本土釀酒酵母發(fā)酵進程中異戊醇的合成代謝

王 倩，馮文倩，王雅楠，宋育陽，劉延琳，秦 義

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院 陜西楊凌 712100）

異戊醇是葡萄酒中高級醇的主體成分，其含量占葡萄酒中高級醇總量的40%以上，閾值為30 mg/L，在葡萄酒中呈現(xiàn)雜醇味、澀味及苦杏仁味[1-4]。葡萄酒中適量的異戊醇不僅使酒體豐滿、口感醇厚，還對葡萄酒香氣的復雜性有積極的貢獻[5-6]；然而，異戊醇含量過高會給葡萄酒帶來溶劑味、指甲油等令人不愉悅的氣味，不僅會損害葡萄酒的風味平衡，還會造成飲用者頭痛、惡心等癥狀[7-8]。在葡萄酒釀造過程中應對異戊醇的生成量進行適當控制。

釀酒酵母的異戊醇代謝途徑包括合成代謝途徑（Harris）和埃里希途徑（Ehrlich）。若異戊醇形成的前體物質α-酮異己酸來源于碳水化合物代謝，則稱為Harris 途徑[9]；若α-酮異己酸是由亮氨酸的轉氨作用形成，之后經(jīng)酮酸脫羧酶催化，由α-酮異己酸脫羧形成異戊醛，再還原形成異戊醇，則稱為Ehrlich 途徑。人們通常認為釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的高級醇，75%來自Harris 途徑，只有25%來自Ehrlich 途徑，且后者對前者具有補充和抑制雙重效果[10-11]。也有研究者認為，大量的支鏈高級醇主要通過Ehrlich 途徑合成，少量的直鏈高級醇是經(jīng)Harris 途徑合成的[12]。葡萄酒中異戊醇的產(chǎn)生與發(fā)酵基質中可同化氮含量和種類、糖含量和補加方式、發(fā)酵溫度、溶氧量等多種發(fā)酵工藝條件有關[13-16]。近年來的研究表明：通過過表達/敲除途徑特異性基因[17]，刪除/增強競爭途徑[18-19]，改善輔因子[20]，在線粒體或細胞質重構代謝途徑[21-24]等，可在一定程度上控制酵母的異戊醇產(chǎn)量；對具有不同遺傳背景的酵母菌株而言，其異戊醇產(chǎn)量可能具有顯著差異，并且在發(fā)酵過程中的不同階段，釀酒酵母的異戊醇產(chǎn)率也有差異。有研究表明發(fā)酵對數(shù)期是異戊醇等高級醇的快速合成時期[25]，而發(fā)酵對數(shù)期內(nèi)異戊醇合成的具體調(diào)控機制尚不清楚。

以本課題組篩選的具有優(yōu)良葡萄酒釀造特性的本土釀酒酵母LFE1225 為研究對象，利用生化分析和轉錄組測序（RNA-Seq）技術，分析釀酒酵母LFE1225 在不同發(fā)酵時期的碳氮源、醇類、有機酸代謝以及轉錄組，揭示本土釀酒酵母LFE1225 在發(fā)酵進程中的異戊醇代謝規(guī)律和調(diào)控機制，為低產(chǎn)/高產(chǎn)異戊醇菌株的定向育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 釀酒酵母LFE1225，西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g（若配置固體培養(yǎng)基，再添加20 g/L 的瓊脂）加蒸餾水定容至1 L，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，滅菌20 min）。

Triple M 模擬葡萄汁[26]（1 L）：儲液Ⅰ：100 g葡萄糖、100 g 果糖和4 mL ergo stock，蒸餾水定容至500 mL；儲液Ⅱ：6 g 酒石酸、3 g 蘋果酸和0.5 g 檸檬酸，蒸餾水定容至250 mL；儲液Ⅲ：1.7 g YNB（酵母基礎氮源）、2 g 水解酪蛋白、6 mg 肌醇、0.2 g 無水氯化鈣、0.8 g L-精氨酸、1 g L-脯氨酸、0.1 g 色氨酸和1 g 磷酸銨，蒸餾水定容至250 mL?；靹騼σ孩?、Ⅱ、Ⅲ，用KOH（4 mol/L）調(diào)pH值為3.25，0.22 μm 濾膜過濾除菌。ergo stock（50 mL）：12.5 mL 吐溫80、37.5 mL 95%乙醇和0.125 g 麥角固醇。

