用于抗結(jié)核藥物異煙肼檢測的碳點/二氧化錳納米探針的構(gòu)建

王新旭，樊柄君，閆曉輝，王 寧

（1.山西醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學 法醫(yī)學院，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，山西 太原 030001）

肺結(jié)核是一種嚴重威脅人類健康的呼吸道傳染病，每年全球范圍內(nèi)有數(shù)百萬人口罹患結(jié)核?。?］。異煙肼（Isoniazid，INH）作為主要的抗結(jié)核藥物之一，在現(xiàn)階段肺結(jié)核的治療中通常與其他藥物聯(lián)合使用。臨床上，每個成年人每天服用INH 的最佳劑量約為4 ～6 mg/kg，不合理使用不僅會增加耐藥性風險，還會導致肝毒性［1］、神經(jīng)系統(tǒng)毒性［2］、過敏性皮疹［3］等副作用，甚至死亡。INH 含量的測定在藥品質(zhì)量控制或用藥安全方面具有重要意義。

目前為止，已報道了各種測定INH的分析方法，包括滴定法［4］、紫外分光光度法［5］、流動注射化學發(fā)光法［6-7］、毛細管電泳［8］、電化學技術(shù)［9-10］、高效液相色譜（HPLC）［11-12］等。這些方法各有優(yōu)勢，但也有局限性，如傳統(tǒng)的分光光度法、化學發(fā)光法和毛細管電泳法靈敏度不高；高效液相色譜法通常需要先進和復雜的儀器、大量的有機試劑和復雜的操作；電化學電極表面易受污染，影響測定的重復性和靈敏度。與上述方法相比，熒光光譜法具有選擇性強、成本較低、操作簡單、靈敏度高的優(yōu)勢，在檢測領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，現(xiàn)已用于INH的定量檢測。Zahra等［13］合成了殼聚糖納米碳點作為熒光探針檢測INH；Qin等［14］將葉酸熱解合成碳點，以熒光法實現(xiàn)了生物樣本中INH的檢測。這些熒光探針檢測異煙肼的檢出限為μmol水平。為進一步降低檢出限，提高靈敏度，構(gòu)建一種能夠簡單、快速、靈敏檢測INH的納米熒光探針顯得非常重要。

CDs是一種尺寸小于10 nm的新型碳納米材料，具有較高的熒光量子產(chǎn)率、較強的抗光漂白性能和良好的生物相容性，近年來已成為生物成像［15］、生化分析［16］、微量分析［17］等領(lǐng)域的研究熱點，在熒光檢測領(lǐng)域也受到了廣泛的關(guān)注［18］。MnO2納米材料具有比表面積大、制備方便、紫外和可見光區(qū)吸收能力強等優(yōu)點，優(yōu)異的光吸收性能賦予其作為猝滅劑構(gòu)建納米熒光探針的潛能，在分析領(lǐng)域引起了極大關(guān)注［19-21］?；贛nO2納米片對CDs熒光的良好猝滅效果，許多研究人員將這兩種納米材料結(jié)合用于檢測，并在分子［22］、離子［23］和藥物［24-25］分析領(lǐng)域展現(xiàn)出卓越的應用價值和廣闊的發(fā)展前景。

本文使用微波法快速合成了CDs，通過在該CDs 溶液中加入MnO2納米片構(gòu)建了一種檢測INH 的納米熒光探針。采用透射電子顯微鏡（TEM）、X 射線光電子能譜（XPS）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、X 射線衍射（XRD）、紫外可見吸收光譜（UV-Vis）和熒光光譜對材料的形貌和結(jié)構(gòu)進行表征。MnO2納米片可通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）猝滅CDs 的熒光；但加入INH 之后，INH 與MnO2發(fā)生氧化還原，碳點的熒光得以恢復，據(jù)此可對INH 進行測定。該納米探針不僅成本低、易于制備、綠色環(huán)保，且對INH具有高選擇性和高靈敏度的優(yōu)勢，在生物樣品INH的檢測中具有廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

4500型熒光分光光度計、U3900紫外可見分光光度計（日本日立公司）；JEM-1011透射電子顯微鏡（日本電子光學公司）；Paragon 1000型紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；微波爐（700 W，中國格蘭仕微波生活電器有限公司）；FA1004N 電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；PHSJ3F 型實驗室pH 計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）；791 磁力加熱攪拌器（北京科偉永興儀器有限公司）；透析袋購自上海橋星貿(mào)易有限公司。

