• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅景天苷調(diào)節(jié)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化及JAK2/STAT3的活化①

    2022-07-21 09:11:46朱美意郭友祥石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科石河子832008
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:紅景天肺纖維化膿毒癥

    虢 強(qiáng) 朱美意 張 杰 許 杰 郭友祥 (石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科,石河子 832008)

    膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征,常見(jiàn)于嚴(yán)重創(chuàng)傷、多發(fā)傷和外科手術(shù)后的患者,按嚴(yán)重程度可分為膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克。據(jù)國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示,全球膿毒癥病死率高達(dá)30%~70%,由于膿毒癥治療費(fèi)用昂貴,醫(yī)療資源消耗大,嚴(yán)重影響人類(lèi)生命健康和生活質(zhì)量[1-3]。目前,臨床上針對(duì)膿毒癥的治療方法主要有液體復(fù)蘇和抗生素治療等[4]。研究表明,膿毒癥發(fā)病機(jī)制與全身性炎癥反應(yīng)、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷及外來(lái)感染源相關(guān),與多系統(tǒng)、多器官的病理生理改變緊密聯(lián)系,而肺臟是膿毒癥并發(fā)癥中損傷最嚴(yán)重的器官之一,膿毒癥發(fā)生時(shí),大量炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放和活化,導(dǎo)致機(jī)體抗炎和促炎因子失衡,免疫功能受損,從而促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5-6]。紅景天苷是紅景天根的活性成分,具有抗衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and perforation,CLP)誘導(dǎo)膿毒癥小鼠模型,探究紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺纖維化、炎癥和JAK2/STAT3磷酸化的影響,為紅景天苷在膿毒癥中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥物、試劑及儀器 紅景天苷(純度≥98%)購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司(CAS10338-51-9);HE試劑盒、Masson試劑盒和ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)、波形蛋白(Vimentin)、Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)、IL-4、IL-6、IL-10、JAK2、STAT3和GAPDH兔單克隆單體及HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀(上海塔望智能科技有限公司,PFT-MR);光學(xué)顯微鏡(日本尼康,Eclipse E100);脫色搖床(Servicebio,TSY-B);掌上離心機(jī)(Servicebio,MX-F);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,RM2016);組織攤片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);移液 槍?zhuān)―ragon,KE0003087/KA0056573);酶 標(biāo) 儀(Rayto,RT-6100);臺(tái)式高速離心機(jī)(DRAGONLAB,D3024R)。

    1.1.2 動(dòng)物分組、建模及給藥 50只清潔級(jí)BALB/c小鼠(雄雌不限,體質(zhì)量20~25 g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011,使用許可證號(hào):SYXK(京)2017-0033。動(dòng)物飼養(yǎng)條件:每只小鼠給予24 h 晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格、規(guī)范的卡片登記管理,24 ℃條件下獨(dú)立飼養(yǎng),建模前24 h 小鼠禁食不禁水。將小鼠分為健康對(duì)照組、模型組、模型+5 mg/kg紅景天苷組、模型+10 mg/kg 紅景天苷組、模型+20 mg/kg 紅景天苷組(n=10)。模型加藥組小鼠參照文獻(xiàn)[7]分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 紅景天苷,1 h 后模型組和模型加藥組小鼠參照文獻(xiàn)[8]采用CLP 建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型,腹腔注射10%水合氯醛(20 mg/kg)麻醉小鼠,腹部消毒后正中開(kāi)腹,絲線結(jié)扎盲腸的根部,用無(wú)菌絲線結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端1.5~1.8 cm 處,用18 號(hào)無(wú)菌針頭在已經(jīng)結(jié)扎的盲腸遠(yuǎn)端中央處貫通穿刺,擠出少量?jī)?nèi)容物后將盲腸原位推回至腹腔并縫合切口,健康對(duì)照組只開(kāi)腹、關(guān)腹并復(fù)蘇,不進(jìn)行CLP。術(shù)后10 h取血并處死大鼠,收集小鼠肺組織,組織清洗后部分組織置于4%多聚甲醛中固定用于染色實(shí)驗(yàn),剩余組織置于液氮中保存用于分子實(shí)驗(yàn)。

