HIV-1感染者病毒學(xué)指標(biāo)與血漿中白細(xì)胞介素表達(dá)水平的相關(guān)性研究①

畢銘轅 李建輝 康 文 孫永濤 （中國(guó)人民解放軍空醫(yī)軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院傳染病科，西安 710038）

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）是由多種細(xì)胞產(chǎn)生，參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、免疫激活、信息傳遞等多種過程的一類細(xì)胞因子［1］。由于IL作用廣泛，IL 家族根據(jù)其主要性質(zhì)分為IL-1、IL-2、趨化因子、IL-10、IL-12及IL-17等。IL家族中與HIV-1感染及感染后患者免疫炎癥激活狀態(tài)相關(guān)的因子較多，包括主要為促炎癥因子的IL-1 家族中的IL-1β、IL-6和IL-18［2-4］；具有趨化作用的IL-8［5］；主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的IL-10家族中的IL-10、IL-16等［6-7］。盡管已有研究表明HIV-1 感染后，患者體內(nèi)這些IL 表達(dá)會(huì)有一定改變，但其在血漿中的表達(dá)與未治療HIV-1感染者的病毒學(xué)水平，尤其是與HIV-1 DNA 水平是否相關(guān)鮮有報(bào)道。本研究根據(jù)HIV-1 RNA 或HIV-1 DNA 水平對(duì)HIV-1 感染者進(jìn)行分組，觀察不同組間IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)差異，并分析其與HIV-1 RNA及HIV-1 DNA的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的HIV-1 感染者75 例，所有HIV-1 感染者均經(jīng)初篩和HIV-1抗體確認(rèn)試驗(yàn)，無HBV/HCV 合并感染或腫瘤，一般狀況良好，采血前均未接受過任何抗病毒治療。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（201911-04），患者血液樣本僅用于科研，75例患者一般資料及部分檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 未治療HIV患者基本信息Tab.1 Basic information of untreated patients with HIV

1.1.2 主要試劑與儀器 QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）；HIV-1 核酸檢測(cè)試劑盒、DNA 定量檢測(cè)試劑盒（廣州海力特）；CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP 熒光單克隆抗體試劑盒（同生時(shí)代）；Luminex Assay Human Premixed Multi-Analyte 試劑盒（R&D公司）；FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀（BD公司）；

1.2 方法

1.2.1 PBMC 中DNA 提取 抽取受試者EDTA 抗凝的外周血10 ml用于PBMC 分離、流式細(xì)胞檢測(cè)和病毒核酸定量檢測(cè)。采用密度梯度離心法分離得到PBMC，用于后續(xù)檢測(cè)。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取PBMC樣本總DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，采用50 μl buffer AE 洗脫DNA 并保存于滅菌的200 μl EP 管。采用ScanDrop 儀檢測(cè)提取的DNA 核濃度，直接進(jìn)行HIV-1 DNA 定量檢測(cè)或-20 ℃凍存。

1.2.2 HIV-1 RNA 定量檢測(cè) 采用HIV-1 核酸檢測(cè)試劑盒，在ABI 7500 熒光PCR 儀上對(duì)血漿樣本中HIV-1 RNA 進(jìn)行定量檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，結(jié)果以U/ml表示，最低檢測(cè)限為20 U/ml。

1.2.3 HIV-1 DNA 定量檢測(cè) 采用HIV-1 DNA 定量檢測(cè)試劑盒，在ABI 7500 熒光PCR 儀上對(duì)PBMC樣本中提取的HIV-1 DNA 進(jìn)行定量檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，結(jié)果以copies/106cells 表示，最低檢測(cè)限為20 copies/106cells。

1.2.4 外周血CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP 熒光單克隆抗體試劑盒和BD FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞數(shù)，取50 μl 全血，采用20 μl 單克隆混合抗體混合物孵育20 min，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果采用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 Luminex 液相芯片檢測(cè)趨化因子 選取IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18并訂制對(duì)應(yīng)的Luminex Assay Human Premixed Multi-Analyte Kit 試劑盒。取50 μl 血漿樣本并嚴(yán)格按照說明書操作，Luminex 200儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0 軟件和Graph Pad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、分析及繪圖。一般資料采用描述性分析，計(jì)量資料以±s表示。組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。由于HIV-1 DNA 及HIV-1 RNA 分布差異較大，取對(duì)數(shù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。相關(guān)性分析采用散點(diǎn)圖及Pearson 相關(guān)分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病毒學(xué)水平及外周血CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 根據(jù)患者HIV-1 DNA是否<103copies/106cells 或HIV-1 RNA 是 否<106 U/ml 分 為4 組：DNA 高水平組（DHG）、DNA 低水平組（DLG）、RNA高水平組（RHG）和RNA 低水平組（RLG），各組患者一般資料、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2、表3）。

表2 HIV-1 DNA高、低組間差異Tab.2 Differences between high and low HIV-1 DNA groups

表3 HIV-1 RNA高、低組間差異Tab.3 Differences between high and low HIV-1 RNA groups

2.2 各組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)比較 根據(jù)以上分組方法，對(duì)DLG 與DHG、RLG與RHG 組患者IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果表明IL-8 表達(dá)在兩種分組方法下差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），DHG 組與DLG組IL-1β 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1）。

圖1 各組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表達(dá)Fig.1 Expressions of IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-16 and IL-18 in each group

2.3 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 與病毒學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析 上述結(jié)果表明不同HIV-1 RNA或HIV-1 DNA 水平組間趨化因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16和IL-18表達(dá)存在差異。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明，IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)與lgDNA 相關(guān)（r=-0.420、0.271、-0.332 和0.294，P<0.05），IL-1β和IL-8表達(dá)則與lgDNA 無關(guān)（r=-0.121和0.123，P>0.05）。同時(shí)，IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)與lgRNA 相關(guān)（r=-0.298、-0.462、0.299、-0.229 和0.269，P<0.05），而IL-8 表 達(dá) 與lgRNA 無 關(guān)（r=0.123，P>0.05，圖2）。

