外周血液腫瘤細胞檢測在乳腺癌患者中的臨床價值分析

袁永梅

（黔南州人民醫(yī)院 貴州 黔南 558000）

乳腺癌為臨床婦科常見惡性腫瘤，發(fā)生率位居婦科惡性腫瘤首位，對患者身心健康、生命安全均存在較為嚴重的威脅。目前，臨床尚未明確乳腺癌的發(fā)病原因，且疾病發(fā)生率在近年來呈現(xiàn)年輕化、不斷攀升的趨勢。腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移指的是循環(huán)腫瘤細胞進入外周血液循環(huán)中，經(jīng)血液循環(huán)進入器官、組織后形成轉(zhuǎn)移病灶。影像學檢查為診斷乳腺癌的重要方式，但是僅能夠檢出直徑＞1 cm 的腫瘤；若腫瘤＜0.1 cm，則需要選擇特異性高、靈敏度高的診斷方式。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）檢測為近年來新興的腫瘤診斷技術，相較于傳統(tǒng)組織學樣本檢測，該檢測方法具有可反復取樣、取材方便、檢測簡單、非侵入性等優(yōu)點，有利于臨床早期診斷疾病并判斷預后，還可預測潛在轉(zhuǎn)移復發(fā)風險。本研究旨在分析外周血液腫瘤細胞檢測乳腺癌的意義，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年8 月—2021 年8 月黔南州人民醫(yī)院復查的51 例乳腺癌患者、51 例乳腺良性疾病患者、51 例健康體檢者。51 例乳腺癌患者中，年齡27 ～64 歲，平均年齡（45.57±3.28）歲；51 例乳腺疾病患者中，年齡29 ～62 歲，平均年齡（45.54±3.54）歲；51 例健康體檢者中，年齡28 ～63 歲，平均年齡（45.53±3.42）歲。三組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）CTCs 檢測：以專用CeHsave 管采集全部研究對象肘正中靜脈血，采集量為7.5 mL，應用美國強生Veridex 公司的CellTracks Auto Prep 系統(tǒng)對于標本進行預處理，調(diào)節(jié)相關參數(shù)后儀器可自動完成固定、染色、清洗等操作。將處理后的樣品自動轉(zhuǎn)入Mag Nest裝置中進行孵育，孵育過程中需要避光。孵育完成后將樣品移入Cell Tracks Auto Prep 系統(tǒng)中實施熒光掃描，系統(tǒng)可根據(jù)CTCs 免疫熒光染色規(guī)定標準判讀結果。（2）CTCs 陽性標準：①形態(tài)學標準。光鏡下細胞核較為完整，呈現(xiàn)為橢圓形、圓形、長形，細胞最長直徑＞10 um；②熒光顯微鏡判讀標準。細胞核對應CEF8 信號點在2 個以上，不存在血源性白細胞表面抗原紅圈著色有1 個陽性細胞。CTCs ≥1 即可被判定為陽性。（3）血漿游離DNA（Cell-free DNA, cfDNA）定量檢測：以專用CeHsave 管采集全部研究對象肘正中靜脈血，采集量為7.5 mL，基于實驗室前期建立ALu 序列RTFO 實時熒光定量（realtime fluorescence quantitative, PCR）檢測的cfDNA 檢測方法實施測定，具體檢測步驟如下分析：針對Alu115、247 序列上下游引物，（5’-3’）Alu115 reverse：GAG GCT GGA GCC TGT AAT C；Alu247 forward：GTGGCT CAC GCC TGT AAT；forward：CCT GAG GTCAGG AGT TCG AG；reverse：CCT GAG GTCAGG AGT TCG AG。嚴格按照說明書將引物配置為10 μmol/mL 的溶液，置于-20 ℃環(huán)境中保存。在樣品中加入100 mg/mL的2 μL RNaseA，上下游引物各為0.5 μL，均勻封膜后在室溫下放置2.5 min，以12 000 rmp 離心處理2 min。采取PCR 技術擴增兩端帶有接頭的DNA 片段，條件為64 ℃（1 min）、95 ℃（15 s）、95 ℃（10 min），共進行35 個循環(huán)。將制備好的文庫和雜交試劑、封閉試劑、SureSelect 獲取探針進行混合反應，取連續(xù)檢測的3 次數(shù)據(jù)平均值進行分析，評價檢測結果。