1.2 方法

1.2.1 模擬葡萄汁發(fā)酵 種子液的制備：將經(jīng)過劃平板純化、鏡檢后的菌株接入裝有50 mL 無菌Triple M 模擬汁的100 mL 錐形瓶中，以無菌過濾透氣封口膜封口，于28 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵：取已培養(yǎng)24 h 的種子液，離心收集菌體并懸浮于0.9%的生理鹽水中，在顯微鏡下計數(shù)后以5×105CFU/mL 接入裝有300 mL 無菌Triple M 模擬汁的500 mL 錐形瓶中，以無菌過濾透氣封口膜封口，于25 ℃條件下靜置發(fā)酵。發(fā)酵過程中每24 h 監(jiān)測CO2質量損失并做CO2失重曲線，當CO2質量損失連續(xù)3 d 基本不變時視為發(fā)酵結束。設置3 個生物學平行。根據(jù)CO2失重曲線取發(fā)酵過程中對數(shù)初期（24 h）、對數(shù)中期（72 h）、對數(shù)末期（240 h）及發(fā)酵結束后（504 h）的發(fā)酵液測定殘?zhí)牵―NS 法）[27]、氨態(tài)氮（AMMONIA）、伯胺氮（PAN）、酵母可同化氮（YAN）和亮氨酸、異戊醇及其它代謝物的產(chǎn)量。

1.2.2 異戊醇等高級醇及其它代謝產(chǎn)物的檢測異戊醇等高級醇的檢測采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法。使用DVB/CAR/PDMS 萃取纖維（50/30 μm 涂層厚度，2 cm 可伸縮長度）及SPME57330-U 聯(lián)用手柄（Supelco，Bellefonte PA，USA）。在20 mL 頂空瓶中加入8 mL 酒樣、2.0 g NaCl 和20 μL 2-辛醇（0.016 g/L）以及磁力攪拌子，在40 ℃，600 r/min 條件下平衡15 min后，再用萃取纖維在40 ℃，600 r/min 條件下攪拌吸附30 min 后取出，立即進行手動進樣，在230℃進樣口解析5 min，每個樣品重復2 次。GC-MS所用氣相色譜柱為DB-WAX 極性柱（60 m×0.25 mm×0.25 mm）（Alilent JandW，USA）。不分流進樣，離子源溫度為200 ℃，連接桿溫度220 ℃，進樣口230 ℃，載氣為高純度氦氣（≥99.999%），載氣流速為1.5 mL/min。升溫程序為，40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min 上升至130 ℃，接著4 ℃/min 上升至250 ℃，在250 ℃保持5 min，總運行時間為60 min。離子源為EI 源，離子源電壓為70 eV，質譜掃描范圍25～350 amu，掃描頻率為50 Hz。定性和定量分析參照陶永勝[3]的方法。

采用試劑盒法（北京索萊寶）通過Y15 全自動葡萄酒分析儀檢測甘油，檢測限為0.24～20 g/L。

乙醇的測定參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法。

有機酸的檢測使用Aminex HPX-87H 有機酸分析柱（300 mm×7.8 mm；Bio-Rad；Hercules）。流動相：0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進樣量5 μL，55 ℃柱溫，檢測波長為210 nm。配置質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 g/L 的標準品，經(jīng)過0.22 μm 有機膜過濾后進樣，測定得到相應的峰面積與出峰時間，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。將發(fā)酵液稀釋過濾后進行測定并計算。

1.2.3 AMMONIA、PAN、YAN 及亮氨酸的檢測采用試劑盒法（北京 索萊寶）通過Y15 全自動葡萄酒分析儀檢測AMMONIA 和PAN，AMMONIA的檢測限為3～200 mg/L，PAN 的檢測限為1～400 mg/L。YAN 質量濃度按照試劑盒方法采用公式（1）進行計算。

使用Venusil AA 氨基酸分析方法包按照說明書檢測亮氨酸。

1.2.4 轉錄組測序樣品制備 根據(jù)CO2失重曲線，分別在發(fā)酵的對數(shù)初期（A 時期）、對數(shù)中期（B時期）和對數(shù)末期（C 時期）取發(fā)酵液并離心收集菌體，加入PBS 緩沖液洗滌后，再次離心棄上清，并置于液氮中迅速冷凍。樣品由廣州基迪奧生物科技有限公司進行轉錄組（RNA-seq） 檢測及分析。

