亞麻木酚素對TGF-β1誘導的心肌細胞H9C2損傷的影響

王玉燕 鐵虎光 金麗山 馬萬程 （青海省第五人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，西寧 810000）

心肌損傷是心血管系統(tǒng)疾?。ㄈ缧牧λソ?、心肌纖維化等）發(fā)生的重要原因之一，心肌細胞是心肌損傷的關鍵細胞［1］。研究表明，氧化損傷、細胞凋亡等是心肌細胞損傷的發(fā)生機制，細胞內(nèi)過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）可誘發(fā)細胞氧化損傷和凋亡［2］。TGF-β1 是心力衰竭、心肌纖維化等的重要誘導因子，可誘導心肌細胞凋亡和氧化損傷［3］。亞麻木酚素（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）是亞麻籽的有效活性成分之一，具有降血脂、抗氧化、預防心血管系統(tǒng)疾病、消炎、抗腫瘤等生物學功能［4］。研究發(fā)現(xiàn)，SDG 可改善心肌功能，對膿毒癥引發(fā)的心臟功能損傷和氧化應激具有治療效果［5］。SDG 處理后鐵超載引發(fā)的心肌損傷程度明顯降低，細胞凋亡和抗氧化酶活性改善［6］。SDG 在體外可抑制氧化應激引起的心肌細胞凋亡，且可與JAK2/STAT3 協(xié)同發(fā)揮作用［7］。目前SDG 在TGF-β1 誘導的心肌細胞損傷中的作用尚不明確。本研究以心肌細胞H9C2 為研究對象，通過CCK-8、Western blot、流式細胞術(shù)等常規(guī)實驗手段研究SDG 的功能，為SDG治療心肌損傷的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細胞H9C2 購自通派（上海）生物科技有限公司；SDG 購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；LDH 檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；JAK2 抗體購自美國Cell Signaling Technology；MDA 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；STAT3 抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；SOD檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；C-Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3抗體購自美國santacruze；TGF-β1購自南京歐凱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 測定SDG 對心肌細胞增殖活性的影響 調(diào)整心肌細胞濃度為3×104個/ml，吸取100 μl細胞懸浮液接種至96孔板，飽和濕度、37 ℃，5%CO2培養(yǎng)12 h，棄上清，更換為含0、50、100、200、400、800 μmol/L SDG 的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出細胞，10μl/孔添加CCK-8 溶液均勻混合，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出培養(yǎng)板，酶標儀檢測450 nm 處OD 值。以0μmol/L SDG 處理的細胞存活率為100%，分析各濃度SDG處理的細胞存活率變化。

1.2.2 細胞分組 心肌細胞分為對照組、模型組、SDG 低、中、高劑量組。對照組不做任何處理；模型組給予20 ng/ml TGF-β1 細胞培養(yǎng)液處理；SDG 低、中、高劑量組同時給予20 ng/ml TGF-β1 和50、100、200 μmol/L SDG 處理。各組細胞培養(yǎng)24 h 后按

1.2.1檢測細胞增殖情況。

1.2.3 LDH、MDA、ROS、SOD 水平檢測 各組細胞培養(yǎng)24 h 后收集細胞和上清，按照LDH、MDA、ROS、SOD 檢測試劑盒說明分別檢測上清和細胞中LDH 水平、細胞中MDA、ROS、SOD 水平。ROS 結(jié)果以相對熒光強度表示（對照組熒光強度設為1），計算LDH相對釋放率（對照組LDH釋放率設為100%）。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h 后，加入0.25%胰蛋白酶制備單細胞懸浮液，PBS 洗滌2 次，加入400μl 結(jié)合緩沖溶液混合，分別加入5μl Annexin V-FITC 及5μl PI 室溫反應15 min，流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達 各組細胞按上述方法培養(yǎng)24 h 后，加入含PMSF 的RIPA 裂解溶液冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 g 離心10 min，取上清，-20 ℃保存，常規(guī)BCA 法檢測蛋白濃度，按1∶4 添加5×蛋白上樣緩沖液，渦旋振蕩，沸水中孵育5 min，安裝洗滌干凈的玻璃板，制備8%分離膠、5%濃縮膠，30 μg/孔加入蛋白樣品，80 V 電泳30 min，蛋白進入分離膠后，100 V繼續(xù)電泳1 h，溴酚藍指示劑進入凝膠底部邊緣時取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中。將裁剪好的PVDF 膜浸泡于無水乙醇，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中備用，轉(zhuǎn)膜（4 ℃、100 V），浸泡于含5%牛血清白蛋白的溶液中室溫搖晃60 min，加入一抗稀釋液4 ℃搖床結(jié)合過夜，加入二抗稀釋液室溫搖晃孵育60 min，ECL顯色，Image J分析條帶灰度值。目的蛋白表達=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值，C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶400、1∶800、1∶600、1∶800、1∶600。