    1.2 方法

    1.2.1 肺功能檢測(cè) 取4%多聚甲醛固定的肺組織,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE 染色。石蠟包埋組織并切片,組織切片厚4 μm,將切片清洗后浸入二甲苯和不同濃度梯度的乙醇溶液中30 min,用無(wú)水乙醇脫水處理。然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,最后用二甲苯和乙醇進(jìn)行透明,中性樹(shù)脂封片,隨機(jī)選取10個(gè)視野在顯微鏡下觀察拍照,并記錄組織病理變化。胞核呈藍(lán)紫色,胞質(zhì)呈紅色。參照文獻(xiàn)[9]對(duì)各組小鼠進(jìn)行肺組織損傷評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡出血和肺泡結(jié)果完整性破壞等項(xiàng)目,0分:無(wú)肺損傷;0.25~2.5分;輕度或中度肺損傷:2.6~4 分:嚴(yán)重肺損傷,40 倍顯微鏡下,每組隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行肺損傷評(píng)分,結(jié)果取平均值,肺損傷評(píng)分越高表示損傷程度越嚴(yán)重。采用干濕重法測(cè)定各組小鼠肺組織濕干重比值(W/D),取小鼠右肺下葉用4%多聚甲醛固定后稱(chēng)取濕重,然后置于70 ℃烘箱中烘干72 h 后稱(chēng)取干重,計(jì)算肺組織W/D,利用動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)各組小鼠肺靜息通氣量。

    1.2.2 Masson 染色觀察肺纖維化 取4%多聚甲醛固定的肺組織,石蠟包埋組織并切片,脫蠟水洗處理步驟同1.2.1,經(jīng)Masson染色后,用二甲苯和無(wú)水乙醇透明,中性樹(shù)脂封片,于顯微鏡下觀察拍照并記錄分析,胞質(zhì)、肌纖維、紅細(xì)胞和纖維素呈橙紅色,胞核呈藍(lán)褐色,膠原纖維被染成藍(lán)色。

    1.2.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 液氮中取出肺組織,自然解凍后用手術(shù)剪將組織剪成組織小塊并置于研磨儀中研磨均勻。采用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取組織總蛋白,4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min 后取上清,BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白總濃度,每孔上樣20 μg,經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后,加入一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育過(guò)夜,次日回收一抗,加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000),室溫下?lián)u床孵育2 h 后,采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片整理去色并存檔,分別與GAPDH 蛋白灰度值比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。

    1.2.4 ELISA檢測(cè)炎癥因子含量 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定外周血中iNOS、IL-4、IL-6、IL-10含量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為±s。多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD 法,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺功能的影響 HE染色觀察各組小鼠肺組織病理?yè)p傷程度,健康對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡腔清晰可見(jiàn),肺泡間間隔無(wú)水腫和炎癥浸潤(rùn)。與健康對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,無(wú)完整的肺泡結(jié)構(gòu),可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化,10 mg/kg 和20 mg/kg 紅景天苷組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)趨于正常,可見(jiàn)完整的肺泡結(jié)構(gòu),肺泡間質(zhì)僅見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野對(duì)各組小鼠進(jìn)行肺組織病理?yè)p傷評(píng)分,結(jié)果取平均值,同時(shí)檢測(cè)肺功能指標(biāo)水平,與健康對(duì)照組相比,模型組小鼠肺損傷評(píng)分、肺組織W/D 顯著升高,肺靜息通氣量顯著減少(P<0.05)。與模型組相比,5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺損傷評(píng)分、肺組織W/D 和肺靜息通氣量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺損傷評(píng)分和肺組織W/D 降低,肺靜息通氣量增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。提示紅景天苷能夠改善CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織病理?yè)p傷。

    圖1 各組小鼠肺組織HE染色及肺功能檢測(cè)(HE,×400)Fig.1 HE staining and pulmonary function test of lung tissue of mice in each group(HE,×400)

    2.2 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺組織纖維化的影響 如圖2所示,健康對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)藍(lán)色的膠原纖維。與健康對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維和組織損傷。與模型組相比,5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織纖維化程度無(wú)明顯差異,10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,可見(jiàn)少量的藍(lán)色膠原纖維。提示紅景天苷可減輕CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織纖維化。

    圖2 小鼠肺組織Masson染色圖(×400)Fig.2 Masson staining image of mice lung tissue(×400)

    2.3 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺組織纖維化蛋白水平的影響 與健康對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin、ColⅠ蛋白水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比,5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),10 mg/kg和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平均顯著下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3。提示紅景天苷能夠抑制CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織纖維化。

