卟啉調(diào)控生物還原亞硒酸鹽及合成硒納米顆粒

趙 蕊，宋圓圓，郭建博，何 月

（天津城建大學(xué)a.環(huán)境與市政工程學(xué)院；b.天津市水質(zhì)科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，天津 300384）

隨著科技、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和進(jìn)步，硒已廣泛應(yīng)用于石油煉制、電子及光電產(chǎn)業(yè)、化石燃料燃燒等各種工業(yè)活動，如今人為將其排放到環(huán)境中已造成環(huán)境污染問題[1].大量含硒工業(yè)廢水、廢渣及廢氣排放到當(dāng)?shù)丨h(huán)境中造成硒污染[2]，特別是地下水受到硒污染的威脅，若長期處于含高濃度硒的環(huán)境中，將導(dǎo)致硒中毒[3].硒的含氧陰離子（Se（VI）、Se（IV））和硒化物（Se（-II））都是有毒物質(zhì)，其中亞硒酸鹽Se（IV）易溶于水，流動性大，毒性更強(qiáng)，是硒污染的重點研究對象.相比較物理、化學(xué)的去除方法，微生物修復(fù)法具有操作方便、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、自分泌催化劑、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點[4]，具有較大的發(fā)展前景，是目前處理含亞硒酸鹽廢水的一種較好的方法.此外，利用微生物可以將亞硒酸鹽還原為硒納米顆粒（SeNPs）排出胞外并進(jìn)行硒資源回收.但由于生物還原法電子傳遞效率較低，極大地限制了亞硒酸鹽廢水生物處理的性能[5-6].因此，提高電子傳遞效率達(dá)到更好的亞硒酸鹽廢水生物處理性能至關(guān)重要.近年來，卟啉由于其良好的電子傳遞特性被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境污染物處理領(lǐng)域[7-8].卟啉在生物體中可作為多種酶的活性輔基，在電子傳遞過程中起著重要的作用. 但以前的研究主要應(yīng)用于環(huán)境污染物的化學(xué)催化，在環(huán)境的生物修復(fù)方面的研究和應(yīng)用較少[9-10]，并且關(guān)于卟啉對生物合成SeNPs 的性能影響仍不清楚.

此外，希瓦氏菌（Shewanella Oneidensis·MR-1）是研究最廣泛深入的異化金屬還原菌[11].其所具有的電子傳遞能力、靈活的代謝能力以及對重金屬離子毒性的高耐受力等特性，使其在生物能源利用以及污染物生物修復(fù)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力，并受到廣泛關(guān)注[4，12].本研究針對生物法還原亞硒酸鹽電子傳遞效率低的問題，開展卟啉調(diào)控亞硒酸鹽生物還原研究.利用模型卟啉——四磺酸苯基卟啉（TPPS），采用單因素分析法探討不同環(huán)境因素對TPPS 調(diào)控亞硒酸鹽生物還原的性能影響（投加濃度、溫度、pH、碳源等）；并探討對SeNPs 合成的影響，擬構(gòu)建TPPS 調(diào)控亞硒酸鹽高效生物還原系統(tǒng)，為環(huán)境中硒污染的微生物修復(fù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

希瓦氏菌（Shewanella Oneidensis·MR-1）由中國海洋微生物菌種保藏管理中心（MCCC）購買（菌種保藏編號1A01706）.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨（10）、酵母粉（5）、NaCl（10）、pH 為7.0（±0.02）.無機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）：NaCl（5.850）、（4-（2-羥基哌啶基）哌嗪-1-二甲磺酸）HEPES 鈉鹽（11.910）、NH4Cl（1.498）、KCl（0.097）、NaH2PO4·2H2O（0.670）. 微量元素組成[13]（g·L-1）：MgSO4·7H2O（30）、氨三乙酸（1.5）MnSO4·H2O（5）、NaCl（10）、FeSO4·7H2O（1）、CaCl2·2H2O（1）、CoCl2·6H2O（1）、ZnCl2（1.3）、CuSO4·5H2O（0.1）、AlK（SO4）2·12H2O（0.1）、H3BO3（0.1）、Na2MoO4·2H2O（0.25）、NiCl2·6H2O（0.25）、Na2WO4·2H2O（0.25）. 微量元素濃度為1 mL·L-1.培養(yǎng)基中的碳源為乳酸鈉（20 mmol-1），pH 控制為8.0（±0.02）.LB 培養(yǎng)基用于希瓦氏菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，無機(jī)鹽培養(yǎng)基用于亞硒酸鹽生物還原.實驗中將擴(kuò)大培養(yǎng)后的希瓦氏菌接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基并控制OD600=1.2±0.1.