1.2.6 JAK2/STAT3 信號抑制劑對SDG 調(diào)控心肌細胞的影響 采用20 ng/ml TGF-β1、100 μmol/L SDG 和5 μmol/L JAK2/STAT3 信號抑制劑AG490 處理心肌細胞，記為SDG-M+AG490 組，以SDG-M 組為對照，培養(yǎng)24 h 后按1.2.1 檢測細胞增殖，按1.2.3檢測MDA、ROS、SOD、LDH 水平，按1.2.4 檢測細胞凋亡，按1.2.5 檢測C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SDG對心肌細胞增殖的影響 與0μmol/L SDG組相比，50、100、200μmol/L SDG處理的心肌細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而400、800μmol/L SDG處理的心肌細胞存活率明顯降低（P<0.05，表1），因此，選擇對心肌細胞增殖活性無影響的50、100、200μmol/L SDG進行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度SDG處理后心肌細胞存活率（±s，%）Tab.1 Survival rate of cardiomyocytes treated with different concentrations of SDG（±s，%）

表1 不同濃度SDG處理后心肌細胞存活率（±s，%）Tab.1 Survival rate of cardiomyocytes treated with different concentrations of SDG（±s，%）

Note：Compared with 0μmol/L group，1）P<0.05.

Survival rate 100.00±10.47 97.38±12.56 95.47±9.14 94.78±13.07 80.20±7.151）63.01±4.211）18.632<0.001 Concentration of SDG 0μmol/L 50μmol/L 100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L 800μmol/L FP

2.2 SDG 對TGF-β1 誘導的心肌細胞增殖和LDH釋放的影響 與對照組相比，模型組心肌細胞存活率降低，LDH 釋放率升高（P<0.05）；與模型組相比，SDG 低、中、高劑量組心肌細胞存活率升高，LDH 釋放率降低（P<0.05，表2），且呈劑量依賴性，提示SDG 可促進TGF-β1 誘導的心肌細胞增殖，抑制LDH釋放。

表2 各組心肌細胞存活率和LDH釋放率（±s，%）Tab.2 Cardiomyocytes survival rate and LDH release rate in each group（±s，%）

表2 各組心肌細胞存活率和LDH釋放率（±s，%）Tab.2 Cardiomyocytes survival rate and LDH release rate in each group（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

LDH release rate 100.00±5.14 284.31±12.011）210.64±15.202）154.23±13.022）3）120.47±11.492）3）4）392.226<0.001 Groups Control Model SDG-L SDG-M SDG-H FP Survival rate 100.00±9.95 52.24±5.521）65.32±6.912）78.46±6.672）3）93.47±7.302）3）4）63.371<0.001

2.3 SDG對TGF-β1誘導的心肌細胞氧化損傷的影響 與對照組相比，模型心肌細胞MDA和ROS水平升高，SOD 水平降低（P<0.05）；與模型組相比，SDG低、中、高劑量組心肌細胞MDA 和ROS 水平降低，SOD 水平升高（P<0.05，表3），且呈劑量依賴性，提示SDG可抑制TGF-β1誘導的心肌細胞氧化損傷。

表3 各組心肌細胞MDA、ROS、SOD水平（±s）Tab.3 MDA，ROS and SOD levels of cardiomyocytes in each group（±s）

表3 各組心肌細胞MDA、ROS、SOD水平（±s）Tab.3 MDA，ROS and SOD levels of cardiomyocytes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

Groups MDA/（nmol·mg-1）SOD/（U·mg-1）FP Control Model SDG-L SDG-M SDG-H 6.69±0.47 15.47±1.231）12.01±1.042）9.62±0.632）3）7.01±0.512）3）4）154.919<0.001 ROS/Relative fluo?rescence intensity 1.00±0.12 3.69±0.201）2.84±0.222）2.01±0.162）3）1.40±0.102）3）4）370.925<0.001 12.02±1.30 4.12±0.311）6.81±0.442）8.12±0.632）3）11.45±0.782）3）4）163.742<0.001

2.4 SDG 對TGF-β1 誘導的心肌細胞凋亡的影響與對照組相比，模型組心肌細胞凋亡率升高，C-Caspase-3 蛋白表達增多（P<0.05）；與模型組相比，SDG 低、中、高劑量組心肌細胞凋亡率降低，C-Caspase-3 蛋白表達減少（P<0.05，圖1、表4），且呈劑量依賴性。提示SDG 可抑制TGF-β1 誘導的心肌細胞凋亡。

