基于大黃酸碳點(diǎn)熒光探針檢測煙葉含水量的研究

沈劭怡，李 斌*，楊德志，楊亞玲

（1.云南省煙草煙葉公司 煙葉生產(chǎn)中心，云南 昆明 650214；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

含水量是煙草工藝技術(shù)的指標(biāo)之一，對(duì)提升煙葉質(zhì)量，煙葉后續(xù)醇化、預(yù)防霉變等均具有至關(guān)重要的作用［1］。在煙葉加工過程中，因?yàn)楣ば虻牟煌?，需反?fù)調(diào)節(jié)煙葉含水率［2］，含水量對(duì)煙葉初烤、復(fù)烤等過程尤為重要。準(zhǔn)確測定加工過程中煙葉的水分，對(duì)于煙草工藝具有重要意義［3］?，F(xiàn)有的含水量測定技術(shù)主要包括費(fèi)休氏法、重量分析法（包括常壓干燥法、減壓干燥法和熱重分析法）、熒光探針法、氣相色譜法和近紅外光譜法等［4-5］。目前，對(duì)于煙葉加工過程中含水量的測定，普遍使用重量分析法即通過減壓干燥法測定煙葉中的水分，并基于測定結(jié)果調(diào)節(jié)加工工藝［6］。然而，不同批次煙葉含水量存在較大差異，而現(xiàn)有方法存在檢測用時(shí)長、檢測過程繁瑣、難于現(xiàn)場使用等缺點(diǎn)，導(dǎo)致煙葉加工過程中含水量測定存在較大困難［7-8］。熒光探針法具有檢測靈敏、便攜、簡單、成本低等特點(diǎn)，在建立和開發(fā)新的含水量測定技術(shù)方面有一定優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)有的含水量測定技術(shù)中，已有少量使用熒光探針的報(bào)道，如Kim 等［9］利用水分破壞染料和陰離子之間的氫鍵，導(dǎo)致負(fù)電荷大量離域，使得溶液顏色劇烈變化，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)溶劑中微量水分的熒光測定；Geng等［10］通過制備具有熒光信號(hào)的碳點(diǎn)，利用碳點(diǎn)與水分子之間的相互作用測定酒類產(chǎn)品中的水。因此，用熒光探針技術(shù)測定煙葉加工工藝過程中的含水量存在可行性。

碳點(diǎn)（Carbon dots，CDs）是一類尺寸小于10 nm 的碳納米粒子，其表面缺陷使之具有發(fā)光特性［11］。根據(jù)合成原料和方法不同，可以在碳點(diǎn)表面修飾不同的官能團(tuán)［12］對(duì)其熒光等特性進(jìn)行調(diào)節(jié)。以碳點(diǎn)為熒光探針進(jìn)行含水量測定，具有材料易獲取、合成簡單、檢測快速等特點(diǎn)。

基于智能手機(jī)的比色法是近年來新興的一種快速檢測方法，因設(shè)備簡單、操作靈活而備受關(guān)注［13］。利用智能手機(jī)拍攝記錄與待測成分濃度相關(guān)的顏色，結(jié)合Adobe Photoshop、Image J 等軟件，將顏色深淺數(shù)值化，根據(jù)RGB 值、灰度等的不同，用標(biāo)準(zhǔn)的已知濃度的溶液進(jìn)行比色測定，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量分析［14-15］。該方法克服了目視比色法無法定量測定的缺點(diǎn)，且無需大型儀器，成本低，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測［16］。

本研究以大黃酸和硝酸鎂為原料，通過微波法制備了大黃酸碳點(diǎn)（R-CDs）?；谒肿訉?duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅作用，建立了水含量測定的新方法，其示意圖如圖1 所示。結(jié)合智能手機(jī)信號(hào)采集技術(shù)，利用RGB 值比色法，建立了可定量檢測煙葉加工過程中水含量的新方法。該方法具有很強(qiáng)的溫度耐受性，可實(shí)現(xiàn)煙葉中水含量的快速分析。

圖1 水含量測定示意圖Fig.1 Schematic diagram of moisture content determination

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent G9800A 分子熒光光譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；TU1901 型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；TOP wave 型微波消解儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；TENSOR27 型傅里葉紅外光譜分析儀（德國Bmker 公司）；D8 型X 射線衍射儀（德國Bruker 公司）；Thermo Scientific Nexsa 型X 射線光電子能譜儀（美國ThermoFisher Scientific 公司）；Tecnai G2 場發(fā)射透射電子顯微鏡（荷蘭FEI公司）。

