柱切換液相色譜法快速定量檢測(cè)參附注射液中烏頭堿類生物堿和人參皂苷

張艷海，李 玲，張大偉，魯 銳

（1.安捷倫科技（中國）有限公司，上海 200080；2.黑龍江農(nóng)墾總局總醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150088）

參附注射液（Shenfu injection，SFI）由紅參、附子（黑順片）經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制備而成，具有益氣溫陽、蠲化寒飲、振奮心陽、益氣固脫等多重功效，主要用于陽氣暴脫引起的厥脫癥，以及陽虛（氣虛）所致的驚悸、喘咳、胃疼、泄瀉、痹癥等［1-2］。近年來，SFI被廣泛用于治療心力衰竭、休克、心律失常、膿毒癥等［3-7］復(fù)雜疾病，療效顯著。SFI 也被推薦用于新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）危重癥患者的救治，在國家、各省市出臺(tái)的23種中醫(yī)藥防治COVID-19的治療方案中有重要地位［8-9］。研究表明，人參皂苷和烏頭類生物堿作為SFI 的兩類有效活性成分，其抗炎作用在治療心腦血管疾病方面有重要意義［1，10］。附子中的烏頭類生物堿（包括雙酯型生物堿及其水解產(chǎn)物單酯型生物堿）既是有效成分又是毒性成分，其中雙酯型生物堿的毒性約是單酯型生物堿的100 ～200倍。附子經(jīng)炮制后，雙酯型和單酯型生物堿的含量顯著降低［11-12］，而參附注射液在制備過程中單酯型生物堿的含量進(jìn)一步降低［13］。因此準(zhǔn)確測(cè)定兩類生物堿的含量，不僅能保證藥物安全性和有效性，也是保證炮制工藝和生產(chǎn)工藝的重要方面。

參附注射液中人參皂苷和烏頭堿類生物堿的分析方法主要包括液相色譜法［13-16］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［17］。其中烏頭堿類生物堿成分由于含量較低，且樣品基質(zhì)復(fù)雜，測(cè)定時(shí)常采用C18離線固相萃?。?3］或在線固相萃?。╫nline SPE）進(jìn)行富集和凈化［16-17］。但基于C18的SPE柱僅能去除樣品基質(zhì)中極性較大的水溶性成分干擾，無法去除其他極性相近的中性干擾成分，凈化效果有限。此外，采用液相色譜的人參皂苷定量方法僅涵蓋人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc 和Rd 等原人參二醇型（Protopanaxadiol）和原人參三醇型（Protopanaxatriol）［14-15］物質(zhì)。而齊墩果烷型人參皂苷如人參皂苷Ro 具有抗炎、抗氧化等作用，含量?jī)H次于Rb1，且Ro/Re含量比值可作為紅參年限的重要參考指標(biāo)［18］。LCMS法能同時(shí)對(duì)13種人參皂苷和10種烏頭堿類生物堿進(jìn)行定量［17］，但其檢測(cè)成本較高，不適合在實(shí)際質(zhì)控等實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。本文采用柱切換液相色譜技術(shù)，選擇強(qiáng)陽離子交換（SCX）柱作為online SPE柱，建立了6 個(gè)烏頭堿類生物堿的在線固相萃取/液相色譜-紫外檢測(cè)（online SPE/LC-UV）快速分析方法；并優(yōu)化了人參皂苷含量的測(cè)定方法，同時(shí)完成了包括人參皂苷Ro在內(nèi)的9種人參皂苷的定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫科技公司），包括：四元泵（G711B）、二元泵（G7112B）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G7129A）、柱溫箱（G7116A）（內(nèi)置一個(gè)2位6通閥）、閥切換單元（G1170A，含一個(gè)2 位6 通閥）、二極管陣列檢測(cè)器（G7117A）× 2，軟件采用Agilent OpenLab CDS 2.5。Zorbax SB-C18（4.6 mm × 150 mm × 3.5 μm）、Poroshell EC-C18（4.6 mm × 100 mm × 2.7 μm）及其保護(hù)柱（4.6 mm×5 mm×2.7μm）、Zorbax SCX（4.6 mm×12.5 mm×5μm）（美國安捷倫科技公司）。

