活絡(luò)骨康丸對(duì)兔酒精性股骨頭壞死骨特異性堿性磷酸酶和骨鈣素的影響

王國(guó)賓　王少華

【摘 要】目的：探討活絡(luò)骨康丸治療兔股骨頭壞死對(duì)成骨指標(biāo)骨特異性堿性磷酸酶（BALP）和骨鈣素（BGP）的影響，分析藥物作用靶細(xì)胞。方法：將30只日本大耳白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照組給予白酒（酒精度為46%vol）10 mL·kg·d灌胃90 d后，實(shí)驗(yàn)組停止白酒灌胃，改用活絡(luò)骨康丸0.84 g·kg·d灌胃60 d;模型對(duì)照組改為正常飼養(yǎng)60 d?？瞻讓?duì)照組給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液10 mL·kg·d，持續(xù)灌胃90 d后，改為正常飼養(yǎng)60 d。150 d后，3組靜脈采血，測(cè)定BALP和BGP濃度，取雙側(cè)股骨頭顯微鏡下觀察骨組織。結(jié)果：顯微鏡下可見實(shí)驗(yàn)組骨小梁連續(xù)、模型對(duì)照組骨小梁大量破壞。實(shí)驗(yàn)組BALP和BGP濃度值均高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：活絡(luò)骨康丸治療酒精性股骨頭壞死，能夠抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂化，促進(jìn)成骨細(xì)胞功能，分泌合成BALP和BGP。

【關(guān)鍵詞】 股骨頭壞死;活絡(luò)骨康丸;骨特異性堿性磷酸酶;骨鈣素;白兔

Changes of Bone-specific Alkaline Phosphatase and Bone Gla Protein in Rabbits with Alcoholic Necrosis of Femoral Head Treated with Huoluo Gukang Wan（活絡(luò)骨康丸）

WANG Guo-bin，WANG Shao-hua

【ABSTRACT】Objective：To investigate the changes of bone-specific alkaline phosphatase（BALP）and bone gla protein（BGP）in rabbits with osteonecrosis of femoral head treated by Huoluo Gukang Wan

（活絡(luò)骨康丸），and to analyze the target cells of drugs.Methods：Thirty Japanese white rabbits were randomly divided into an experimental group，a model control group and a blank control group，with 10 rabbits in each group.The experimental group and the model group were given 10 mL·kg·d of strong liquor（containing 46% alcohol，vol）.After 90 days，liquor for the experimental group was changed into Huoluo Gukang Wan（0.84 g·kg·d）for 60 days，the model group was normally fed for 60 days.The blank control group was given 10 mL·kg·d of 10% glucose solution by gavage for 90 days，and then changed to normal feeding for 60 days.After 150 days，blood samples were taken from 3 groups and the concentrations of BALP and BGP were measured. The bilateral femoral heads were taken and the bone tissues were observed under the microscope.Results：Under the microscope，the trabeculae in the experimental group were continuous，and the trabeculae in the model group were destroyed.The concentrations of BALP and BGP in the experimental group were higher than those in the model group（P < 0.05）.Conclusion：Huoluo Gukang Wan can treat alcoholic necrosis of femoral head，inhibit the adipogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells，promote the function of osteoblasts，and secrete BALP and BGP.

【Keywords】 osteonecrosis of femoral head;Huoluo Gukang Wan（活絡(luò)骨康丸）;