1.1.3 實驗試劑

亞硒酸鹽及配置培養(yǎng)基的藥品均購自于北京奧博星生物技術(shù)有限公司，TPPS 購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，呼吸抑制劑均購自美國Sigma 化學(xué)試劑公司，所有藥品均為分析級.

1.2 實驗方法

本研究用Na2SeO3配制儲備液，保證體系中亞硒酸鹽初始濃度為0.5 mmol·L-1. 無特殊說明情況下，TPPS 的濃度為0.2 mmol·L-1. 對照組為希瓦氏菌+亞硒酸鹽、實驗組為TPPS+希瓦氏菌+亞硒酸鹽.所有實驗均用N2吹脫3 次，設(shè)有3 組平行對照，結(jié)果取平均值. 亞硒酸鹽含量檢測采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS（安捷倫7700e 美國）測定.SeNPs 表面的zeta電位及粒徑利用zeta 電位儀進(jìn)行測定.樣品前處理步驟：首先用無菌注射器從血清瓶中取50 mL 樣品并將其進(jìn)行離心處理（10 000 r·min-1，10 min），離心后的樣品留沉淀待用；用0.9%的NaCl 溶液將沉淀沖洗2 次（10 000 r·min-1，10 min）；將沖洗后的沉淀重新懸浮于50 mM·L-1的Tris/Hcl 緩沖溶液中（pH 為8.0），利用細(xì)胞破碎儀對樣品進(jìn)行細(xì)胞破碎（4 min，功率32%）；將破碎后的樣品進(jìn)行離心（10 000 r·min-1，30 min），留上清液后，再次將上清液進(jìn)行離心（20 000 r·min-1，30 min）并收集沉淀；將沉淀的SeNPs 重新懸浮于超純水中并配制不同的pH；最后進(jìn)行SeNPs 表面的zeta 電位以及粒徑分析.同時將處理后的SeNPs 進(jìn)行冷凍干燥，用研缽研磨至粉末狀后可進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度TPPS 對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響

設(shè)置pH 為8.0，溫度為35 ℃，亞硒酸鹽的初始濃度為0.5 mmol·L-1，分別測定TPPS 在10，5，100，200，300 μmol·L-1的條件下，希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的加速效果（見圖1）.在實驗過程中可觀察到血清瓶中有不同程度上的紅色Se（0）納米顆粒沉淀生成，表明不同濃度TPPS 對亞硒酸鹽加速效果不同.24 h 所對應(yīng)的亞硒酸鹽還原速率分別為1.322，1.554，1.621，1.622，1.619 mg·L-1，對應(yīng)的去除率分別為80.3%，94.4%，98.5%，98.5%，98.4%.當(dāng)TPPS 濃度逐漸增大，亞硒酸鹽的生物還原速率會隨之升高，當(dāng)TPPS 濃度接近飽和時，亞硒酸鹽的生物還原速率逐漸趨于穩(wěn)定，表明TPPS 在所選濃度范圍內(nèi)不會對希瓦氏菌的生長起抑制作用. 當(dāng)TPPS 濃度大于200 μmol·L-1時，希瓦氏菌對亞硒酸鹽的生物還原速率趨于穩(wěn)定，所以TPPS的最佳投加濃度為200 μmol·L-1，在后續(xù)考察其他影響因素對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響時，都選用200 μmol·L-1TPPS.