圖2 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表達(dá)與病毒學(xué)指標(biāo)相關(guān)性Fig.2 Correlation between expressions of IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-16 and IL-18 and virological indicators

3 討論

IL-1β 是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，主要由外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［8］。炎癥、感染等刺激往往會(huì)誘導(dǎo)IL-1β水平升高，如HIV-1感染者腸道相關(guān)淋巴組織中IL-1β基因表達(dá)較健康人明顯增高［2］。但也有研究表明，IL-1β在體外可抑制淋巴細(xì)胞系、Jurkat 細(xì)胞和分離的PBMC 中HIV-1 復(fù)制，且可能通過阻斷caspase-3 表達(dá)和激活進(jìn)而抑制病毒復(fù)制［4，9］。

IL-6 為促炎細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)多種生理學(xué)過程，尤其是在急性炎癥反應(yīng)和從急性炎癥向慢性炎癥轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用［10］。長(zhǎng)期以來，HIV-1 感染已被證明可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-6，即使在病毒學(xué)抑制情況下，接受治療的HIV 感染者血漿IL-6 水平也明顯高于匹配良好的未感染對(duì)照組［11-12］。最近研究表明，HIV-1感染者血漿IL-6水平升高與貧血、心血管疾病、癌癥等不良臨床結(jié)果相關(guān)［13-15］。IL-6 水平持續(xù)升高證明活動(dòng)性炎癥可能對(duì)HIV-1 感染者預(yù)后具有重要臨床意義，但其是否參與并影響病毒復(fù)制過程尚無定論［3］。

IL-10 被認(rèn)為是可由多種類型免疫細(xì)胞產(chǎn)生的Th2 型細(xì)胞因子，具有間接抑制Th1 反應(yīng)的功能。研究表明，HIV-1、HBV、HCV 等多種病毒導(dǎo)致的慢性感染狀態(tài)下，IL-10 表現(xiàn)出對(duì)T 細(xì)胞的持續(xù)抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)病毒感染活性［16］。IL-10可直接作用于抗原提呈細(xì)胞，減少刺激分子表達(dá)，阻止初始T細(xì)胞成熟，或直接作用于T 細(xì)胞以限制其增殖、功能分化［6］。HIV 感染者PBMC 產(chǎn)生的IL-10 可抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生，而阻斷IL-10可有效地在體外恢復(fù)這些細(xì)胞的功能［17］。

IL-16是一種淋巴細(xì)胞趨化因子，作為CD4的天然可溶性配體，具有促炎和免疫調(diào)節(jié)特性，對(duì)CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞也具有趨化作用［7］。IL-16 的抗病毒活性最初是在分離培養(yǎng)的CD8+T 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，可抑制HIV-1和SIV復(fù)制［18］。盡管IL-16和HIV-1 均以CD4 為受體，但研究表明其并不共享共同結(jié)合位點(diǎn)［19］。因此，IL-16作為一種內(nèi)源性抗病毒因子，在抑制HIV-1復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。

IL-18是一種促炎癥、促凋亡和致動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞因子，屬于IL-1 細(xì)胞因子家族，關(guān)于其對(duì)HIV-1復(fù)制的影響一直頗有爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為IL-18通過誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5等Th2 型細(xì)胞因子，促進(jìn)初始CD4+T 細(xì)胞發(fā)育和分化為Th2 效應(yīng)細(xì)胞，從而抑制抗HIV-1 的免疫作用，間接促進(jìn)HIV-1 復(fù)制［20］。也有研究認(rèn)為IL-18 通過介導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生及上調(diào)SAMHD1 表達(dá)限制HIV-1 在初始巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，或通過抑制caspase-3 激活和表達(dá)抑制HIV-1復(fù)制［4，21］。

本研究通過對(duì)75例未治療HIV患者血漿IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 水平進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)患者HIV-1 RNA 或HIV-1 DNA 水平進(jìn)行分組，比較組間各IL 水平，結(jié)果表明除病毒學(xué)指標(biāo)有差異外，組間患者一般情況及免疫學(xué)指標(biāo)，如CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），患者免疫學(xué)背景相似。相對(duì)于低病毒載量患者，高病毒載量患者血漿IL-10 和IL-18 表達(dá)升高，IL-1β、IL-6和IL-16表達(dá)降低，而兩組間IL-8表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析也表明IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)與病毒載量相關(guān)，與既往研究提出的IL與HIV-1感染程度相關(guān)的結(jié)論一致［2-7］。此外，高HIV-1 DNA 患者血漿IL-10 和IL-18表達(dá)高于低HIV-1 DNA患者，IL-6和IL-16表達(dá)則低于低HIV-1 DNA 患者，而IL-1β 和IL-8 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析結(jié)果也表明IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)與HIV-1 DNA 相關(guān)。由 于HIV-1 DNA 被認(rèn)為是衡量患者病毒儲(chǔ)存庫(kù)大小的重要指標(biāo)，因此本研究認(rèn)為IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達(dá)不僅與病毒載量有關(guān)，還可能與病毒儲(chǔ)存庫(kù)規(guī)模有關(guān)。由此可知，IL在HIV-1感染中扮演重要角色，是否有其他IL亞族因子也與HIV-1病毒儲(chǔ)存庫(kù)規(guī)模相關(guān)，以及這些趨化因子可能影響病毒儲(chǔ)存庫(kù)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。