表4 各組心肌細胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s）Tab.4 Apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytes in each group（±s）

表4 各組心肌細胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s）Tab.4 Apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

C-Caspase-3 protein 0.36±0.04 0.96±0.091）0.63±0.062）0.42±0.042）3）0.34±0.032）3）4）177.403<0.001 Groups Control Model SDG-L SDG-M SDG-H FP Apoptosis rate/%7.03±0.52 29.51±3.261）20.45±1.372）14.29±1.302）3）10.08±1.122）3）4）226.030<0.001

圖1 SDG對心肌細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of SDG on cardiomyocytes apoptosis

2.5 SDG 對TGF-β1 誘導的心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的影響 與對照組相比，模型組心肌細胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達降低（P<0.05）；與模型組相比，SDG 低、中、高劑量組心肌細胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達增多（P<0.05，圖2、表5），且呈劑量依賴性。提示SDG 可促進TGF-β1 誘導的心肌細胞JAK2/STAT3信號通路激活。

表5 各組心肌細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平（±s）Tab.5 JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein levels of cardiomyocytes in each group（±s）

表5 各組心肌細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平（±s）Tab.5 JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein levels of cardiomyocytes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

p-STAT3 0.69±0.06 0.28±0.041）0.36±0.032）0.55±0.062）3）0.64±0.062）3）4）127.423<0.001 Groups Control Model SDG-L SDG-M SDG-H FP JAK2 0.85±0.08 0.88±0.10 0.86±0.09 0.87±0.07 0.88±0.09 0.204 0.893 p-JAK2 0.75±0.07 0.26±0.031）0.34±0.042）0.52±0.052）3）0.68±0.072）3）4）171.970<0.001 STAT3 0.83±0.08 0.82±0.07 0.84±0.09 0.85±0.07 0.83±0.06 0.247 0.863

圖2 Western blot檢測SDG對各組心肌細胞JAK2/STAT3信號通路關鍵蛋白表達的影響Fig.2 Western blot to detect effect of SDG on key protein expressions of JAK2/STAT3 signaling pathway in cardiomyocytes in each group

2.6 JAK2/STAT3 信號抑制劑AG490 對心肌細胞增殖、LDH釋放、凋亡和氧化損傷的影響 與SDG-M 組相比，SDG-M+AG490 組心肌細胞存活率降低，LDH釋放率升高，凋亡率升高，MDA、ROS水平升高，SOD水平降低，C-Caspase-3 蛋白表達增多，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達減少（P<0.05，圖3、表6）。提示JAK2/STAT3 信號抑制劑AG490 可逆轉(zhuǎn)SDG 對TGF-β1 誘導的心肌細胞增殖、LDH 釋放、凋亡和氧化損傷的作用。

圖3 JAK2/STAT3 抑制劑AG490 對SDG 處理的心肌細胞凋亡和C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響Fig.3 Effect of JAK2/STAT3 inhibitor AG490 on apoptosis and protein expressions of C-Caspase-3，JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 of cardiomyocytes after SDG treatment

表6 SDG 和JAK2/STAT3 抑制劑AG490 處理后各組心肌細胞存活率、LDH 釋放率、凋亡率、MDA、ROS、SOD 水平及C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達（±s）Tab.6 Cardiomyocytes survival rate，LDH release rate，apoptosis rate，MDA，ROS，SOD levels and C-Caspase-3，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein expressions after SDG and JAK2/STAT3 inhibitor AG490 treatment in each group（±s）

表6 SDG 和JAK2/STAT3 抑制劑AG490 處理后各組心肌細胞存活率、LDH 釋放率、凋亡率、MDA、ROS、SOD 水平及C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達（±s）Tab.6 Cardiomyocytes survival rate，LDH release rate，apoptosis rate，MDA，ROS，SOD levels and C-Caspase-3，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein expressions after SDG and JAK2/STAT3 inhibitor AG490 treatment in each group（±s）

Groups Survival rate/%LDH release rate/%MDA/（nmol·mg-1）SOD/（U·mg-1）Apoptosis rate/%C-Caspase-3 protein JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3 SDG-M SDG-M+AG490 100.00±9.61 100.00±11.02 9.78±0.86 ROS/Relative fluorescence intensity 1.00±0.08 7.69±0.74 12.98±1.53 0.46±0.05 0.88±0.09 0.50±0.07 0.84±0.09 0.52±0.08 80.10±7.22 169.32±12.58 13.65±1.24 2.56±0.18 5.62±0.58 24.10±2.26 0.71±0.07 0.86±0.08 0.29±0.04 0.83±0.06 0.30±0.05 tP 4.967 12.435 7.694 23.759 6.605 12.223 8.719 0.498 7.814 0.277 6.996<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.625<0.001 0.785<0.001