乙腈、甲醇（色譜級(jí)，Avantor J.T.Baker 公司）；去離子水（18.2 MΩ·cm-1，Millipore 純水機(jī)）；磷酸（HPLC 級(jí)，濃度85%，Dikma 公司）；醋酸銨（LC-MS級(jí)，5 mol/L，Sigma-Aldrich 公司）；甲酸、乙酸（LC-MS級(jí)），異丙醇、二氯甲烷（HPLC級(jí)）（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

人參皂苷Rg1（供含量測(cè)定用，純度按96.3%計(jì)），Re（供含量測(cè)定用，純度按92.7%計(jì)），Rf（供含量測(cè)定用，純度≥98%）、Rb1（供含量測(cè)定用，純度按92.9%計(jì)）、Rb2（供含量測(cè)定用，純度按93.8%計(jì)）、Rd（供含量測(cè)定用，純度按94.4%計(jì)）、Rb3（供含量測(cè)定用，純度按92.7%計(jì)）（中國藥品生物制品檢定所）；Rc（純度＞98%，化學(xué)對(duì)照品）、人參皂苷Ro（純度＞98%）（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、苯甲酰烏頭原堿（BAC）、苯甲酰次烏頭原堿（BHA）、新烏頭堿（MA）、次烏頭堿（HA）和烏頭堿（AC）（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；紅參粉（吉林撫松，5 年）；參附注射液（華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：200704AK07、201203AK03、210303AK05）。

1.2 對(duì)照品溶液配制

取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷（體積比1∶1）混合溶液制成每1 mL 各含0.1 mg對(duì)照品的儲(chǔ)備溶液。再分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入體積分?jǐn)?shù)50%的異丙醇-水（含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸）溶劑稀釋，配制成質(zhì)量濃度10μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Ro 對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Ro質(zhì)量濃度分別為2.60、2.58、2.20、2.74、2.60、2.40、2.60、2.66、2.35 mg/mL 的儲(chǔ)備溶液。再精密稱取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別加甲醇稀釋，制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品溶液制備方法

取參附注射液樣品適量，加水按照體積比4∶6（樣品∶水）稀釋，搖勻后，上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

烏頭堿類生物堿的分析條件：SPE 泵的流動(dòng)相A 為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸，B 為乙腈，C 為100 mmol/L醋酸銨；SPE柱為Zorbax SCX（4.6 mm×12.5 mm×5μm），流速為1.0 mL/min；分析泵的流動(dòng)相A 為100 mmol/L 醋酸銨，流動(dòng)相B 為乙腈，分析柱為Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm×3.5μm）。梯度洗脫程序見表1。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為200μL，柱溫為35 ℃，紫外檢測(cè)波長為235 nm。Online SPE 的系統(tǒng)連接見圖1，閥1（V1）的切換過程：0 ～16 min，1-6；16 ～17.8 min，1-2；17.8 ～56.5 min，1-6。閥2（V2）保持在1-6。

表1 SPE泵和分析泵的梯度洗脫程序（烏頭堿類生物堿檢測(cè)）Table 1 Gradient program of SPE and analytical pumps（aconitine-type alkaloids assay）

圖1 在線固相萃取和柱切換系統(tǒng)連接示意圖Fig.1 Flow scheme of online SPE and column switching system A. aconitine-type of alkaloids（烏頭堿類生物堿）；B. ginsenosides（人參皂苷）

進(jìn)行人參皂苷分析時(shí)，流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸，流動(dòng)相B為乙腈，采用Poroshell EC-C18（4.6 mm × 100 mm × 2.7 μm）作為分析柱。流速為1.0 mL/min，梯度洗脫過程為：0 ～5 min，10% B；5 ～6 min，10% ～19% B；6 ～10 min，19% B；10 ～24 min，19% ～24% B；24 ～45 min，24% ～36% B；45 ～48 min，36% ～95% B；48 ～50 min，95% B。柱溫25 ℃，檢測(cè)波長203 nm，進(jìn)樣量5 μL。以Poroshell EC-C18（4.6 mm × 5 mm × 2.7 μm）作為保護(hù)柱；閥2（V2）切換過程：進(jìn)樣后，0 ～5 min，1-2；5 ～50 min，1-6。閥1（V1）位置保持在1-2。