    圖3 小鼠肺組織纖維標(biāo)志蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of fibrous marker proteins in mice lung tissue

    2.4 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠炎癥因子含量的影響 與健康對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中誘導(dǎo)型iNOS、IL-6、IL-4 和IL-10 含量均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,5 mg/kg紅景天苷組小鼠炎癥因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中iNOS、IL-6 水平顯著降低,IL-4 和IL-10 水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖4。提示紅景天苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織炎癥因子水平緩解肺損傷。

    圖4 小鼠肺組織炎癥因子水平Fig.4 Levels of inflammatory factors in mice lung tissue

    2.5 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺組織JAK2和STAT3磷酸化的影響 如圖5所示,與健康對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比,5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),10 mg/kg 和20 mg/kg 紅景天苷組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平均顯著下調(diào)(P<0.05)。提示紅景天苷可能通過(guò)JAK2/STAT3 信號(hào)通路調(diào)節(jié)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化和炎癥。

    圖5 小鼠肺組織p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平Fig.5 Protein expression levels of p-JAK2 and p-STAT3 in mice lung tissue

    3 討論

    研究表明,紅景天苷在急性肺損傷中具有保護(hù)作用,如紅景天苷通過(guò)上調(diào)SIRT1 表達(dá)抑制NF-κB和HMGB1 通路的活化,緩解CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肺損傷和炎癥反應(yīng)[10]。紅景天苷通過(guò)調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞中miRNA-146 外泌體的分泌抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng),還可通過(guò)抑制NF-κB 磷酸化保護(hù)急性肺損傷大鼠肺損傷等[11-12]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)紅景天苷給藥治療后,CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺損傷得到顯著改善,肺功能明顯好轉(zhuǎn)。提示紅景天苷在膿毒癥小鼠肺損傷中具有保護(hù)作用。

    肺纖維化是指成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴隨炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞等的一系列病理變化[13-14]。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞增殖、分化及膠原蛋白形成的標(biāo)志蛋白。FN 是細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白成分,是成纖維細(xì)胞的活化因子,與肺纖維化密切相關(guān)。Vimentin 是中間絲中的一種蛋白質(zhì),為微管和肌動(dòng)蛋白提供彈性,是維持細(xì)胞骨架完整性的重要蛋白。ColⅠ是上皮細(xì)胞活化、膠原酶形成及骨結(jié)構(gòu)完整性的膠原蛋白。張翠影等[15]發(fā)現(xiàn),α-SMA、FN、ColⅠ在急性肺損傷小鼠肺組織中的高表達(dá)與肺纖維化和肺損傷呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)紅景天苷治療后,膿毒癥小鼠肺纖維化程度明顯改善,α-SMA、FN、Vimentin和ColⅠ蛋白表達(dá)水平顯著降低,且20 mg/kg紅景天苷治療效果最佳,此結(jié)果與張翠影等[15]的研究結(jié)果相符,說(shuō)明紅景天苷對(duì)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化具有抑制作用。

    肺部炎癥和免疫功能障礙是膿毒癥小鼠肺功能損傷的主要因素,膿毒癥發(fā)生時(shí),炎癥因子和免疫因子大量釋放,導(dǎo)致肺組織發(fā)生免疫失調(diào)和過(guò)度炎癥反應(yīng),從而發(fā)生急性肺損傷[16]。iNOS、IL-4、IL-6、IL-10 是重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子,iNOS 和IL-6在炎癥反應(yīng)中促進(jìn)炎癥發(fā)生,而IL-4和IL-10是炎癥和免疫抑制因子[17-19]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)紅景天苷給藥治療后,膿毒癥小鼠肺組織中iNOS、IL-6 含量顯著降低,IL-4 和IL-10 含量顯著升高,結(jié)果提示紅景天苷通過(guò)調(diào)節(jié)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織中炎癥因子水平緩解小鼠肺損傷。

