基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討人參皂苷Rg1對慢性粒細胞白血病的作用機制

周雯，周玥，李淵，韓艷軍，劉小虎

（云南大理大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，云南大理 671000）

慢性髓系白血?。–hronic myeloid leukemia，CML）是一種多能造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的克隆性骨髓增生性疾病。CML的特征是存在BCR-ABL1融合基因，該基因編碼一個組成型活性酪氨酸激酶，能夠啟動和維持疾病的致病驅(qū)動因子。致使大量下游信號通路激活，從而促進了遺傳不穩(wěn)定的髓樣細胞的不受控制地擴增[1]，最終危及生命。目前主要采用伊馬替尼等酪氨酸激酶活性抑制劑（TKIs）靶向治療，盡管效果顯著，但部分患者原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥、長期器官毒性等不良反應(yīng)的出現(xiàn)限制了TKIs的臨床應(yīng)用[2]。

中藥在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中由于安全、毒副作用小，對肝腎刺激性較弱占據(jù)了重要的地位，在多部位、多靶點疾病的總體調(diào)控方面具有突出的優(yōu)勢。人參皂苷Rg1是三七和人參的主要活性成分，具有多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。人參皂苷Rg1可改善腸道炎癥、血管生成和放射誘導(dǎo)的腸損傷[4]。Rg1可通過激活SIRT1/TSC2信號通路抑制急性髓樣白血病的細胞增殖并誘導(dǎo)其衰老[5]。此外，還有抗肝纖維化、抗腫瘤、延緩衰老、改善心血管系統(tǒng)代謝等功能[6]。Rg1的抗腫瘤也多有報道，但涉及CML的較少，其作用機制并不清楚，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究Rg1作用于K562的靶點，為臨床研究提供新的思路。

一、研究方法

（一）人參皂苷Rg1作用靶點的預(yù)測

使用PubChem數(shù)據(jù)庫檢索“ginsenoside Rg1”，并保存其sdf格式文件。將Rg1的sdf格式文件導(dǎo)入PharmMapper平臺[7]。設(shè)置最大生成構(gòu)象為300，人類蛋白作為藥效基團，預(yù)測人參皂苷Rg1的潛在靶點，利 用Uniprot數(shù) 據(jù) 庫 (https：//www.uniprot.org/)的Retrieve/ID mapping 功能將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標準基因名稱。刪除重復(fù)基因，最終得到人參皂苷Rg1活性成分的作用靶點。

（二）人參皂苷Rg1和CML的交集靶點及互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“chronic myeloid leukemia”為關(guān)鍵 詞 在GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫中檢索，檢索結(jié)果以“相關(guān)分數(shù)”進行取值，根據(jù)中位數(shù)篩選出合適的基因數(shù)量進行后續(xù)分析。與人參皂苷Rg1作用靶點通過Excel取交集，即為人參皂苷Rg1作用于CML的靶點。利用微生信網(wǎng)站繪制出化合物—疾病靶標的韋恩圖。

（三）構(gòu)建化合物—疾病蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)

將共同靶點導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫，選擇研究物種為“智人”，最低相互作用域值設(shè)為highest confidence≥0.4，隱藏游離靶點，獲得靶點聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖，保存csv格式文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

（四）化合物—疾病之間分子對接驗證

利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫查找MAPK1(ERK)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，將Rg1的Mol2結(jié)構(gòu)式與蛋白晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock vina、Pymol軟件中，檢測疾病靶蛋白與小分子化合物之間結(jié)合能力。

（五）Western blotting檢測p-ERK蛋白的表達

取2×106個K562放 入 培 養(yǎng)瓶，加入500μL 20μmol/L的Rg1，總液體體積為5mL Rg1濃度、時間篩選參考本課題組以往研究結(jié)果[8]。提取各組細胞總蛋白，測定總蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入p-ERK一抗4℃過夜，TBST緩沖液漂洗2次，加入二抗，室溫反應(yīng)2h，ECL增強發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