2 結(jié)果與討論

2.1 Online SPE方法的建立

樣品制備是復(fù)雜樣品分析過程的重要組成部分，也是最為耗時(shí)、費(fèi)力的過程，已成為制約快速分析的主要瓶頸，而在線聯(lián)用樣品制備策略是發(fā)展快速分析方法的重要方向，其中基于柱切換液相色譜的在線online SPE技術(shù)是被廣泛應(yīng)用的一種在線樣品制備技術(shù)［19-20］。SPE柱是方法構(gòu)建的關(guān)鍵，主要基于目標(biāo)待測(cè)物性質(zhì)及其與SPE 的吸附相互作用進(jìn)行選擇，同時(shí)也要考慮樣品基質(zhì)的組成情況［21］。實(shí)驗(yàn)根據(jù)附子中烏頭堿類生物堿的理化性質(zhì)，選擇強(qiáng)陽離子交換（SCX）小柱作為online SPE柱，以選擇性富集生物堿。除附子生物堿外，基質(zhì)中還含有人參皂苷、有機(jī)酸、核苷、多糖等其他內(nèi)源基質(zhì)成分［10］，以及吐溫80等輔料。為降低上述物質(zhì)的干擾，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了SPE 洗脫除雜過程，分別采用高水相（乙腈∶0.1%磷酸= 5∶95，體積比）的“弱洗脫”和高有機(jī)相（乙腈∶0.1%磷酸= 95∶5，體積比）的“強(qiáng)洗脫”兩步凈化除雜過程，最大程度地去除非生物堿類成分的干擾。由圖2 可知，基于硅膠載體的Zorbax SCX小柱能夠有效保留目標(biāo)待測(cè)物，同時(shí)達(dá)到了較好的凈化效果。

圖2 紅參陰性對(duì)照溶液（A）、參附注射液（B）和烏頭堿類生物堿混合對(duì)照品（C）的色譜圖Fig.2 The chromatograms of red ginseng negative control solution（A），Shenfu injection（B）and mixed standards of aconitine-type alkaloids（C）1.benzoylmesaconine（苯甲酰新烏頭原堿），2.benzoylaconine（苯甲酰烏頭原堿），3.benzoylhypaconine（苯甲酰次烏頭原堿），4.mesaconine（新烏頭堿），5.aconine（烏頭堿），6.hypaconine（次烏頭堿）

目標(biāo)物洗脫時(shí)，采用分析泵的流動(dòng)相反向沖洗SPE 柱，并結(jié)合100 mmol/L 醋酸銨-乙腈（體積比80∶20）混合溶劑，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的快速轉(zhuǎn)移?？疾炝藶躅^堿類生物堿6 個(gè)對(duì)照品混合溶液的洗脫效果和洗脫時(shí)間，結(jié)果顯示，在16 ～17.5 min，SPE 上吸附的目標(biāo)物可被完全洗脫，因此確定轉(zhuǎn)移時(shí)間即閥1（V1）的切換時(shí)間為1.5 min。在優(yōu)化梯度條件下，6 個(gè)目標(biāo)待測(cè)生物堿分離良好（圖2C），且烏頭堿和次烏頭堿的分離度大于1.5。

2.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 按照確定的色譜條件，分別進(jìn)樣混合對(duì)照品、參附注射液樣品和紅參陰性對(duì)照溶液，其中混合對(duì)照品中苯甲酰新烏頭原堿等6種烏頭堿類生物堿的分離色譜圖如圖2C 所示。結(jié)果顯示，各目標(biāo)待測(cè)物分離良好。參附注射液樣品中未檢測(cè)到新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿3 種雙酯型生物堿，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3 種單酯型生物堿無其他基質(zhì)成分干擾，其UV 吸收光譜與對(duì)照品一致，色譜峰的純度因子［22］分別為999、998 和998，表明目標(biāo)峰純度較好，基質(zhì)干擾少。以上結(jié)果說明本方法專屬性較好，可對(duì)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