無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠，分析純）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；磷酸（85%）、磷酸鈉（分析純）（南京化學試劑有限公司）；乙腈（天津市博迪化工股份有限公司）；異煙肼（INH）、檸檬酸、硫脲、奎寧、四甲基氫氧化銨（TMA·OH）、四水合氯化錳（MnCl2·4H2O）、N-乙基順丁烯二酰亞胺（NEM）、葡萄糖、尿素、尿酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸、草酸、NaOH、H2O2、KNO3、CaCl2、NaCl均購自阿拉丁工業(yè)公司（中國上海）。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 CDs及MnO2納米片的制備

CDs 的制備［26］：將檸檬酸（1 g）和硫脲（1 g）溶于去離子水（DI，20 mL）中，將該溶液在700 W 微波爐中加熱5 min，得到深色的粘性固體。將固體產(chǎn)物加水溶解，離心10 min（8 000 r/min）去除沉淀。棕色上清液以15 000 r/min 離心10 min，得到的上清液再用去離子水以透析膜（1 000 Da）透析12 h，冷凍干燥得到固體粉末。

MnO2納米片的制備［27］：將10 mL 四水合氯化錳（MnCl2·4H2O，0.3 mol/L）和20 mL 四甲基氫氧化銨（TMA·OH，0.6 mol/L，含3%（質(zhì)量分數(shù)）的H2O2）混合，25 ℃攪拌反應12 h，10 000 r/min 離心15 min，收集沉淀。最后，將所得產(chǎn)物分別用超純水和甲醇各洗滌3次，收集沉淀，50 ℃下干燥1 h。

1.3 熒光檢測INH

將50 μL MnO2納米片溶液（9.5 mg/mL）加入500 μL CDs 溶液（0.1 mg/mL）中，用PBS 緩沖液（pH 7.4）定容至20 mL，形成CDs/MnO2溶液。取10 μL INH 溶液于熒光比色皿中，用配制好的CDs/MnO2溶液定容至2 mL。室溫下反應15 min 后，測定體系的熒光強度，在360 nm 激發(fā)波長下記錄熒光發(fā)射光譜（激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm）。

1.4 熒光量子產(chǎn)率的測定

以硫酸奎寧為參比樣品，分別記錄CDs溶液和硫酸奎寧（QYs＝0.54，ηs＝1.33）的紫外可見吸光度值和熒光發(fā)射光譜，用公式QY＝QYs×（Iu/Is）×（As/Au）×（ηu/ηs）2計算CDs 的熒光量子產(chǎn)率。式中，QY為熒光量子產(chǎn)率；I為積分強度，A為吸光度；η為溶液的折光率，下標u 和s 分別代表CDs 和硫酸奎寧。通過計算得到CDs的熒光量子產(chǎn)率為22.34%。

1.5 實際樣品的制備

尿樣和血樣的制備：人的尿樣和血樣由健康志愿者提供。首先將尿液以10 000 r/min 離心30 min，收集上清液，用超純水稀釋100 倍，置于4 ℃冰箱中備用。采血后立即取血漿，于3 000 r/min 離心5 min，保存于4 ℃冰箱。使用時向血漿中加入等體積乙腈，攪拌1 min 后，在4 000 r/min 下離心15 min，得到上清液，向上清液中加入NEM（150μmol/L）以阻斷巰基物質(zhì)的干擾。

片劑樣品的制備：在研缽中將INH片劑充分研磨，將得到的粉末溶解于50 mL蒸餾水中，稀釋100倍，用0.22μm微孔濾膜過濾，得到澄清溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs與MnO2納米片的結(jié)構(gòu)表征

用透射電子顯微鏡（TEM）對CDs和MnO2納米片的形貌進行表征。如圖1A所示，CDs顆粒形狀接近球形，分散性良好，粒徑分布在2.0～3.0 nm。HRTEM 圖像（圖1A 插圖）顯示，CDs晶格間距為0.21 nm。圖1B顯示，MnO2納米片具有典型的二維片狀形貌。X射線衍射（XRD）圖譜（圖1C）顯示CDs在22.9°處有一個較寬衍射峰，表明CDs存在無序的碳結(jié)構(gòu)；MnO2納米片在12.1°、24.5°、36.6°和65.6°處有特征峰，與文獻中α-MnO2納米片的特征峰一致，說明制備的為α晶型的MnO2納米片［28］。