復(fù)烤煙絲樣品（云南省煙草煙葉公司煙葉生產(chǎn)中心提供）；大黃酸（上海麥克林生化科技有限公司）；硝酸鎂、氫氧化鈉、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、無水氯化鈣、六水氯化鐵（FeCl3·6H2O）、六水氯化鎂（MgCl2·6H2O）、八水氫氧化鋇（Ba（OH）2·8H2O）、氯化鋅（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、四水氯化錳（MnCl2·4H2O）、氯化鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；六水氯化鎳（NiCl2·6H2O）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化高汞（利樣汞業(yè)化工有限公司）。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 大黃酸碳點(diǎn)（R-CDs）的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g 硝酸鎂，加入20 mL 1 mmol/L 的大黃酸（DMSO 溶解）溶液中。溶解后置于微波消解儀中，于180 ℃消解30 min。取出后，室溫自然冷卻，得到淡黃色溶液，于10 000 r/min 離心15 min 后用0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，即得大黃酸碳點(diǎn)，密封后于4 ℃保存。

1.3 水含量測定

取10μL 大黃酸碳點(diǎn)，用無水乙醇稀釋至3 mL，作為熒光強(qiáng)度測定的工作液。在檢測過程中，分別加入不同量的去離子水，并用無水乙醇定容至4 mL。渦旋混勻后，于525 nm激發(fā)光波長下，測定其在605 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度。設(shè)定I0為大黃酸碳點(diǎn)自身的熒光強(qiáng)度，I為加水后大黃酸碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。

1.4 煙葉加工過程水含量測定

先準(zhǔn)確稱取1.0 g煙絲樣品，置于密閉干燥的20 mL 錐形瓶中，10 mL 注射器輔助抽真空10次，于90 ℃下加熱10 min，將產(chǎn)生的氣體導(dǎo)入碳點(diǎn)溶液中。反應(yīng)結(jié)束后，補(bǔ)足揮發(fā)的乙醇，測定體系的熒光強(qiáng)度。

在相同條件下，取1.0 g 煙絲樣品置于烘至恒重的稱量皿中，于真空干燥箱加熱至80 ℃，抽真空（壓力為50～60 kPa），12 h后置于干燥器中冷卻0.5 h，最后稱至恒重。通過比較水含量與探針?biāo)鶞y值的一致性考察方法的準(zhǔn)確性。

1.5 RGB信號(hào)采集

RGB信號(hào)采集在如圖1所示的避光盒子中進(jìn)行，使用的智能手機(jī)為Xiaomi Civi（詳細(xì)參數(shù)：6 400萬像素主攝（f/1.79 光圈）+ 800 萬像素超廣角鏡頭（120°，f/2.22 光圈）+ 200 萬像素微距鏡頭（f/2.4 光圈））。將“1.4”部分處理的樣品置于避光盒子中，于365 nm 紫外燈照射下，保持手機(jī)的拍攝角度、拍攝參數(shù)一致，采用原相機(jī)模式、自動(dòng)對(duì)焦、關(guān)閉閃光燈3 種方式對(duì)比色皿中的樣品進(jìn)行圖像采集。采集圖像信號(hào)后，利用Adobe photoshop CC 2019軟件處理圖片，并利用軟件工具隨機(jī)讀取圖像中3個(gè)點(diǎn)的RGB值，取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 大黃酸碳點(diǎn)的表征

圖2A 為大黃酸碳點(diǎn)的X 射線光電子能譜圖（XPS），在166.7、284.6、399.6、532.4、1 303.8 eV處分別出現(xiàn)了S2p、C1s、N1s、O1s 和Mg1s 的特征峰，表明材料中存在S、C、N、O 和Mg 元素。其中元素相對(duì)含量依次為C ＞O ＞S ＞Mg ＞N（圖2A插圖），與大黃酸碳點(diǎn)制備原料中元素含量基本一致。

圖2B為大黃酸碳點(diǎn)的紅外譜圖（FTIR），在3 450、3 220 cm-1處的特征峰分別歸屬于O—H、N—H的伸縮振動(dòng)，其中N—H峰非常弱，表明N元素含量較低，該結(jié)果與XPS結(jié)果相一致［17］；1 625、1 134 cm-1處的特征峰分別對(duì)應(yīng)于C===== O/C===== C、C—O 的伸縮振動(dòng)［18］；1 375 cm-1處的峰屬于C—S的拉伸振動(dòng)，該結(jié)果進(jìn)一步證明所制備的大黃酸碳點(diǎn)中存在S元素。