bone-specific alkaline phosphatase;bone gla protein;white rabbit

股骨頭壞死根據(jù)病因的不同分為創(chuàng)傷性股骨頭壞死和非創(chuàng)傷性股骨頭壞死，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死又以酗酒和大量應(yīng)用激素為主要危險(xiǎn)因素[1-2]，治療上防止股骨頭塌陷、避免進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是主要目標(biāo)[3]?；罱j(luò)骨康丸應(yīng)用臨床三十余年，能改善股骨頭內(nèi)的血流微循環(huán)，促進(jìn)缺血壞死區(qū)骨組織的修復(fù)和再生[4-6]。活絡(luò)骨康丸主要成分是丹參、地龍、黃芪、赤芍、當(dāng)歸、何首烏、熟地黃等，主要功效是破瘀血、通經(jīng)絡(luò)、止痛行氣、滋補(bǔ)肝腎、壯筋骨。課題組早期細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，離心提取的含活絡(luò)骨康丸藥物血清能抑制酒精誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分化成脂肪細(xì)胞，促進(jìn)其成骨分化，抵抗酒精對(duì)機(jī)體造成的毒性作用[4]。本研究通過活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察活絡(luò)骨康丸是否對(duì)成骨細(xì)胞有作用，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳白兔30只，2～3月齡，體質(zhì)量（2.2±0.2）kg，雄性，SPF級(jí)，購(gòu)自武漢市萬千佳興生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2016-0011。兔均飼養(yǎng)于正常生活環(huán)境，飼料喂養(yǎng)，予自由飲食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料（河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)）;活絡(luò)骨康丸[豫藥制字Z20120433（鄭），鄭州市骨科醫(yī)院];骨特異性堿性磷酸酶（BALP）、骨鈣素（BGP）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）;牛欄山二鍋頭白酒（酒精度為46%vol，北京牛欄山酒廠）。

1.3 分組和造模方法 將30只白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組10只。參考文獻(xiàn)[7-9]適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，稱重。實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照組給予白酒10 mL·kg·d灌胃，90 d后實(shí)驗(yàn)組改用活絡(luò)骨康丸（純凈水溶解后）灌胃，參照人和動(dòng)物按體表面積折算出的等效劑量比值表計(jì)算出給藥量為0.84 g·kg·d，連續(xù)灌胃60 d;模型對(duì)照組改為正常飼養(yǎng)60 d?？瞻讓?duì)照組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%葡萄糖溶液10 mL·kg·d連續(xù)灌胃90 d，然后改為正常飼養(yǎng)60 d。上述灌胃操作固定人員執(zhí)行，且每日固定時(shí)間段進(jìn)行。

1.4 取 材 150 d后3組靜脈采血，給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%戊巴比妥鈉40 mg·kg，腹腔注射，麻醉后取雙側(cè)股骨頭。

1.5 ELISA法測(cè)定BALP、BGP 將采集的靜脈血室溫自然凝固，15 min后放入離心機(jī)，以2500 r·min離心15 min，離心半徑6.1 cm，收集上清液;按照試劑盒使用說明書操作測(cè)定BALP、BGP濃度。

1.6 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 股骨頭組織HE染色后，根據(jù)骨微觀結(jié)構(gòu)判定是否有骨壞死形成。骨小梁骨折情況通過骨松質(zhì)髓腔個(gè)數(shù)反映，顯微鏡下單個(gè)視野內(nèi)骨髓腔數(shù)越少，證明有較多的骨小梁斷裂形成髓腔連續(xù)。骨松質(zhì)髓腔計(jì)數(shù)方法：每側(cè)股骨頭縱向切，分為3份形成4個(gè)切面;HE染色，40倍顯微鏡下，每個(gè)股骨頭讀取3個(gè)切面;每個(gè)切面觀察2個(gè)顯微鏡視野平面，各個(gè)股骨頭共計(jì)觀察6個(gè)顯微鏡視野平面;計(jì)數(shù)每個(gè)視野平面骨松質(zhì)髓腔，取其6個(gè)視野平面的骨松質(zhì)髓腔數(shù)均值即為一個(gè)股骨頭骨松質(zhì)髓腔數(shù)。骨松質(zhì)髓腔計(jì)數(shù)原則：①排除隨腔最大徑線低于電腦畫圖軟件100像素的腔隙，該條件為前提;②獨(dú)立的1個(gè)或者在視野邊界的半個(gè)（不完整的）骨松質(zhì)隨腔計(jì)數(shù)為1個(gè)。不完整的髓腔是指：與視野內(nèi)獨(dú)立髓腔不連通且應(yīng)符合100像素以上的最低徑線長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3組樣本統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組白兔股骨頭大體觀察 實(shí)驗(yàn)組及模型對(duì)照組分別意外死亡2只和1只，解剖后顯示為肺部壞死導(dǎo)致的死亡?？瞻讓?duì)照組意外死亡2只，死亡原因不詳。3組股骨頭外形光滑完整，軟骨表面未見損傷。股骨頭被制作切片過程中，股骨頭內(nèi)無明顯缺失，可見紅色骨髓，未見黃色骨髓，骨松質(zhì)髓腔無明顯增大。