按照“1.4”中人參皂苷的分析條件，分別進(jìn)樣混合對(duì)照品和參附注射液樣品溶液，由圖3 可知，9種目標(biāo)人參皂苷分離良好，各目標(biāo)峰的峰純度因子均大于980，表明各峰純度較好，其他基質(zhì)成分干擾較少，方法專屬性良好。

圖3 人參皂苷混合對(duì)照品（A）和參附注射液樣品（B）的分離色譜圖Fig.3 The chromatograms of mixed standards of nine ginsenosides（A）and Shenfu injection（B）1-9：ginsenoside Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Ro，Rb2，Rb3，Rd

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取1.0μg/mL 的生物堿混合對(duì)照品溶液，按“1.4”烏頭堿類生物堿的分析方法連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，苯甲酰新烏頭原堿等6種目標(biāo)待測(cè)物保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）均小于0.10%；峰面積的RSD 小于0.70%。同時(shí)取100 μg/mL 的人參皂苷混合對(duì)照品溶液，按照“1.4”人參皂苷的分析方法連續(xù)進(jìn)樣5 次。結(jié)果顯示9 種人參皂苷保留時(shí)間的RSD 均小于0.08%；峰面積的RSD均小于2.0%。表明方法的精密度較好。

2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

取10μg/mL的苯甲酰新烏頭原堿等6個(gè)混合對(duì)照品溶液，以50%異丙醇（含0.1%甲酸）逐級(jí)稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為2.0、1.0、0.2、0.1、0.05、0.02μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按照烏頭堿類生物堿的分析條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積200μL。以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），考察各目標(biāo)待測(cè)物的線性關(guān)系。另取人參皂苷各標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液適量至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成100μg/mL的混合對(duì)照品溶液，再取混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋制成質(zhì)量濃度分別為40、20、8、4、1.6μg/mL的系列溶液，分別取混合對(duì)照品溶液和系列稀釋后溶液，按照人參皂苷的分析方法進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積5μL，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），考察各目標(biāo)待測(cè)物的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，苯甲酰新烏頭原堿等6個(gè)烏頭堿類生物堿及9種人參皂苷的線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999，按照信噪比（S/N）為3∶1計(jì)算檢出限（LOD），得到BMA、BAC、BHA、MA、HA和AC的LOD分別為4.8、5.9、8.2、4.7、4.0、4.0 ng/mL；按照S/N=10∶1計(jì)算定量下限（LOQ），得到BMA、BAC、BHA、MA、HA和AC的LOQ分別為15.9、19.6、27.2、15.8、13.3、13.3 ng/mL。結(jié)果見表2。本文采用大體積進(jìn)樣結(jié)合高靈敏度UV檢測(cè)器，得到的目標(biāo)待測(cè)生物堿的檢出限顯著低于其他UHPLC-UV分析方法［13］。

表2 線性關(guān)系、定量下限和檢出限結(jié)果Table 2 Results of linearity relationship，LOQs and LODs

