.3、0.2、0.3［10-11］，采用綜合加權(quán)評(píng)分法［12］評(píng)價(jià)處方中主要因素對(duì)口含片質(zhì)量的影響。

2.1.3.1 外觀 取本品10片，置于白色平盤中，在自然光下觀察其完整度、色澤、表面光潔度，按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。

2.1.3.2 口感 征集15 名志愿者，采用盲法進(jìn)行品嘗，詢問其感受，按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。

2.1.3.3 硬度測(cè)定 采用片劑硬度儀測(cè)定3～6 片本品的硬度，取平均值，按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。另外，不需要包衣的素片為了防止其在包裝運(yùn)輸中出現(xiàn)松片裂片現(xiàn)象，硬度應(yīng)不小于30 N。

2.1.3.4 崩解時(shí)間 按2020 年版《中國(guó)藥典》四部通則0921 含片崩解時(shí)限檢查法檢查，要求不得在10 min 內(nèi)全部崩解或溶解［13］，按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。

表1 各指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Scoring criteria for various indices

2.1.4 單因素試驗(yàn)

2.1.4.1 浸膏粉用量 考慮到片劑載藥量不宜過低，故將浸膏粉比例控制在20% 以上；考慮到浸膏粉具有較強(qiáng)的吸濕性，而且還會(huì)影響口感，故其用量不宜超過50%。因此，將浸膏粉用量設(shè)置為25%、30%、35%、40%、45%，填充劑（乳糖-微晶纖維素）比例為3∶1，甜味劑（阿斯巴甜）用量為1%（以浸膏粉、填充劑總量計(jì)），潤(rùn)濕劑為70%乙醇，潤(rùn)滑劑為1% 硬脂酸鎂（以干顆?？偭坑?jì)）。

2.1.4.2 填充劑比例 將乳糖和微晶纖維素以一定比例混合，作為填充劑。固定浸膏粉用量為40%，則乳糖-微晶纖維素總量為60%，再將兩者比例設(shè)置為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，甜味劑用量為1%，潤(rùn)濕劑為70% 乙醇，潤(rùn)滑劑為1%硬脂酸鎂。

2.1.4.3 甜味劑用量 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同填充劑比例制得的片劑均存在明顯澀味，故要加入適量矯味劑來改善口感。阿斯巴甜甜味純正，不易吸濕，故將其作為甜味劑，用量設(shè)置為0、0.5%、1%、1.5%、2%。

2.1.4.4 潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù) 選擇乙醇作為潤(rùn)濕劑，將其體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為65%、70%、75%、80%、85%。

2.1.4.5 潤(rùn)滑劑用量 選擇滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鎂作為潤(rùn)滑劑，將其用量分別設(shè)置為1%、1%、1%或0.5%。

2.1.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸膏粉用量（A）、填充劑比例（B）、甜味劑用量（C）、潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù)（D）作為影響因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，因素水平見表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

2.2 耐缺氧作用研究

2.2.1 分組與給藥 小鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、陽(yáng)性組（復(fù)方丹參滴丸［14］）、復(fù)方紅黃口含片低劑量組、復(fù)方紅黃口含片中劑量組、復(fù)方紅黃口含片高劑量組，每組30只，空白組灌胃給予0.5%CMC-Na 溶液，其他各組灌胃給予相應(yīng)藥物的0.5%CMC-Na 溶液。按照人用劑量折算，陽(yáng)性組為0.15 g／kg，復(fù)方紅黃口含片低劑量組為3 g／kg，復(fù)方紅黃口含片中劑量組為5 g／kg，復(fù)方紅黃口含片高劑量組為7.5 g／kg（復(fù)方紅黃口含片各劑量組給藥量按照片劑載藥量換算，分別為人用劑量的10、20、30 倍），各組連續(xù)給藥10 d，容量均為0.2 mL／10 g，每天1 次。

2.2.2 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 各組小鼠于末次灌胃給藥1 h后，放入裝有5 g 鈉石灰的250 mL 磨口瓶中，瓶中預(yù)先放1 張濾紙用于吸收排泄物。實(shí)驗(yàn)前，先在瓶口處均勻涂抹凡士林，放入小鼠后立即塞緊瓶蓋以防止漏氣，隨后開始計(jì)時(shí)，以小鼠呼吸停止、腹部不起伏為觀察指標(biāo)，記錄存活時(shí)間，計(jì)算其延長(zhǎng)率。