3 討論

TGF-β1是常見的心肌細胞損傷因子，在心臟相關疾病中表達上調(diào)［8］。TGF-β1 可誘導心肌細胞凋亡和氧化損傷［3］。研究顯示，心肌細胞受外界因素刺激后，ROS 無法被及時清除，導致ROS 在細胞內(nèi)過度積累［2］。正常情況下，機體內(nèi)低水平的ROS 對細胞信號轉(zhuǎn)導具有重要作用，當ROS 水平異常升高時，可引起細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，而脂質(zhì)是細胞膜主要成分，導致原本存在于細胞內(nèi)的LDH 被釋放至細胞外，因此檢測LDH 釋放率能夠反映細胞損傷程度［9］。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物［10］。機體內(nèi)ROS 動態(tài)平衡受氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)雙重作用，其中抗氧化酶如SOD 是抗氧化系統(tǒng)的關鍵組成部分，其活性降低后細胞內(nèi)ROS 水平升高［11］。另外，細胞內(nèi)ROS 異常聚集除引起氧化損傷外，還可激活細胞內(nèi)Caspase凋亡級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡［12］。Caspase-3是Caspase 蛋白家族下游因子，在靜息情況下以無活性的酶原形式存在，被剪切活化后才能不可逆地促進細胞凋亡［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激后的心肌細胞增殖活性降低，LDH 釋放率升高，凋亡率升高，細胞中ROS 和MDA 水平升高，SOD 活性降低，C-Caspase-3 蛋白表達升高，提示TGF-β1 可誘導心肌細胞損傷，與既往研究結(jié)論相符。

多種植物均含有木酚素，而亞麻籽中木酚素含量最高，SDG 又稱為開環(huán)異落葉松酚葡萄苷，具有改善腸道、促進成骨分化、抗氧化、抗腫瘤等功效［14］。研究顯示，SDG 對心血管系統(tǒng)疾病也有改善作用［15］。SDG 灌胃后的慢性間歇性低氧小鼠心肌損傷明顯改善，SDG 還可降低心肌組織中MDA 含量［16］。SDG 可減少離體缺血再灌注損傷模型心肌細胞凋亡水平，改善心肌梗死的心臟功能［17］。鐵超載誘導的心肌損傷中發(fā)現(xiàn)，SDG 能夠降低心肌細胞Caspase-3 活化水平，提高SOD 活性，減少細胞凋亡［6］。以上研究證實了SDG強大的抗氧化和抗細胞凋亡功能。本研究發(fā)現(xiàn)，SDG可提高TGF-β1誘導的心肌細胞增殖活性，減少LDH 釋放，降低細胞凋亡水平，提高SOD 活性，降低ROS 和MDA 水平，抑制C-Caspase-3 蛋白表達，說明SDG 可改善TGF-β1 誘導的心肌細胞損傷，與既往研究結(jié)論一致，提示SDG在心肌損傷中發(fā)揮保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，SDG 作用發(fā)揮與調(diào)控信號轉(zhuǎn)導和基因表達有關［16］。SDG 抑制氧化應激條件下心肌細胞凋亡的機制與激活JAK2/STAT3 信號有關［7］。JAK2/STAT3信號通路在機體內(nèi)發(fā)揮多種作用，對組織生長、能量代謝、神經(jīng)損傷、細胞生長等均有調(diào)控功能［18-20］。JAK2/STAT3發(fā)揮作用與JAK2、STAT3磷酸化有關，二者磷酸化水平升高是JAK2/STAT3 信號通路激活的標志［21-22］。研究表明，JAK2/STAT3 信號通路在心肌損傷中激活水平降低，且激活JAK2/STAT3信號通路可改善心肌損傷［7，23］。本研究表明，SDG 可提高TGF-β1 的誘導心肌細胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達，且JAK2/STAT3 信號通路抑制劑可逆轉(zhuǎn)SDG 的作用，說明SDG 通過JAK2/STAT3 信號通路發(fā)揮作用。

綜上，SDG 可改善TGF-β1 的誘導心肌細胞損傷，可抑制心肌細胞凋亡和氧化損傷，其機與激活JAK2/STAT3 信號通路有關，為SDG 治療心肌損傷的臨床應用提供了理論基礎，為闡明SDG 的作用機制提供了參考，課題組將繼續(xù)研究SDG 下游的具體靶向機制。