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取參附注射液樣品5 份，按照樣品溶液制備方法制備上機(jī)溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果參附注射液中BMA、BAC和BHA含量的RSD分別為1.3%、1.2%和0.59%，MA、AC和HA 3種雙酯型生物堿未檢出；9種人參皂苷含量的RSD在0.21%～1.6%之間。表明方法重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.6”部分中等加標(biāo)水平的參附注射液樣品溶液，分別在0、2、4、12、16、18 h 按照“1.4”烏頭堿類生物堿的色譜條件進(jìn)樣分析，考察6 種待測(cè)物的穩(wěn)定性，結(jié)果BMA、BAC、BHA、MA、AC和HA 峰面積的RSD 分別為1.7%、0.47%、0.62%、0.29%、0.67%和0.53%，表明目標(biāo)待測(cè)生物堿在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；另取參附注射液樣品溶液，按照“1.4”中確定的人參皂苷分析條件，分別在0、2、4、6、12 h進(jìn)樣分析，結(jié)果各人參皂苷測(cè)得量的RSD均小于2.0%，表明待測(cè)的9種人參皂苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取參附注射液樣品12份，每份4 mL，置10 mL量瓶中，分別加入10μg/mL的BMA 等6種烏頭堿類生物堿混合對(duì)照品溶液0.5、1.0 和1.5 mL，加水定容到刻度，搖勻；另取BMA 等混合對(duì)照品溶液相應(yīng)體積置10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為隨行參照溶液。再取參附注射液樣品12 份，每份2 mL，置10 mL 量瓶中，分別加入100μg/mL 的9 種人參皂苷混合對(duì)照品溶液1.0、2.0 和3.0 mL，加水定容到刻度，搖勻；另取人參皂苷的混合對(duì)照品溶液相應(yīng)體積置10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為人參皂苷的隨行參照溶液。分別按照“1.4”烏頭堿類生物堿和人參皂苷的分析條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。由表3 結(jié)果可知，6 種烏頭堿類生物堿的平均回收率為95.1% ～98.6%，9 種人參皂苷的平均回收率為91.7%～104%。結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度良好，完全滿足測(cè)定要求。

表3 15個(gè)目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率（n=2）Table 3 The average spiked recoveries for fifteen target analytes（n=2）

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

取3 批參附注射液，按照“1.3”樣品溶液制備方法和“1.4”的色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定目標(biāo)待測(cè)物的含量。結(jié)果見表4。樣品中未檢測(cè)到烏頭堿等3種雙酯型生物堿，其他3種單酯型生物堿的總量為2.72 ～4.03μg/mL。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）Table 4 Content results of samples（n=2） （μg/mL）

在人參皂苷測(cè)定中，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，當(dāng)采用“1.4”人參皂苷的色譜條件直接進(jìn)樣分析時(shí)，在UV 203 nm檢測(cè)波長下，前5 min內(nèi)色譜圖中包含大量吸收較高的弱保留基質(zhì)成分（圖4A），同時(shí)多次累加進(jìn)樣還會(huì)造成色譜柱和檢測(cè)器的污染。而利用柱切換的方式能夠有效去除0 ～5 min 內(nèi)的極性差異較大的基質(zhì)成分，避免對(duì)分析柱和后端檢測(cè)器的污染，改善方法的整體耐用性（圖4B）。

圖4 直接進(jìn)樣方式（A）和柱切換方式（B）下參附注射液的分析譜圖Fig.4 Chromatograms of SFI by direct injection（A）and column switching（B）peak 1-9：ginsenoside Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Ro，Rb2，Rb3，Rd

3 結(jié) 論

本文建立了在線固相萃取/液相色譜分析方法對(duì)參附注射液中源于附子的烏頭堿類生物堿進(jìn)行測(cè)定。采用基于強(qiáng)陽離子交換的SPE 柱選擇性富集生物堿類成分，結(jié)合優(yōu)化的SPE 洗脫過程，有效去除了非生物堿類基質(zhì)成分的干擾，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速分析。方法學(xué)考察結(jié)果表明本法準(zhǔn)確、可靠，可用于實(shí)際樣品中BMA、BAC、BHA3 個(gè)單酯型生物堿的定量，同時(shí)兼顧了AC、MA 和HA3 個(gè)毒性較強(qiáng)的雙酯型生物堿的限量檢測(cè)。另外本文還建立了Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 9 種人參皂苷含量的測(cè)定方法，兼顧了紅參中含量較高的齊墩果烷型人參皂苷Ro 的定量，縮短了整體分析時(shí)間；同時(shí)，采用柱切換的方式能夠去除樣品中極性較大、保留較弱的基質(zhì)成分，有效保護(hù)色譜柱和檢測(cè)器。由于本方法較常規(guī)分析方法復(fù)雜，且online SPE 柱的批間穩(wěn)定性可能會(huì)影響方法整體的耐用性，因此后續(xù)工作將針對(duì)方法耐用性進(jìn)行系統(tǒng)、深入的考察，以促進(jìn)本法在實(shí)際樣品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。