理論表明，氧化還原介體的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原點位（E0’）位于電子供體和受體之間，這一過程的亞硒酸鹽還原酶及其輔因子的理論（E0’）在NADH/NAD+（E0’=-0.32 V vs.SHE）到Se（IV）/Se（0）（E0’=+0.41 V vs.SHE）的范圍內(nèi).TPPS 與c 型細(xì)胞色素的輔因子亞鐵血紅素具有相同的卟啉母體結(jié)構(gòu)，因此具有相似的介導(dǎo)電子傳遞的電化學(xué)特性[14-15].具體來說，（E0’TPPS=-0.81 Vvs.SCE）或（E0’TPPS= -0.09 Vvs. SHE）介 于E0’（NADH/NAD+）和E0’（Se（IV）/Se（0））之間[16-17]，這表明TPPS 可以作為亞硒酸鹽生物還原的氧化還原介體，顯著提高了亞硒酸鹽生物還原的介導(dǎo)電子傳遞效率.

圖1 不同濃度TPPS 對生物還原亞硒酸鹽的性能及速率影響

2.2 不同pH 對TPPS 調(diào)控希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響

設(shè)置溫度為35 ℃，亞硒酸鹽的初始濃度為0.5 mmol·L-1，TPPS 投加濃度為200 μmol·L-1，實驗考察了不同初始pH 的條件下，TPPS 對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的生物還原效果，實驗結(jié)果如圖2 所示.

圖2 不同pH 對生物還原亞硒酸鹽濃度及還原速率的影響

該菌在生物還原亞硒酸鹽的過程中受pH 的影響較大. 當(dāng)初始pH 分別為6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 時，在36 h 所對應(yīng)的去除率分別為45.1%，68.5%，97.3%，86.1%，10.0%.在pH＜7.0 和pH＞8.0，即環(huán)境過于酸性或過于堿性的條件下，亞硒酸鹽的生物還原速率較低，這表明希瓦氏菌生物還原亞硒酸鹽的反應(yīng)受到了抑制，主要是因為過酸和過堿的環(huán)境對微生物的生長不利，使希瓦氏菌的生長受到了抑制.當(dāng)pH 為10.0時，其生物還原速率明顯低于pH 為6.0 時的還原速率，表明過于堿性的環(huán)境對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的抑制作用更大.由圖2 可知，在pH 為8.0~9.0 的條件下，亞硒酸鹽的生物還原速率較大，表明希瓦氏菌更適于在弱堿性的環(huán)境生長.在pH 為8.0 時，亞硒酸鹽的去除效果最好，因此可以確定希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的最適pH 為8.0 左右.在后續(xù)實驗考察其他影響因素對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響效果時設(shè)置pH 為8.0.

2.3 溫度對TPPS 調(diào)控希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響

設(shè)置pH 為8.0，TPPS 投加濃度為200 μmol·L-1，亞硒酸鹽的初始濃度為0.5 mmol·L-1，實驗考察了不同溫度對TPPS 調(diào)控生物還原亞硒酸鹽的影響，實驗設(shè)置在5，25，35，45，55 ℃的條件下，TPPS 調(diào)控希瓦氏菌生物還原亞硒酸鹽的效果，結(jié)果如圖3 所示.

圖3 不同溫度對TPPS 調(diào)控希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響

在溫度為5~55 ℃時，對應(yīng)的亞硒酸鹽去除率分別為20%，26%，99%，75%，30%. 當(dāng)溫度為5 ℃和55 ℃時，可以看出希瓦氏菌對亞硒酸鹽還原速率明顯降低，這是因為在過高或過低的溫度條件下，雖然加入了和微生物菌體細(xì)胞內(nèi)c 型細(xì)胞色素具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)和電子傳遞特性的TPPS，但在極端溫度環(huán)境條件下微生物體內(nèi)的酶活性極低，從而影響了希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的還原性能.在5~35 ℃條件下，希瓦氏菌對亞硒酸鹽的還原性能逐漸升高，這是因為隨溫度升高，希瓦氏菌體內(nèi)的酶活性升高，使生物還原過程的活化能降低.在35~55 ℃條件下，隨溫度升高，微生物體內(nèi)的酶活性逐漸降低，甚至失活，導(dǎo)致微生物的生長受到了抑制.結(jié)果表明，在12 h，溫度35 ℃左右時，亞硒酸鹽去除率最高.希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的最適溫度在35 ℃左右.在后續(xù)實驗考察其他影響因素對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響效果時設(shè)置溫度為35 ℃左右.