二、結(jié)果

（一）Rg1作用于CML的蛋白靶點

在PharmMapper數(shù)據(jù)庫得到299個人參皂苷Rg1的作用靶點，將靶點去重后，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因名稱轉(zhuǎn)換后、剔除重復(fù)基因、無效基因名得到290個有效靶點。

（二）CML相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及交集靶點的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到4560個CML的疾病相關(guān)靶點，根據(jù)“相關(guān)性得分”的中位數(shù)進行篩選，經(jīng)三次取中位數(shù)后，最終將1141個靶基因納入考慮范圍。取人參皂苷Rg1和CML的靶點交集共得到93個疾病靶點，制韋恩圖，見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1于CML相關(guān)靶點韋恩圖

（三）人參皂苷Rg1作用于CML的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

人參皂苷Rg1與CML的蛋白互做分析，見表1、圖2。該網(wǎng)絡(luò)共包含93個節(jié)點，333條邊，平均節(jié)點度值為7.16，平均局部聚類系數(shù)為0.476。節(jié)點面積越大，顏色越亮代表度值越大。度值表示該靶點與其他靶點的關(guān)聯(lián)個數(shù)，度值越大表明該靶點與其他作用靶點聯(lián)系越緊密，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。該93個共同靶點是Rg1作用于疾病的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。其中SRC（癌基因酪氨酸蛋白激酶），MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），PIK3R1（磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基α），GRB2（生長因子受體結(jié)合蛋白2），HRAS（GTPase HRas），PTPN11（酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11型），LCK（酪氨酸蛋白激酶），MAPK8（裂原激活的蛋白激酶8），IGF1（胰島素樣生長因子I）等度值排行前10的靶點均可與17個及以上靶點相互聯(lián)系，提示這些靶點在治療方面的重要性。

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表 1 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的拓撲學(xué)分析（前20位）

（四）分子對接結(jié)果

人參皂苷Rg1與MAPK1（ERK）進行對接，結(jié)合能為-7KJ/mol，一般認為配體與受體的結(jié)合能越低，其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生的作用可能性越大。結(jié)合能小于0KJ·mol-1說明受體和配體可自發(fā)結(jié)合。見圖3。

圖3 分子對接

（五）Rg1對562細胞p-ERK相對蛋白表達量的影響

與對照組相比，Rg1組p-ERK蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 Rg1對562細胞p-ERK蛋白表達量的影響與對照組相比（P＜0.01）

三、討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探討了人參皂苷Rg1對CML的潛在作用機制。推測可能通過SRC、MAPK1、PIK3R1、GRB2、HRAS、PTPN11等度值排名較高的靶蛋白發(fā)揮治療CML的作用。

SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）是非受體蛋白酪氨酸激酶，在腫瘤的遷移中起到重要重用[9]。粘著斑（FAs）的周期性形成和分解是腫瘤細胞遷移的基礎(chǔ)。SRC已被證實為CML中的治療靶點[10]。因此我們選擇MAPK1（ERK）進行研究，MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞骨架重排來介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，例如細胞生長、粘附、轉(zhuǎn)移和分化。李剛等研究表明，TUG-1可通過miR-370-3p/MAPK1/ERK信號通路，促進AML（急性髓樣白血?。┘毎倪w移和侵襲能力[11]。分子對接后證明Rg1能與此靶點蛋白自發(fā)結(jié)合。本課題組證明Rg1作用于K562細胞后能抑制其增殖，但具體機制尚不完全清楚，本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)后找出潛在靶點進行實驗，western blotting結(jié)果顯示，Rg1組p-ERK的表達明顯降低，提示Rg1可以通過抑制p-ERK起到抗腫瘤的作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究人參皂苷Rg1通過多靶點和多通路作用于白血病的分子機制。除了已知的靶點和通路，還挖掘出潛在的作用靶點，為后續(xù)的實驗提供了理論依據(jù)。