分子標(biāo)記輔助選擇高油酸花生品種冀農(nóng)花10 號的選育

侯名語 李 麗 崔順立 李文平 劉盈茹 李秀坤 劉立峰

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071001；2 河北工程大學(xué)，邯鄲 056038；3 河北省保定市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，保定 071001）

花生是我國重要的油料作物[1]，花生籽仁中含有50%左右的脂肪，花生脂肪酸中主要含有棕?cái)R酸（Palmitic acid，C16∶0）、硬脂酸（Stearic acid，C18∶0）、油酸（Oleic acid，C18∶1）、亞油酸（Linoleic acid，C18∶2）、花生酸（Arachidic acid，C20∶0）、花生烯酸（Cis-11-Eicosenoicacid，C20∶1）、山崳酸（Docosanoic acid，C22∶0）和二十四碳烷酸（Lignoceric acid，C24∶0）等8 種主要脂肪酸。其中油酸含量是評價(jià)花生油質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。油酸的分子式為C18H34O2，為單不飽和脂肪酸，其含量高低影響花生制品的風(fēng)味及貨架期。在膳食營養(yǎng)中，油酸具有調(diào)節(jié)人體脂質(zhì)代謝、改善心血管疾病、消炎等保健功能[2-4]。提高花生中的油酸含量已成為花生育種的重要任務(wù)。

亞油酸也是十八碳烯脂肪酸，油酸脫飽和生成亞油酸，兩者的比例（油亞比）也是衡量高油酸花生種質(zhì)的重要指標(biāo)。Δ12脂肪酸脫氫酶（FAD，F(xiàn)atty acid desaturase）是油酸生成亞油酸的關(guān)鍵酶。相對于普通花生，在高油酸花生基因型中，ahFAD2A和ahFAD2B序列具有點(diǎn)突變或插入突變[2，4]。根據(jù)突變序列，已開發(fā)了CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence）和AS-PCR（Allele-specific PCR）標(biāo)記[4]，并已廣泛應(yīng)用于高油酸花生育種研究中。本研究選用在ahFAD2A和ahFAD2B序列具有點(diǎn)突變的花生種質(zhì)GYS01 作為親本，與高產(chǎn)廣適品種海花1 號雜交，在后代選育中采用AS-PCR 標(biāo)記結(jié)合近紅外分析儀檢測技術(shù)，選育出冀農(nóng)花10 號高油酸品種。

1 親本來源及選育過程

1.1 親本來源父本材料為GYS01，是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究所高油酸種質(zhì)，具有油酸含量高、抗逆性強(qiáng)、株型匍匐等特征特性，油酸含量80.07%，亞油酸含量3.53%，油亞比22.68。母本材料為?；? 號（圖1），是由山東省花生研究所和山東省海陽縣農(nóng)業(yè)局聯(lián)合培育的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)大果花生品種，油酸含量41.75%，亞油酸含量36.82%，油亞比1.13，直立型，在我國黃淮海流域廣泛種植。

圖1 母本?；? 號系譜圖

在ahFAD2A/ahFAD2B基因序列中，GYS01含有與高油酸突變體F435 相同的突變位點(diǎn)，即ahFAD2A（OL1）在起始密碼子后第448 位點(diǎn)處GYS01 為A，?；? 號為野生型G（圖2a）；GYS01的ahFAD2B（OL2）在起始密碼子后第442 處插入A，?；? 號無此插入（圖2b）。