2.4 不同碳源對TPPS 調(diào)控希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響

設(shè)置pH 為8.0，溫度35 ℃，TPPS 投加濃度為200 μmol·L-1，亞硒酸鹽的初始濃度為0.5 mmol·L-1.實驗考察了分別投加乳酸鈉、乙酸鈉、草酸鈉和可溶性淀粉四種不同的碳源（20 mmol·L-1）.TPPS 對希瓦氏菌生物還原亞硒酸鹽的性能影響如圖4 所示.

圖4 不同碳源對TPPS 調(diào)控希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的影響

其中乙酸鈉為外加碳源時，希瓦氏菌對亞硒酸鹽無還原能力，表明希瓦氏菌不能利用乙酸鈉作為碳源對亞硒酸鹽進(jìn)行生物還原.在8 h 時，當(dāng)投加乳酸鈉，草酸鈉和可溶性淀粉這三種外加碳源時，對應(yīng)亞硒酸鹽的還原效率為100%，20%，72.5%.因此，希瓦氏菌生物還原亞硒酸鹽的最佳碳源是乳酸鈉.

2.5 TPPS 對SeNPs 合成尺寸的影響

為了考察TPPS 對生物合成SeNPs 粒徑的影響，控制初始TPPS 濃度為200 μmol·L-1，溫度為35℃，pH 為8.0，構(gòu)建對照組、實驗組生物還原體系進(jìn)行探究，并對這兩個生物還原體系中合成的SeNPs 的粒徑進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖5 所示.

圖5 SeNPs 粒徑分析

由圖5 可知，24 h 還原反應(yīng)后，對照組和實驗組合成的SeNPs 的平均粒徑分別為120 nm 和655 nm左右.這表明TPPS 在調(diào)控亞硒酸鹽生物還原速率的同時也會影響合成SeNPs 的粒徑大小和分布. 24 h后，TPPS 調(diào)控SeNPs 的平均粒徑變大，這與在24 h 內(nèi)TPPS 可以加速亞硒酸鹽還原的結(jié)果一致. 在24~84 h期間，對照組和實驗組合成的SeNPs 的平均粒徑分別為650 nm 和446 nm 左右，表明TPPS 可以調(diào)控SeNPs的粒徑令其更小、更均勻.這就為人工調(diào)控合成納米顆粒的尺寸提供了新的思路，即通過在生物合成體系投加不同種類介體或通過控制培養(yǎng)時間來進(jìn)一步調(diào)控合成SeNPs 的尺寸.此前，Brown 等[18]發(fā)現(xiàn)一類胞外蛋白可以控制Au 納米顆粒的形狀尺寸，由此可以推斷，TPPS 的加入可能影響了亞硒酸鹽生物還原體系中微生物的胞外分泌物EPS，進(jìn)而改變了SeNPs 表面的有機(jī)包覆層的成分從而間接導(dǎo)致SeNPs 粒徑的不同.納米材料的性能取決于它們的形狀尺寸，從而表現(xiàn)出不同的光電特性[19].因此，模型卟啉類物質(zhì)TPPS 具有用于人工合成具有獨特光電特性的SeNPs 的應(yīng)用潛能.