    為進(jìn)一步明確紅景天苷調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠肺組織纖維化和炎癥的作用機(jī)制,課題組檢測(cè)了JAK2和STAT3的磷酸化水平,JAK2是非受體型酪氨酸蛋白激酶家族成員,STAT3 是信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子,JAK2/STAT3 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]。當(dāng)機(jī)體受外界炎癥因子刺激時(shí),胞外信號(hào)蛋白與膜上受體結(jié)合并激活JAK2,活化的JAK2 使受體多位點(diǎn)酪氨酸殘基磷酸化,吸引STAT3 與受體結(jié)合并磷酸化,磷酸化的JAK2誘導(dǎo)p-STAT3二聚體化或異二聚體化,并從復(fù)合物上脫離易位至細(xì)胞核內(nèi),與相應(yīng)的反應(yīng)元件結(jié)合,最后介導(dǎo)目的基因和炎癥因子的表達(dá),炎癥因子又激活JAK2/STAT3 通路加重機(jī)體組織損傷[21]。王國(guó)全等[22]發(fā)現(xiàn),膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中高表達(dá)JAK2 和STAT3,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織中高表達(dá)p-JAK2 和p-STAT3,經(jīng)紅景天苷治療后,膿毒癥小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)水平顯著降低。結(jié)合前期結(jié)果提示,紅景天苷通過(guò)下調(diào)JAK2 和STAT3 表達(dá)抑制CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺炎癥反應(yīng)。

    綜上所述,紅景天苷對(duì)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化、炎癥具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