此外，F(xiàn)T-IR光譜（圖1D）表明CDs表面存在多種官能團。3 431 cm-1處的峰代表N—H/O—H的伸縮振動，表明CDs含有大量的氨基和羥基，這些基團賦予CDs良好的親水性。3 600 ～3 100 cm-1處的寬吸收峰屬于O—H和N—H的伸縮振動，位于3 182、1 663、1 415 cm-1處的峰分別屬于C—H、C==C和C—N的伸縮振動，1 709 cm-1處的吸收峰代表—COOH中C==O的伸縮振動，2 060 cm-1處的吸收峰歸屬于C≡≡N的伸縮振動，2 366 cm-1和1 185 cm-1處的吸收峰分別代表S—H和C==S的伸縮振動。MnO2納米片的FTIR圖（圖1D）在3 405、1 643、521 cm-1處的峰分別歸屬于O—H、C—O和Mn—O的伸縮振動。

圖1 CDs（A）、MnO2納米片（B）的TEM圖譜及其XRD圖譜（C）和FT-IR圖（D）Fig.1 TEM images of CDs（A）and MnO2 nanosheets（B），and their XRD（C）and FT-IR（D）patterns the inset A shows the HRTEM image of CDs

CDs的X射線光電子能譜（XPS）如圖2A所示，161.7、225.0、282.0、398.1、528.9 eV處出現(xiàn)的尖峰分別對應S2p、S2s、C1s、N1s和O1s，表明所得到的CDs主要由碳、氮、氧和硫元素組成。將CDs的XPS總譜分解得到C1s、N1s、O1s和S2p的精細圖譜。C1s在284.5、285.6、287.8、288.8 eV處的吸收分別代表C==C、C—N/C—O、C==N/C==O 和O—C==O 基團。N1s譜在399.1、399.8 eV 處有兩個峰，分別對應C—N—C 和N—C 鍵。O1s 的擬合譜圖在531.6、533.7 eV 處有兩個峰，分別歸屬于C==O 和C—OH/C—O—C鍵［28］。在S2p的擬合譜圖中有4個峰，分別對應亞砜（164.9 eV）、—C==S—（163.9 eV）、—C—Sn—C（163.0 eV，n＝1或2）和—SH（163.5 eV）鍵。

圖2 CDs（A）和MnO2納米片（B）的XPS全譜圖譜Fig.2 XPS spectra of CDs（A）and MnO2 nanosheets（B）

MnO2納米片的XPS 如圖2B 所示，在282.0、397.1、527.9、640.1 eV 處的4 個峰，分別對應C1s、N1s、O1s和Mn2p。將MnO2的XPS總譜進一步分解得到Mn2p和Mn3s的精細譜圖。Mn2p在642.0 eV和653.9 eV 處有兩個峰，分別為Mn2p3/2和Mn2p1/2的特征峰。此外，Mn3s 光譜的ΔE約為4.97 eV，表明MnO2納米片主要以Mn（Ⅳ）價態(tài)存在［29］。這些結(jié)果表明MnO2納米片成功合成。通過紫外可見吸收光譜（圖3A 曲線a）進一步證實了MnO2納米片的光學特性，其在360 nm 處有1個峰，在250 ～600 nm 處有較寬的吸收帶；熒光圖譜（圖3A 曲線b、c）顯示，CDs 的激發(fā)和發(fā)射與MnO2納米片的吸收有很大的重疊區(qū)域。

圖3 CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜及MnO2納米片的紫外可見吸收光譜（A）與不同濃度的MnO2納米片對CDs熒光強度的影響（B）Fig.3 Fluorescence excitation and emission spectra of CDs，UV-Vis absorption spectra of MnO2 nanosheets（A），and effect of different concentrations of MnO2 nanosheets on the fluorescence intensity of CDs（B）