2.2 3組白兔股骨頭HE染色病理結(jié)果及骨松質(zhì)髓腔數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)組鏡下可見骨小梁變細(xì)，骨小梁未見明顯中斷，骨松質(zhì)髓腔數(shù)與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹥0.05）。模型對(duì)照組鏡下可見骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，骨小梁中斷明顯，骨松質(zhì)髓腔數(shù)明顯低于空白對(duì)照組（P ﹤0.01）;骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞減少，說明有嚴(yán)重的骨松質(zhì)吸收、缺失?？瞻讓?duì)照組鏡下骨小梁完整連續(xù)、骨松質(zhì)髓腔鏡下獨(dú)立完整、軟骨表面完整無損傷。見圖1、表1。

2.3 3組白兔BALP和BGP血清濃度比較 實(shí)驗(yàn)組BALP血清濃度高于空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組高于模型對(duì)照組，模型對(duì)照組低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹤0.05）。實(shí)驗(yàn)組BGP血清濃度比空白對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹤0.01）。

實(shí)驗(yàn)組BGP血清濃度高于模型對(duì)照組，模型對(duì)照組低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹤0.05）。見表2。

3 討 論

本研究探討活絡(luò)骨康丸對(duì)兔酒精性股骨頭壞死BALP和BGP的影響，采用長(zhǎng)期大量服用烈性白酒進(jìn)行股骨頭壞死模型造模，其原因：第一，盡最大可能更好地還原活體動(dòng)物對(duì)于酒精的反映情況，有利于骨代謝的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè);第二，酒精性股骨頭壞死[10]MSCs的活性并不會(huì)喪失。股骨頭壞死模型的制作有很多種[11-12]，大劑量應(yīng)用激素也可以制作股骨頭壞死模型，但會(huì)造成MSCs失去活性，并不適合該實(shí)驗(yàn)研究。同樣液氮冷凍等快速造模方法類似于創(chuàng)傷性股骨頭壞死，不在本實(shí)驗(yàn)研究的范圍內(nèi)。本次實(shí)驗(yàn)造模時(shí)間為3個(gè)月，宏觀上股骨頭并沒有出現(xiàn)明顯改變，股骨頭未見塌陷、骨軟骨缺損等表現(xiàn);僅有鏡下改變，主要包括軟骨區(qū)、軟骨下區(qū)及壞死區(qū)的病理變化。本實(shí)驗(yàn)研究病理結(jié)果顯示，軟骨區(qū)：實(shí)驗(yàn)組沒有表現(xiàn)出軟骨破壞、分離，但有潮線分離現(xiàn)象，說明有輕微軟骨損傷;模型對(duì)照組表現(xiàn)為軟骨破壞缺失，軟骨和骨分離;空白對(duì)照組鏡下表現(xiàn)正常。軟骨下區(qū)：實(shí)驗(yàn)組鏡下可見骨小梁變細(xì)，骨小梁未見明顯中斷，實(shí)驗(yàn)組骨松質(zhì)髓腔數(shù)與空白對(duì)照組骨松質(zhì)髓腔數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹥0.05）;模型對(duì)照組骨小梁鏡下可見明顯中斷，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，模型對(duì)照組骨松質(zhì)髓腔數(shù)低于空白對(duì)照組（P ﹤0.01）;空白對(duì)照組無異常。壞死區(qū)：實(shí)驗(yàn)組鏡下未見壞死后軟骨內(nèi)成骨，表明不存在大范圍骨壞死;模型對(duì)照組鏡下可見明顯的軟骨內(nèi)成骨，說明有壞死后的反應(yīng)性成骨;空白對(duì)照組骨質(zhì)無異常。以上病理結(jié)果顯示，骨壞死模型制作成功，活絡(luò)骨康丸可以防治股骨頭壞死?；罱j(luò)骨康丸主要成分有地龍、當(dāng)歸、赤芍、丹參、黃芪、何首烏、熟地黃等，君藥破瘀通經(jīng)、引氣止痛，臣藥補(bǔ)氣血、滋陰壯陽、醒脾和胃以扶正氣，佐以活血引經(jīng)藥，使以調(diào)和諸藥。君臣佐使共同發(fā)揮破瘀血、通經(jīng)絡(luò)、行氣止痛、滋補(bǔ)肝腎、壯筋骨的作用。有研究表明，髖關(guān)節(jié)置換患者術(shù)后服用該藥，能夠改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[5]。有學(xué)者應(yīng)用活絡(luò)骨康丸和經(jīng)皮椎體成形術(shù)聯(lián)合治療椎體壓縮性骨折，結(jié)果顯示，患者遠(yuǎn)期椎體高度未見減少，骨密度增高[13]。有研究將活絡(luò)骨康丸與骨疏康治療老年骨質(zhì)疏松進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示，活絡(luò)骨康丸可以治療骨質(zhì)疏松癥[14]。實(shí)驗(yàn)顯示，活絡(luò)骨康丸能夠降低血脂、抑制MSCs成脂化[4]。