圖2C 為大黃酸碳點(diǎn)的X 射線衍射譜圖（XRD），27°處出現(xiàn)了明顯的衍射峰，與石墨的（002）晶面相對(duì)應(yīng)，說明碳點(diǎn)中包含類石墨烯結(jié)構(gòu)［19］。圖2D 為該碳點(diǎn)的透射電鏡圖（TEM），可以看出其粒徑約2～4 nm，分散性較好。

圖2 大黃酸碳點(diǎn)的XPS譜圖（A）、FTIR譜圖（B）、XRD譜圖（C）和TEM圖（D）Fig.2 XPS full spectrum（A），F(xiàn)TIR spectrum（B），XRD spectrum（C）and TEM image（D）of R-CDs

2.2 大黃酸碳點(diǎn)的光學(xué)性能

圖3A 為大黃酸碳點(diǎn)的UV-Vis 和熒光光譜?？梢钥闯?，大黃酸碳點(diǎn)的熒光最大激發(fā)波長位于525 nm，最大發(fā)射波長位于605 nm。大黃酸碳點(diǎn)溶液在自然光下呈淡黃色，在365 nm 的紫外光照射下，則呈現(xiàn)明顯的亮黃色熒光（圖3A 插圖）。在碳點(diǎn)的UV-Vis 譜圖中，430 nm 處的特征峰歸屬于醌羰基的吸收譜帶，大黃酸228 nm 和258 nm 位置處的特征峰消失［20］，表明碳點(diǎn)表面帶有羰基基團(tuán)。圖3B 為大黃酸碳點(diǎn)在不同溶劑中的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，使用去離子水稀釋時(shí)碳點(diǎn)的熒光完全猝滅；而以乙醇作為溶劑時(shí)溶液為黃色。以DMF 和DMSO 作為溶劑時(shí)，在紫外燈下溶液顏色從淡黃色變?yōu)榉奂t色。以上結(jié)果表明，隨著有機(jī)溶劑極性的增加，碳點(diǎn)605 nm 處發(fā)射峰的強(qiáng)度顯著提升，碳點(diǎn)的最大發(fā)射波長出現(xiàn)紅移?？紤]到DMF 和DMSO 的毒性及其對(duì)發(fā)射峰的影響，后續(xù)研究中選擇乙醇作為有機(jī)溶劑。

圖3 大黃酸碳點(diǎn)的UV-Vis吸收光譜和熒光光譜（A）及其在不同溶劑中的熒光強(qiáng)度（B）Fig.3 Fluorescence and UV-Vis absorption spectra of R-CDs（A）and fluorescent intensity of R-CDs in different solvents（B）inset A：photograph of R-CDs solution without（left）or with（right）365 nm UV irradiation；inset B：photograph of R-CDs in water，ethanol，DMF and DMSO（from left to right）

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、溶液pH值和不同金屬離子對(duì)水含量測定的影響。結(jié)果表明，整個(gè)反應(yīng)可在10 s內(nèi)完成。乙醇在65 ℃溫度范圍內(nèi)存在一定的揮發(fā)，但在補(bǔ)充乙醇溶液之后，體系熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化，因此在65 ℃范圍內(nèi)，無需進(jìn)一步考慮溫度的影響。大黃酸碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度易受溶液pH 值的影響，僅在pH 值為中性時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)（圖4A），因此后續(xù)研究選擇中性條件。此外，F(xiàn)e3+、Cu2+、Co2+、Ni2+和Hg2+對(duì)大黃酸碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度有顯著猝滅作用，Ba2+對(duì)碳點(diǎn)熒光有顯著增敏作用（圖4B）；說明金屬離子對(duì)該熒光碳點(diǎn)的干擾較強(qiáng)。考慮到煙草加工過程中，水含量的測定過程較為簡單，幾乎不存在金屬離子干擾，故該碳點(diǎn)依然可用于煙草加工過程中水含量的測定。

圖4 溶液pH值（A）和不同金屬離子（B）對(duì)大黃酸碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 The effects of solution pH value（A）and different metal ions（B）on the fluorescence intensity of R-CDs