2.2 CDs的穩(wěn)定性

研究了CDs在不同pH值的PBS溶液、不同濃度的氯化鈉溶液和紫外照射條件下于360 nm激發(fā)光下的熒光強度，發(fā)現(xiàn)CDs的熒光強度受環(huán)境影響較小，只在酸性較強的環(huán)境中熒光值降低，證明CDs具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為獲得INH 的最佳測定條件，分別對pH 值、反應時間和MnO2納米片的濃度進行了優(yōu)化。考察了不同pH 值（4.0 ～11.0）對CDs/MnO2-INH 體系熒光強度的影響，以IF0為CDs 的熒光強度，IF1為加入MnO2納米片后的熒光強度，IF2為MnO2納米片和INH 共同存在時CDs的熒光強度。在pH 4.0 ～7.4范圍內(nèi)，隨著pH 值的增加，IF0/IF1與IF1/IF2的值均不斷增大，并在pH 7.4 時達到最大值；隨著pH 值繼續(xù)增大，兩比值均逐漸減小，即PBS緩沖液的pH值為7.4時INH的檢測靈敏度最高。

在加入MnO2納米片后CDs 的熒光強度迅速降低，1 min 后趨于穩(wěn)定。在CDs/MnO2納米片中加入20μmol/L的INH，熒光強度隨孵育時間的延長而增加，15 min后達到穩(wěn)定，故15 min為最佳反應時間。

為研究MnO2納米片濃度對CDs 熒光的影響，將一系列濃度的MnO2納米片與CDs 混合，并加入20μmol/L 的INH。結(jié)果顯示CDs 的熒光強度隨著MnO2納米片濃度的增加而逐漸減弱，當MnO2納米片的濃度為2 mmol/L時，猝滅效率達到99%左右（圖3B）。而MnO2納米片濃度為0.2 mmol/L時，INH對于CDs 熒光的恢復最靈敏，其濃度大于2 mmol/L 時不利于CDs 熒光的恢復。綜合考慮，確定MnO2納米片的最佳濃度為0.2 mmol/L。

2.4 方法檢出限

加入INH 后，CDs/MnO2檢測體系的熒光明顯恢復。而無MnO2納米片存在時，即使INH 濃度增至100 mmol/L，CDs 的熒光也不發(fā)生變化，表明INH 對CDs 的熒光沒有影響。向CDs/MnO2檢測體系中加入INH，溶液顏色由棕色變?yōu)闊o色，這是由于MnO2納米片與INH 發(fā)生氧化還原反應分解為Mn2+，令MnO2溶液的棕色消失，CDs的熒光恢復。

考察了最佳條件下，不同濃度的INH對CDs/MnO2熒光光譜的影響。結(jié)果表明，CDs/MnO2納米探針的熒光恢復效率與INH的濃度在0.5 ～60μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程為y＝0.062 6x+1.098 8，相關(guān)系數(shù)r2＝0.998，其中x表示異煙肼的濃度（μmol/L），y表示IF/IF0（IF0和IF分別為加入INH前后CDs/MnO2的熒光強度）。以3σ/K計算檢出限（LOD）（σ為空白樣本的標準方差，K為線性方程的斜率），得到LOD為0.02μmol/L。與大多數(shù)已報道的INH測定方法（表1）相比，本方法具有較低的檢出限。

表1 與其他檢測方法的對比Table 1 Comparison with other detection methods

2.5 CDs/MnO2對INH檢測的選擇性及抗干擾能力

考察了常見糖類、生物大分子和金屬離子對CDs/MnO2檢測INH 的影響，結(jié)果如圖4 所示。圖中IF0 與IF 分別代表加入INH 前后CDs/MnO2的熒光強度。從圖4A 可觀察到只有INH 能顯著恢復CDs/MnO2體系的熒光，其它常見糖類（Glu 和Fru）、生物大分子（Vc、Ace、UA、H2O2、Gly、His、Cys-NEM、GSH-NEM、OA、urea）和金屬離子（K+、Ca2+、Na+或Zn2+）不會使CDs/MnO2+INH 體系的熒光強度發(fā)生明顯恢復。探究了干擾物質(zhì)存在下，INH 對CDs/MnO2體系的熒光恢復情況，結(jié)果如圖4B 所示，當INH 濃度為50μmol/L，控制相對誤差在±5%以內(nèi)時，濃度為500μmol/L 的常見糖類、生物大分子和金屬離子對CDs/MnO2檢測INH無明顯干擾。上述實驗結(jié)果表明CDs/MnO2可特異性識別INH，常見糖類、生物大分子和金屬離子在0 ～500μmol/L范圍內(nèi)對INH測定的干擾性較小。