本研究為動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組BALP和BGP濃度值均高于模型對(duì)照組和空白對(duì)照組（P ﹤0.05），模型對(duì)照組低于空白對(duì)照組（P ﹤0.05）。骨代謝指標(biāo)[15]包括4類：骨形成標(biāo)志物、鈣磷代謝調(diào)節(jié)指標(biāo)、激素與細(xì)胞因子、骨吸收標(biāo)志物。骨形成標(biāo)志物指標(biāo)中，BALP由成骨細(xì)胞合成，是細(xì)胞外酶的一種，主要作用體現(xiàn)在成骨過程中參與水解磷酸酶;羥基磷灰石的沉積需要磷酸的參與。BALP還可以水解焦磷酸鹽，焦磷酸鹽的存在能抑制骨鹽形成，焦磷酸鹽被水解后有利于成骨。BGP來源主要是成骨細(xì)胞、增生的軟骨細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞。BGP是反映骨形成的特異性生化指標(biāo)，參與成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化，與骨轉(zhuǎn)換相關(guān)[16];能夠維持骨的正常礦化速率，抑制軟骨的礦化速率，并能抑制骨內(nèi)異常的羥磷灰石結(jié)晶形成。由于BALP、BGP來源相對(duì)單一，都是由成骨細(xì)胞合成，因此不像其他骨形成標(biāo)志物如骨保護(hù)素來源于成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞，不方便實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的觀察。國(guó)內(nèi)外研究常用BALP、BGP等骨形成指標(biāo)評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞生成骨質(zhì)情況[17-20]。以上結(jié)果說明，活絡(luò)骨康丸促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能，可以提高骨形成指標(biāo)BALP和BGP的血清濃度值。但本研究是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，活絡(luò)骨康丸在臨床上的應(yīng)用仍然需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，活絡(luò)骨康丸能夠治療酒精性股骨頭壞死，抑制MSCs成脂化，提高成骨細(xì)胞功能，分泌合成BALP和BGP。

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收稿日期：2022-03-08;修回日期：2022-04-19