    猜你喜歡
    紅景天肺纖維化膿毒癥
    我國(guó)研究人員探索肺纖維化治療新策略
    中老年保健(2022年2期)2022-11-25 23:46:31
    紅景天的神奇功效及作用
    遺傳性T淋巴細(xì)胞免疫缺陷在百草枯所致肺纖維化中的作用
    血清IL-6、APC、CRP在膿毒癥患者中的表達(dá)及臨床意義
    特發(fā)性肺纖維化合并肺癌
    膿毒癥的病因病機(jī)及中醫(yī)治療進(jìn)展
    紅景天 直銷(xiāo)牌照何日可待
    膿毒癥早期診斷標(biāo)志物的回顧及研究進(jìn)展
    沙利度胺治療肺纖維化新進(jìn)展
    紅景天及紅景天苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用
    国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩中字成人| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久久人人人人人| 国产在线视频一区二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品 欧美亚洲| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久久大尺度免费视频| 18禁国产床啪视频网站| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久热久热在线精品观看| 91精品三级在线观看| 美女大奶头黄色视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| av卡一久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 男女免费视频国产| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品乱久久久久久| 一二三四中文在线观看免费高清| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人精品一,二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲美女视频黄频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 久久精品国产亚洲av涩爱| 街头女战士在线观看网站| 成人漫画全彩无遮挡| 一二三四在线观看免费中文在| 国产淫语在线视频| 1024视频免费在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产黄频视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品免费视频内射| kizo精华| 婷婷色综合大香蕉| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丝袜美足系列| 久久精品国产综合久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在现免费观看毛片| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久久人妻| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品不卡视频一区二区| 波野结衣二区三区在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 寂寞人妻少妇视频99o| 大香蕉久久成人网| xxx大片免费视频| av不卡在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 97在线视频观看| 97精品久久久久久久久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| av免费观看日本| 亚洲,一卡二卡三卡| 中文字幕亚洲精品专区| 国产熟女欧美一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99热国产这里只有精品6| 高清不卡的av网站| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av中文av极速乱| 中文字幕最新亚洲高清| 热re99久久精品国产66热6| 91精品三级在线观看| av福利片在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美日韩精品网址| 看免费成人av毛片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品一区二区三卡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 99国产精品免费福利视频| 超碰97精品在线观看| 国产在线视频一区二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 99久久精品国产国产毛片| 日韩视频在线欧美| 日韩av不卡免费在线播放| 色哟哟·www| 韩国av在线不卡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产 一区精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 丝瓜视频免费看黄片| 国产av精品麻豆| 女人精品久久久久毛片| 欧美日韩av久久| kizo精华| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品不卡视频一区二区| 精品一区二区免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美另类一区| 久久久久久久国产电影| 满18在线观看网站| 最近中文字幕高清免费大全6| 韩国精品一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 18禁动态无遮挡网站| 90打野战视频偷拍视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 成人亚洲欧美一区二区av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产成人aa在线观看| 深夜精品福利| 日韩大片免费观看网站| 超碰97精品在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 在线观看三级黄色| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美激情高清一区二区三区 | 9热在线视频观看99| 亚洲第一青青草原| 色吧在线观看| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产亚洲最大av| 午夜激情av网站| 欧美人与善性xxx| 国产麻豆69| 国产精品嫩草影院av在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 七月丁香在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 人妻人人澡人人爽人人| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩中字成人| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久欧美国产精品| 成人黄色视频免费在线看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产视频首页在线观看| 自线自在国产av| 寂寞人妻少妇视频99o| 成人漫画全彩无遮挡| 老熟女久久久| 中文欧美无线码| 亚洲国产最新在线播放| 午夜福利,免费看| 美女国产视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 午夜影院在线不卡| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本爱情动作片www.在线观看| 男女午夜视频在线观看| 日本午夜av视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产不卡av网站在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品酒店卫生间| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产片内射在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲天堂av无毛| 99久久精品国产国产毛片| 欧美激情 高清一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 久久鲁丝午夜福利片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成年人午夜在线观看视频| 1024香蕉在线观看| 中文字幕色久视频| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美人与善性xxx| 成人国产av品久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 日本黄色日本黄色录像| 国产极品天堂在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一级爰片在线观看| 国产av码专区亚洲av| 亚洲av男天堂| 久久久久精品性色| 韩国精品一区二区三区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 最黄视频免费看| 在线观看免费高清a一片| 欧美成人午夜免费资源| 免费高清在线观看日韩| 国产综合精华液| 一级爰片在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 久久av网站| 中国三级夫妇交换| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久久久久久久久久大奶| 国产在视频线精品| 亚洲,欧美,日韩| 国产成人精品婷婷| 丁香六月天网| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 黑丝袜美女国产一区| 久久热在线av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲经典国产精华液单| 黄色怎么调成土黄色| 国产xxxxx性猛交| 五月伊人婷婷丁香| 国产乱来视频区| 国产免费福利视频在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 深夜精品福利| av天堂久久9| 国产一区有黄有色的免费视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产亚洲一区二区精品| 1024视频免费在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久久久久久久免费视频了| 午夜免费观看性视频| 亚洲av男天堂| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品偷伦视频观看了| 老司机影院成人| 午夜福利在线免费观看网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 1024香蕉在线观看| 丰满乱子伦码专区| h视频一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 丝瓜视频免费看黄片| 91aial.com中文字幕在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 免费观看性生交大片5| 久久毛片免费看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久久久久久国产电影| 日本午夜av视频| 久久人人爽人人片av| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产1区2区3区精品| 亚洲,欧美精品.