2.2.3 亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn) 各組小鼠于末次灌胃給藥1 h后，腹腔注射2.4% 亞硝酸鈉溶液，容量為0.1 mL／10 g，注射完成后立即開始計(jì)時(shí)，以呼吸停止、無明顯活動(dòng)特征為指標(biāo)，記錄存活時(shí)間。

2.2.4 急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn) 各組小鼠于末次灌胃給藥1 h后，用鋒利的手術(shù)剪自頸部逐只斷頭，記錄斷頭后小鼠張口喘氣次數(shù)。

2.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取小鼠腦組織適量，按照相關(guān)試劑盒說明書檢測(cè)T-AOC、T-SOD、GSH、CAT 活性及MDA、H2O2、NO 水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則多組間比較采用ANOVA 檢驗(yàn)；若符合正態(tài)分布而且方差齊，則組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；若不符合方差齊性，則組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布而且方差不齊，則多組間比較采用獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 浸膏粉用量 當(dāng)浸膏粉用量增加時(shí)，硬度升高，崩解時(shí)間延長(zhǎng)，但其本身的酸澀味會(huì)使口含片口感變差，并且崩解時(shí)間不宜過長(zhǎng)，故確定為40%，見圖1。

圖1 浸膏粉用量對(duì)口含片質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of extract powder consumption on the quality of buccal tablets

3.1.2 填充劑比例 當(dāng)乳糖與微晶纖維素比例為3∶1時(shí)，口含片外觀、口感理想，硬度、崩解時(shí)間均符合藥典要求，故確定為3∶1，見圖2。

圖2 填充劑比例對(duì)口含片質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of filler ratio on the quality of buccal tablets

3.1.3 甜味劑用量 當(dāng)甜味劑用量為1%時(shí)，口含片外觀、口感理想，硬度、崩解時(shí)間均符合藥典要求，故確定為1%，見圖3。

圖3 甜味劑用量對(duì)口含片質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of sweetener consumption on the quality of buccal tablets

3.1.4 潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù) 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，顆粒太松散，不利于壓片；過低時(shí)，浸膏粘手，也不利于制粒，故確定為75%，見圖4。

圖4 潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)口含片質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of wetting agent concentration on the quality of buccal tablets

3.1.5 潤(rùn)滑劑用量 在相同用量下，加入二氧化硅、硬脂酸鎂后顆粒流動(dòng)性較好，但前者會(huì)使片劑發(fā)生脫蓋現(xiàn)象，故不予考慮；后者為口含片常用潤(rùn)滑劑，但其本身為疏水性物質(zhì)，又覆蓋在顆粒表面，故用量過大時(shí)可能影響片劑水浸潤(rùn)性，造成其崩解或溶出遲緩，一般不宜超過1%，故確定為0.5%，見表3。

表3 潤(rùn)滑劑用量對(duì)口含片質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of lubricant consumption on the quality of buccal tablets

3.2 正交試驗(yàn) 結(jié)果見表4，方差分析見表5。由此可知，各因素影響程度依次為B＞A＞C＞D，即填充劑比例＞浸膏粉用量＞甜味劑用量＞潤(rùn)濕劑體積分?jǐn)?shù)；因素A、B、C對(duì)口含片質(zhì)量有顯著影響（P＜0.05），而D無顯著影響（P＞0.05），故參考文獻(xiàn)［15-16］與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，將D作為誤差項(xiàng)。最終確定，最優(yōu)工藝為A3B2C2D3，即浸膏粉用量40%，填充劑（乳糖-微晶纖維素）比例3∶1，甜味劑（阿斯巴甜）用量1.0%，潤(rùn)濕劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)80%，潤(rùn)滑劑（硬脂酸鎂）用量0.5%。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備3批口含片，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6。由此可知，口含片崩解時(shí)間、硬度理想，口感良好，脆碎度、片重差異符合藥典規(guī)定。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.6 Results of verification tests（n＝3）