圖4 CDs/MnO2對INH的選擇性檢測（A）及常見糖類、生物大分子和金屬離子對CDs/MnO2檢測INH的干擾性（B）Fig.4 Selective detection of INH by CDs/MnO2（A），interference of common carbohydrates，biomacromolecules and metal ions on the detection of INH by CDs/MnO2（B）

2.6 實際樣品測定

選取人尿樣和血清樣品作為研究對象，考察探針在實際樣品中檢測INH 的適用性和可靠性。向空白尿樣和血清樣品中加入INH 標準溶液，制成不同濃度（4、20、50μmol/L）的加標樣品，進行加標回收實驗，每個濃度重復測定3次，得到空白血樣和尿樣中INH 的回收率分別為94.8%～116%、99.0%～105%，相對標準偏差（RSD）均不超過5%（表2）。此外，將該方法用于市售片劑中INH 的檢測，得到的INH 濃度與片劑的標示量非常接近，加標回收率為96.8%～102%，RSD 小于5%（表3），滿足《中華人民共和國藥典》（2020年版）［35］對同一片劑中INH含量的要求。

表2 血樣和尿樣中INH的檢測Table 2 Detection of INH in blood and urine samples

（續(xù)表2）

表3 片劑中INH的檢測Table 3 Detection of INH in tablets

2.7 機理研究

CDs 的熒光可被MnO2納米片猝滅，由于CDs 的熒光發(fā)射光譜與MnO2納米片的紫外吸收光譜重疊，初步推斷猝滅機理為FRET或者內(nèi)濾光效應（IFE）。FRET是一種通過分子間的電偶極相互作用將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體的非輻射能量躍遷過程［33］。供體在能量發(fā)生轉(zhuǎn)換后，熒光強度減弱，熒光壽命縮短；受體熒光被激發(fā)，熒光壽命增加；若受體無熒光特性，則表現(xiàn)為供體熒光被受體猝滅［34］。而IFE是指由于熒光體的激發(fā)光譜或者發(fā)射光譜與吸收體的吸收光譜重疊，導致熒光體發(fā)射強度降低的現(xiàn)象，但熒光體的熒光壽命不會發(fā)生變化［36］。MnO2納米片在200 ～800 nm范圍內(nèi)有寬的吸收，與CDs的發(fā)射光譜有很大的重疊，供體CDs的熒光被受體MnO2猝滅；供體CDs的熒光壽命為2.6 ns，加入受體MnO2后其熒光壽命縮短為1.7 ns（圖6）；而受體MnO2無熒光特性，表現(xiàn)為猝滅供體CDs的熒光。綜上所述，CDs與MnO2相互作用的機理主要為FRET。其中熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率（E）可以由公式E= 1 -τa τ0（τa，τ0分別代表受體存在和不存在時供體的熒光壽命）獲得［25］，經(jīng)計算E為34.62%。

圖5 反應機理示意圖Fig.5 Schematic diagram of the reaction mechanism

圖6 CDs和CDs/MnO2、CDs/MnO2+INH的時間分辨熒光衰減光譜Fig.6 Time-resolved fluorescence decay spectra of CDs and CDs/MnO2，CDs/MnO2+INH

3 結(jié) 論

MnO2納米片與CDs之間存在的FRET效應可將CDs的熒光猝滅，而INH可將MnO2納米片還原為Mn2+，從而使CDs的熒光恢復，基于此構(gòu)建了一種簡單快速地檢測INH的納米熒光探針。在優(yōu)化條件下，CDs/MnO2納米探針的熒光恢復效率與INH濃度在0.5 ～60μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，對INH的檢出限為0.02μmol/L。CDs/MnO2納米探針對INH有高選擇性，常見糖類、生物大分子和金屬離子對INH的檢測基本無干擾。該探針已成功應用于血樣、尿樣以及片劑中INH的測定，檢測結(jié)果準確可靠。CDs/MnO2納米探針靈敏度高、選擇性好、制備簡單、成本低廉且對環(huán)境友好，在臨床上能夠幫助肺結(jié)核病患者合理控制藥量，降低藥物副作用。作為一種極具應用前景的納米熒光探針，CDs/MnO2納米探針在生物醫(yī)學領(lǐng)域必將具有更廣泛的用途。