| 亚洲内射少妇av| 日本91视频免费播放| 日韩伦理黄色片| 性色av一级| 伊人亚洲综合成人网| 欧美人与性动交α欧美软件| 熟女电影av网| 精品久久久精品久久久| 国产av精品麻豆| 久久 成人 亚洲| 人妻一区二区av| 亚洲欧洲日产国产| 成年动漫av网址| 亚洲精品乱久久久久久| 波多野结衣av一区二区av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| a级毛片在线看网站| 我要看黄色一级片免费的| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲成人手机| 国产成人精品在线电影| 亚洲国产欧美网| 国产欧美亚洲国产| 韩国高清视频一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久久网色| 午夜福利网站1000一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产探花极品一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 尾随美女入室| 黄片播放在线免费| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产一区二区三区av在线| 亚洲精品日本国产第一区| 香蕉丝袜av| 男男h啪啪无遮挡| www.av在线官网国产| 精品一区在线观看国产| 赤兔流量卡办理| 一级片'在线观看视频| 在线观看人妻少妇| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产野战对白在线观看| 久久久久久伊人网av| 男人舔女人的私密视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 丝瓜视频免费看黄片| 最新中文字幕久久久久| 成年av动漫网址| 日本午夜av视频| 国产一级毛片在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 超色免费av| 少妇 在线观看| 国产精品 国内视频| 国产 精品1| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美精品亚洲一区二区| 男女边摸边吃奶| 久久久久国产精品人妻一区二区| freevideosex欧美| 性色av一级| 青草久久国产| 久热久热在线精品观看| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产麻豆69| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区av电影网| 精品亚洲成a人片在线观看| 性少妇av在线| 国产在线一区二区三区精| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看国产h片| 日韩三级伦理在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 在线天堂中文资源库| 国产精品欧美亚洲77777| 十八禁高潮呻吟视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 中文字幕最新亚洲高清| 伊人久久国产一区二区| 制服丝袜香蕉在线| 中文字幕av电影在线播放| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 女性被躁到高潮视频| 在线天堂中文资源库| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产欧美亚洲国产| 99九九在线精品视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品久久久久久av不卡| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日本欧美国产在线视频| av网站免费在线观看视频| 丝袜脚勾引网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费黄色在线免费观看| 街头女战士在线观看网站| 婷婷成人精品国产| 日韩精品有码人妻一区| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品免费大片| 午夜福利,免费看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲人成77777在线视频| 一区二区三区乱码不卡18| 久久人妻熟女aⅴ| 男人爽女人下面视频在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲五月色婷婷综合| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩av免费高清视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 老熟女久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产淫语在线视频| 精品第一国产精品| 亚洲国产日韩一区二区| av卡一久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美精品一区二区免费开放| 国产爽快片一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 我要看黄色一级片免费的| 满18在线观看网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费观看a级毛片全部| 久久久久久人妻| 成人国产av品久久久| 亚洲,欧美精品.| 久久久久久久久免费视频了| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| av网站免费在线观看视频| 欧美成人午夜精品| 又大又黄又爽视频免费| 午夜影院在线不卡| 国产高清国产精品国产三级| www.av在线官网国产| 丰满少妇做爰视频| av网站免费在线观看视频| 天堂俺去俺来也www色官网| av福利片在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美国产精品一级二级三级| 十八禁网站网址无遮挡| 一本久久精品| 老鸭窝网址在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩制服骚丝袜av| 精品一区二区三卡| 黄片播放在线免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品99久久99久久久不卡 | 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产日韩一区二区| 99久久精品国产国产毛片| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲成人一二三区av| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品久久久av美女十八| 精品一区在线观看国产| 女人久久www免费人成看片| 欧美人与性动交α欧美软件| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品人妻久久久影院| 成人午夜精彩视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 制服丝袜香蕉在线| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av男天堂| 国产精品国产av在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 免费观看在线日韩| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩伦理黄色片| 在线观看一区二区三区激情| 久久综合国产亚洲精品| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 新久久久久国产一级毛片| 有码 亚洲区| 99国产精品免费福利视频| 性色avwww在线观看| 国产精品 国内视频| 欧美 日韩 精品 国产| 一边亲一边摸免费视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 熟女av电影| 亚洲国产欧美网| 伊人亚洲综合成人网| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩大片免费观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| av国产久精品久网站免费入址| 男女下面插进去视频免费观看| 妹子高潮喷水视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产精品999| 久久午夜福利片| 电影成人av| 亚洲精品国产av蜜桃| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久精品人妻al黑| 我要看黄色一级片免费的| 只有这里有精品99| 91成人精品电影| av天堂久久9| 黑丝袜美女国产一区| 少妇 在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩一区二区视频免费看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲在久久综合| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 免费日韩欧美在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产免费又黄又爽又色| av国产精品久久久久影院| 寂寞人妻少妇视频99o| 曰老女人黄片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费看av在线观看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产av一区二区精品久久| 成人影院久久| 亚洲在久久综合| 热99国产精品久久久久久7| 国产 一区精品| 日本欧美视频一区| 国产av国产精品国产| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美中文综合在线视频| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 成年人免费黄色播放视频| 国产片特级美女逼逼视频| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区日韩欧美中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 2022亚洲国产成人精品| 丁香六月天网| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 中文字幕制服av| 97在线视频观看| 黑丝袜美女国产一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 各种免费的搞黄视频| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品国产一区二区久久| kizo精华| 不卡av一区二区三区| 日韩中字成人| 少妇的逼水好多| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久精品亚洲av国产电影网| 日本欧美视频一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲精品视频女| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男女免费视频国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 搡老乐熟女国产| 久久人妻熟女aⅴ| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美另类一区| 欧美激情高清一区二区三区 | 女性生殖器流出的白浆| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 人人妻人人澡人人看| 国产精品国产av在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 美女大奶头黄色视频| 新久久久久国产一级毛片| 日本av手机在线免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久久久久精品精品| 伊人亚洲综合成人网| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费观看性生交大片5| 男女边摸边吃奶| 少妇精品久久久久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 午夜福利网站1000一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 日本vs欧美在线观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品久久午夜乱码| 色网站视频免费| 我要看黄色一级片免费的| freevideosex欧美| 亚洲图色成人| 一级毛片电影观看| 国产在线免费精品| 在现免费观看毛片|