3.4 耐缺氧作用

3.4.1 常壓耐缺氧存活時(shí)間 與空白組比較，復(fù)方紅黃口含片中、高劑量組小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量組長(zhǎng)于陽(yáng)性組，見表7。

表7 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響（， n＝10）Tab.7 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time under normal pressure（，n＝10）

表7 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響（， n＝10）Tab.7 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time under normal pressure（，n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4.2 亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間 注射亞硝酸鈉后，各組小鼠存活時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表8。

表8 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響（， n＝10）Tab.8 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time poisoned by sodium nitrite（， n＝10）

表8 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響（， n＝10）Tab.8 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time poisoned by sodium nitrite（， n＝10）

3.4.3 張口喘氣次數(shù) 與空白組比較，復(fù)方紅黃口含片各劑量組小鼠張口喘氣次數(shù)升高（P＜0.05，P＜0.01），見表9。

表9 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠張口喘氣次數(shù)的影響（，n＝10）Tab.9 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse mouth opening and wheezing frequency（， n＝10）

表9 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠張口喘氣次數(shù)的影響（，n＝10）Tab.9 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse mouth opening and wheezing frequency（， n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4.4 腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 與空白組、陽(yáng)性組比較，復(fù)方紅黃口含片中、高劑量組小鼠腦組織T-SOD 活性升高（P＜0.05），各劑量組CAT 活性升高（P＜0.01）。各組小鼠腦組織GSH 活性及MDA、NO 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組比較，復(fù)方紅黃口含片低劑量組小鼠腦組織T-AOC 活性升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性組比較，復(fù)方紅黃口含片各劑量組小鼠腦組織T-AOC 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組比較，復(fù)方紅黃口含片高劑量組小鼠腦組織H2O2水平降低（P＜0.05）。見表10。

表10 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（， n＝10）Tab.10 Effects of Compound Honghuang Buccal Tablets on oxidative stress indices in mouse brain tissues（， n＝10）

表10 復(fù)方紅黃口含片對(duì)小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（， n＝10）Tab.10 Effects of Compound Honghuang Buccal Tablets on oxidative stress indices in mouse brain tissues（， n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 討論

中藥片劑具有易吸濕的缺點(diǎn)，課題組前期選擇乳糖-甘露醇作為填充劑，但不同比例兩者制得的片劑都極易吸濕，故又考察了乳糖、甘露醇單獨(dú)使用，但效果均不理想。查閱文獻(xiàn)［17-18］發(fā)現(xiàn)，乳糖有甜味，吸濕性較低，為口含片常用輔料，增加其比例可提高片劑硬度，使其外觀更完整光潔；微晶纖維素是天然纖維素的水解產(chǎn)物，性質(zhì)穩(wěn)定，與主藥不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，具有良好的流動(dòng)性與可壓性，可使顆粒松散均勻便于壓片［19］。因此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用乳糖、微晶纖維素作為復(fù)方紅黃口含片填充劑，并優(yōu)選出兩者最佳比例為3∶1。

口含片中浸膏粉比例只占40%，耐缺氧實(shí)驗(yàn)若直接以其給藥則劑量難以準(zhǔn)確控制，而且用量較大。因此，本實(shí)驗(yàn)直接采用浸膏粉，并參考市面上其他口含片用量，將低、中、高劑量分別換算成人體質(zhì)量的10、20、30倍，發(fā)現(xiàn)不同劑量給藥后小鼠進(jìn)食飲水正常，無不良反應(yīng)出現(xiàn)，表明復(fù)方紅黃口含片安全范圍較寬。

缺氧后腦組織能量轉(zhuǎn)化不足，活性氧、有害氮氧自由基增多，可攻擊細(xì)胞而引起氧化應(yīng)激［20］。T-SOD、GSH、CAT、T-AOC 是重要的抗氧化物酶［21］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給藥后四者水平升高，表明復(fù)方紅黃口含片可調(diào)節(jié)機(jī)體在缺氧時(shí)氧化-抗氧化平衡。MDA、H2O2、NO 是氮氧自由基有害代謝產(chǎn)物，可反映細(xì)胞受損程度，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給藥后三者水平均有不同程度的降低，表明復(fù)方紅黃口含片可減緩缺氧時(shí)細(xì)胞和組織受到的損傷。