目前，多數(shù)研究表明納米顆粒的生長機(jī)理可以用奧斯特瓦爾德熟化機(jī)制（Ostwald ripening）來描述.該過程致使大顆粒的生長依賴于小顆粒溶解并重新沉積在大顆粒上的過程稱為奧斯瓦爾德熟化機(jī)制. 由此推測TPPS 調(diào)控的SeNPs 形成的機(jī)理可能為TPPS 通過影響SeNPs 表面有機(jī)包覆層的含量和組成，特別是對有機(jī)包覆層中蛋白質(zhì)組分的影響，導(dǎo)致顆粒粒徑和顆粒間靜電力發(fā)生變化[20].故詳細(xì)地了解此過程和該過程中的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步更加深入的研究. 只有充分掌握生物合成納米顆粒的形成和生長機(jī)制，才能更好地利用TPPS 控制納米材料的尺寸和形態(tài)，滿足所需的性能要求.

2.6 TPPS 對SeNPs 表面靜電斥力及表面有機(jī)包覆層的影響

TPPS 對SeNPs 表面靜電斥力及表面有機(jī)包覆層的影響如圖6 所示.由圖6a 可知，84 h 后，當(dāng)pH 值的范圍為6.0~10.0 時，對照組和加入了TPPS 的實驗組合成的SeNPs 表面的zeta 電位值均為負(fù)值. 當(dāng)pH 值的范圍為6.0~10.0 時，對照組的zeta 電位值分別為-0.1，-4.2，-7.8，-10.2，-12.8 mV；相同pH 條件下，加入了TPPS 的實驗組合成的SeNPs 表面的zeta 電位值分別為-10.3，-11.9，-11.8，-13.9，-14 mV. 由此可得，加入了TPPS 可使合成的SeNPs 表面zeta 電位值更低.類似的結(jié)果也出現(xiàn)在Russ 等[21]的研究中，他們發(fā)現(xiàn)生物合成的SeNPs 表面包覆有一層有機(jī)物質(zhì)，且這種有機(jī)物質(zhì)可以增加SeNPs 表面的靜電斥力，從而使SeNPs 達(dá)到更加穩(wěn)定的分散狀態(tài). 為了進(jìn)一步分析這種有機(jī)包覆層的成分，分別對對照組和實驗組的SeNPs 進(jìn)行了傅里葉紅外光譜分析. 如圖6b 所示，兩個亞硒酸鹽生物還原系統(tǒng)中的SeNPs 的傅里葉紅外光譜顯示1 200 cm-1處代表P=O 伸縮[22]，1 038 cm-1和1 050 cm-1代表C—O—C 變形. 峰值1 630 cm-1代表—C=O 拉伸峰值，峰值2 943 cm-1表示H—C—H伸展[23].這些官能團(tuán)的存在表示該有機(jī)包覆層中含有碳水化合物[24]，這證明了合成的SeNPs 表面由C、H、O 組成的有機(jī)包覆層的存在.同時，在1 552 cm-1和3 288 cm-1處的峰是氨基化合物的特征峰，這表明了有機(jī)包覆層中存在大量的蛋白質(zhì)[25]，且TPPS 加入使這幾種化合物的特征峰值增大，含量增多，這種蛋白極有可能是催化亞硒酸鹽生物還原并調(diào)控SeNPs 生物合成的某些胞外酶.

圖6 SeNPs 表面靜電斥力及包覆層特性

3 結(jié) 論

（1）卟啉TPPS 可以作為氧化還原介體對希瓦氏菌還原亞硒酸鹽有加速作用.TPPS 調(diào)控亞硒酸鹽的生物還原速率受到pH、溫度、碳源種類的影響.TPPS 加速希瓦氏菌對亞硒酸鹽的還原的最佳條件為：TPPS 投加濃度為200 μmol·L-1、pH 為8.0，溫度為35 ℃，碳源為乳酸鈉.

（2）TPPS 通過影響SeNPs 表面有機(jī)包覆層的蛋白質(zhì)組分使顆粒粒徑和顆粒間靜電力發(fā)生變化. 加入TPPS 的生物還原體系中合成的SeNPs 表面的zeta 電位更低，粒徑更小更均勻，顆粒分散更穩(wěn)定.