2.4 熒光猝滅機(jī)制研究

考察了水的加入順序?qū)w系熒光的影響，發(fā)現(xiàn)先加入乙醇再加入水，體系熒光的猝滅程度更明顯（圖5A），因此在實(shí)驗(yàn)中先以乙醇稀釋碳點(diǎn)溶液，再測定水分含量。體系的紫外吸收光譜（圖5B）顯示，隨著水含量的增加，430 nm 處醌羥基的特征峰強(qiáng)度逐漸增加，540 nm 處配合物的特征峰逐漸降低。這是由于碳點(diǎn)制備過程中，大黃酸分子結(jié)構(gòu)中的羰基、羥基等會(huì)與Mg2+形成配合物，從而在540 nm 位置處出現(xiàn)配合物的特征峰，而作為質(zhì)子性溶劑的水加入后，可有效促進(jìn)Mg2+從羰基或羥基上解離下來，從而導(dǎo)致羥基峰強(qiáng)度逐漸增加，配合物特征峰強(qiáng)度逐漸降低；同時(shí)，Mg2+的解離還會(huì)導(dǎo)致碳點(diǎn)的聚集，降低電子離域程度，使體系熒光強(qiáng)度降低［21］。

圖5 水加入順序?qū)μ键c(diǎn)熒光的影響（A）及不同水含量對(duì)碳點(diǎn)最大紫外吸收的影響（B）Fig.5 The effect of water addition order on the fluorescence of R-CDs（A）and the effect of different water contents on the maximum UV absorption of R-CDs（B）

另一方面，碳點(diǎn)的最大發(fā)射波長隨有機(jī)溶劑極性的增加存在明顯的紅移現(xiàn)象（圖3B），說明所制備的碳點(diǎn)具有溶劑依賴性，而水作為極性溶劑也會(huì)導(dǎo)致發(fā)射波光紅移［22］。Senthamizhan 等［23］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以DMSO（非質(zhì)子傳遞溶劑）作為溶劑時(shí)，加入質(zhì)子傳遞溶劑（即水）會(huì)促使非輻射弛豫途徑，如與周圍分子的振動(dòng)耦合、分子內(nèi)旋等增強(qiáng)，造成碳點(diǎn)聚集，熒光強(qiáng)度降低。這與本實(shí)驗(yàn)中以DMSO 作為溶劑，利用大黃酸碳點(diǎn)熒光測定水的結(jié)論相一致。

2.5 線性關(guān)系及檢出限

在水含量為30～1 000 mg 時(shí)，碳點(diǎn)熒光的猝滅程度與水加入量之間呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-0.274x+393.858 7（r2=0.994 1），其中x和y分別為水加入量和大黃酸碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。根據(jù)3δ/S（δ為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為線性校準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算得到檢出限為5 mg。

2.6 水含量的RGB比色法測定

將拍攝的不同水含量下大黃酸碳點(diǎn)的熒光照片使用軟件Adobe photoshop CC 2019 進(jìn)行處理，截去無關(guān)背景，獲取RGB 值。每張圖隨機(jī)取3個(gè)點(diǎn)，并取其平均值作為最后的RGB 值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。分別讀取R值、G值和B值，并以水含量為橫坐標(biāo)x，R值、G值或B值分別為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，篩選最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，以R 值作為縱坐標(biāo)時(shí)，所擬合的方程最優(yōu)：y=-0.115 38x+215.426 88（r2=0.990 2）。

2.7 實(shí)際應(yīng)用

研究分別采用上述熒光和RGB 比色方法，測定加工過程中相同批次煙葉的水含量，并與減壓干燥法相對(duì)比，測定結(jié)果如表1 所示。熒光和RGB 比色方法與減壓干燥法測定值之間的相對(duì)誤差均小于4.0%，說明本方法的測定結(jié)果與減壓干燥法基本一致。而與減壓干燥法相比，RGB 比色法操作時(shí)間更短，且可實(shí)現(xiàn)樣品中水分的現(xiàn)場測定，無需大型儀器設(shè)備，成本低。

表1 實(shí)際樣品測定結(jié)果（n=3）Table 1 Results of the actual samples（n=3）

3 結(jié) 論

本研究利用水對(duì)大黃酸碳點(diǎn)的熒光猝滅作用，結(jié)合智能手機(jī)RGB 信號(hào)采集技術(shù)，建立了一種可用于煙葉加工過程中水含量測定的新技術(shù)。在最優(yōu)條件下，H2O 檢測的線性范圍為30～1 000 mg，檢出限為5 mg。結(jié)合智能手機(jī)采集樣品的圖像信號(hào)，并根據(jù)R 值比色方法建立的水含量檢測技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)煙葉中水含量的現(xiàn)場快速測定，無需使用大型設(shè)備，成本低。本研究為水含量檢測提供了新的策略，同時(shí)也為水含量測定試紙的設(shè)計(jì)打開了新的研究思路。