1.3 觀察指標

（1）比較全部研究對象的CTCs、cfDNA 檢測水平。（2）分析乳腺癌患者CTCs、cfDNA 與臨床和病理學特征間的關系，主要臨床特征為年齡、腫塊大小、病理類型、分級、淋巴結轉(zhuǎn)移、分析分型、遠端轉(zhuǎn)移、ER、HER-2、PR、Ki-67。人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor 2, HER-2）、雌激素受體（estrogen receptor,ER）、人類細胞核抗原（Ki-67）。

1.4 統(tǒng)計學方法

2.結果

2.1 CTCs、cfDNA 檢測水平分析

乳腺癌患者CTCs、cfDNA 水平均明顯高于乳腺良性疾病和健康體檢者，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），見表1。

表1 CTCs、cfDNA 檢測水平分析量表（ ± s）

2.2 乳腺癌患者CTCs、cfDNA 與臨床和病理學特征間關系分析

乳腺癌患者外周血液中CTCs 數(shù)量和血漿cfDNA 基于Alu 序列的Alu247/115 比值與年齡、淋巴結轉(zhuǎn)移、分級、分子分型、HER-2、遠端轉(zhuǎn)移均有一定的相關性（＜0.05）；與病理類型、腫塊大小、ER、Ki-67 無相關性（＞0.05），見表2。

表2 乳腺癌患者CTCs、cfDNA 與臨床和病理學特征間關系分析量表（ ± s）

3.討論

目前，腫瘤轉(zhuǎn)移被公認為復雜的侵襲—轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程，但是由于效率較低，僅有0.01%擴展至循環(huán)腫瘤細胞才可形成轉(zhuǎn)移灶，有效診斷腫瘤轉(zhuǎn)移，對改善預后具有重要意義。CTCs 與乳腺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤的相關研究表示，CTCs 可作為預測腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的輔助檢測方法。循環(huán)腫瘤細胞最早提出時間為1869 年，目前醫(yī)學界對其定義為：自實質(zhì)瘤或者轉(zhuǎn)移并早上脫落并進入患者外周血循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞，又被稱為是腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶或者循環(huán)上皮細胞，僅有少部分進入外周血中且未被免疫系統(tǒng)識別清除的循環(huán)腫瘤細胞可形成微小癌栓，通過基底膜或者血管，可在遠端其中形成轉(zhuǎn)移灶。目前，已經(jīng)有大量分子生物學研究證實腫瘤早期就存在腫瘤細胞自實體瘤脫落并侵入外周血循環(huán)系統(tǒng)，且循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量、形態(tài)、動態(tài)變化均可直接反映出病情進展、療效。

部分研究表明，CTCs 陽性的乳腺癌患者遠端轉(zhuǎn)移、復發(fā)的風險明顯高于陰性者；也有研究表示CTCs 可作為乳腺癌預后的獨立預測因子，乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展，均與CTCs 存在密切聯(lián)系。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中特異性cfDNA 片段的敏感性更高于CTCs。cfDNA 是一種從原發(fā)性腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血液循環(huán)系統(tǒng)破裂細胞釋放到外周血，造成壞死或者死亡的游離DNA，是一種特異性較強、靈敏度較高的腫瘤生物標志物。CTCs、cfDNA 均可作為乳腺癌的新型液體活檢，可實時監(jiān)測療效，預測預后。

本文結果顯示，乳腺癌患者CTCs、cfDNA 檢測水平均明顯較乳腺良性疾病、健康體檢者高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。乳腺癌患者外周血液中CTCs 數(shù)量和血漿cfDNA 基于Alu 序列的Alu247/115 比值與年齡、淋巴結轉(zhuǎn)移、分級、分子分型、遠端轉(zhuǎn)移、人表皮生長因子受體-2 均有一定的相關性（＜0.05）。表明CTCs、cfDNA 可作為乳腺癌的預測因子。將病理結果作為金標準，以乳腺良性疾病與健康體檢者為對照，若乳腺良性疾病者CTCs-cut-off 為7.68 個/mL，則表示可達到良好的預測效果。本文結果與樊霞等研究結果一致，均證明CTCs、cfDNA 在乳腺癌的診斷中具有重要的預測效果，更有利于觀察患者病情變化，明確復發(fā)與轉(zhuǎn)移風險，對改善機體預后具有重要意義。

綜上所述，在乳腺癌的診斷中，CTCs、cfDNA 可能為輔助診斷的潛在生物學指標，cfDNA 主要檢測腫瘤DNA片段，CTCs 主要檢測腫瘤細胞。將兩項指標作為乳腺癌患者病情變化與診斷的輔助診斷項目，可有效預測潛在轉(zhuǎn)移復發(fā)風險，改善患者預后，值得臨床應用。