圖2 兩親本的ahFAD 差異序列比對

1.2 選育過程2009 年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場花生雜交圃種植父本GYS01 和母本?；? 號，進(jìn)行雜交，獲得F1雜交種。2009 年11 月在海南三亞種植F1雜交種。取幼苗葉片提取基因組DNA，利用AS-PCR 反應(yīng)檢測基因型是否為OL1ol1/OL2ol2，以鑒定真假雜交種。2010 年3 月收獲F2種子。2010年5 月在保定農(nóng)研所試驗(yàn)田種植F2種子，9 月收獲得到F3種子。2010 年11 月在海南三亞加代。2011年3 月獲得衍生系統(tǒng)F4種子；5 月在保定農(nóng)研所試驗(yàn)地種植F4，進(jìn)行測產(chǎn)評價(jià)，淘汰不良衍生系，獲得F5系統(tǒng)種子；11 月在海南三亞加代。2012 年3 月得到F6種子，同年對每個(gè)入選的衍生系統(tǒng)F6大量選擇單株，獲得F7種子；年底在三亞將每個(gè)單株種成株系，按衍生系統(tǒng)混合獲得冀農(nóng)G32。從F2～F6，每代在幼苗期取樣提取基因組DNA 進(jìn)行AS-PCR檢測，收獲的種子用近紅外光譜模型檢驗(yàn)油酸含量，根據(jù)檢測結(jié)果，保留ol1ol1與ol2ol2基因型及油酸含量>45%的株系。F6種植時(shí)，以冀花2 號作為產(chǎn)量對照，進(jìn)行植株性狀、產(chǎn)量性狀的鑒定。在產(chǎn)量和高油酸雙重壓力下，保留高產(chǎn)高油酸花生新材料。2013 年在清苑、深州、新樂等地進(jìn)行品系比較試驗(yàn)，平均莢果產(chǎn)量329.8kg/667m2，比對照冀花2 號增產(chǎn)9.0%。2014 年在清苑、深州、新樂等地進(jìn)行品系比較試驗(yàn)，平均莢果產(chǎn)量373.5kg/667m2，比對照冀花2號增產(chǎn)7.3%。2015 年參加了高油酸品系鑒定試驗(yàn)，比冀花2 號增產(chǎn)顯著。2018 年提交農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非主要農(nóng)作物品種登記，登記編號為GPD 花生（2018）130264，命名為冀農(nóng)花10 號。

1.3 AS-PCR 法檢測ahFAD2A 和ahFAD2B 基因型基因組DNA 的提取采用CTAB 法。檢測ahFAD2A/ahFAD2B的引物序列及基因型判定見表1 和表2，PCR 條件參照李麗等[4]。通過不同的引物組合組成4 個(gè)AS-PCR 反應(yīng)（表2），以檢測ahFAD2A的野生型OL1和突變型ol1，ahFAD2B的野生型OL2和突變型ol2。根據(jù)電泳結(jié)果的帶型判斷基因型，GYS01 的ahFAD2A和ahFAD2B的基因型為ol1ol1ol2ol2（圖3a），?；? 號的基因型為OL1OL1OL2OL2（圖3c），在后代選擇中，為保證高油酸，選擇與GYS01 的檢測結(jié)果相同的帶型（圖3a）。經(jīng)檢測，冀農(nóng)花10 號的ahFAD2A和ahFAD2B為ol1ol1ol2ol2高油酸突變基因型（圖3b）。

圖3 OL1OL1OL2OL2 和ol1ol1ol2ol2 基因型電泳圖譜

表1 鑒定高油酸基因型AS-PCR 反應(yīng)所用引物

表2 ahFAD2A/ahFAD2B 基因型鑒定標(biāo)準(zhǔn)

2 品種特征特性

2.1 植物學(xué)特性2017-2018 年連續(xù)進(jìn)行2 年調(diào)查，冀農(nóng)花10 號的植物學(xué)特征為:連續(xù)開花、疏枝、直立，葉片綠色、長橢圓，主莖高62.3cm、側(cè)枝長73.7cm、總分枝數(shù)9 個(gè)、結(jié)果枝數(shù)7 個(gè)、單株飽果數(shù)12.9 個(gè)。莢果普通形、縮縊較淺，果嘴鈍，百果重168.3g。籽仁球形，種皮淺紅色，百仁重66.3g，出仁率72.3%，生育期121d。

2.2 品質(zhì)與抗病性經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心檢測，含油率51.0%，蛋白質(zhì)23.4%，油酸79.0%，亞油酸4.4%，油亞比17.9。2017年和2018 年種植期間進(jìn)行田間調(diào)查，冀農(nóng)花10 號抗葉斑病，耐病毒病，抗旱性、耐澇性強(qiáng)。

3 產(chǎn)量表現(xiàn)

2018 年參加高油酸品種鑒定試驗(yàn)，莢果產(chǎn)量369.2kg/667m2，比對照冀花4 號增產(chǎn)5.08%。2019年新樂市邯邰村高產(chǎn)示范田冀農(nóng)花10 號莢果產(chǎn)量高達(dá)478.7kg/667m2。2020 年在深州得朝村高產(chǎn)示范田冀農(nóng)花10 號莢果產(chǎn)量高達(dá)482.6kg/667m2。

4 栽培措施

冀農(nóng)花10 號適宜在河北省春播地覆膜或露地種植。春播地膜覆蓋播期在4 月20 日至5 月5 日，露地種植播期在5 月5-15 日。種植密度1.0 萬～1.2 萬穴/667m2，每穴2 粒。生長過程中主要病蟲害防治對象是根莖腐病和蠐螬、薊馬等。