1.2.5 轉錄組測序數(shù)據(jù)分析 使用Deseq2 軟件對reads count 進行標準化，根據(jù)模型計算假設檢驗概率（P 值）再進行多重假設檢驗矯正得到錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR 值）。將FDR＜0.05 且不同發(fā)酵時期之間相比|log2FC|＞1 的基因篩選為顯著性差異表達基因。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析以P 值小于0.05 為閾值。趨勢分析參照STEM 軟件，使用log2 標準化對數(shù)據(jù)預處理，將目標基因的變化趨勢按照最具代表性的20 個模塊進行歸類分析。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母LFE1225 的發(fā)酵特征

如圖1所示，從發(fā)酵開始后的第24 小時開始，LFE1225 的CO2失重速率顯著增加，發(fā)酵進入對數(shù)初期，此時發(fā)酵液殘?zhí)菫椋?51.5±3.00）g/L。CO2失重速率在發(fā)酵開始后的第72 小時達到最大值，此時發(fā)酵進入對數(shù)中期，發(fā)酵液殘?zhí)菫椋?04.11±5.29）g/L，此后CO2失重速率開始下降，從第240 小時開始逐漸穩(wěn)定，到達發(fā)酵的對數(shù)末期，此時的殘?zhí)菫椋?1.89±1.99）g/L。發(fā)酵結束后的殘?zhí)菫椋?.73±0.49）g/L。

圖1 釀酒酵母LFE1225 的發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curve of S.cerevisiae LFE1225

2.2 釀酒酵母LEF1225 異戊醇和其它代謝產(chǎn)物的分析

如圖2所示，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中的異戊醇不斷積累，發(fā)酵結束后的異戊醇產(chǎn)量達到了（336.62±4.66）mg/L。異戊醇的合成速率隨發(fā)酵的進行呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，近65%的異戊醇是在發(fā)酵的對數(shù)期生成的，其中，從對數(shù)中期到對數(shù)末期是LFE1225 生成異戊醇的主要時期，此階段生成的異戊醇占發(fā)酵結束后異戊醇總量的44%。

圖2 釀酒酵母LEF1225 不同發(fā)酵階段的異戊醇產(chǎn)量及合成速率Fig.2 The content and synthesis rate of isoamyl alcohol in different fermentation stages of S.cerevisiae LEF1225

釀酒酵母LFE1225 在不同發(fā)酵時期的醇類物質的生成量和合成速率如表1所示，隨著發(fā)酵的進行乙醇、甘油和高級醇在不斷積累，發(fā)酵結束后，乙醇體積分數(shù)為（11.23±0.29）%（V/V），甘油質量濃度為（4.33±0.31）g/L，發(fā)酵液中的高級醇產(chǎn)量為（486.60±8.90）mg/L，以上醇類物質的合成速率均隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)顯著的下降趨勢。以異戊醇合成速率為橫坐標，對乙醇合成速率、甘油合成速率、高級醇合成速率以及糖消耗速率作圖（圖3），發(fā)現(xiàn)異戊醇合成速率與乙醇合成速率、高級醇合成速率以及糖消耗速率具有極高的相關性，而與甘油合成速率相關性不高。

圖3 相關性分析Fig.3 Correlation analysis

表1 釀酒酵母LEF1225 不同發(fā)酵階段的醇類物質產(chǎn)量Table 1 Alcohols content in different fermentation stages of S.cerevisiae LEF1225

釀酒酵母LFE1225 發(fā)酵過程中的各種有機酸的合成與異戊醇的合成之間沒有明顯相關性。有機酸總量隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)先上升后下降的期開始出現(xiàn)，其中琥珀酸和乳酸隨時間呈先上升后下降的趨勢。趨勢，在對數(shù)初期最高。檸檬酸與蘋果酸質量濃度變化趨勢一致先增加后降低，酒石酸則在發(fā)酵初期迅速下降，隨后在對數(shù)末期緩慢回升。丙酮酸、琥珀酸、乳酸及乙酸則為發(fā)酵過程中形成的酸類，丙酮酸在發(fā)酵初期即產(chǎn)生，在對數(shù)中期質量濃度達到最高，琥珀酸、乳酸和乙酸則在發(fā)酵對數(shù)中后

2.3 釀酒酵母LFE1225 不同發(fā)酵階段的氮源代謝

YAN 包括氨態(tài)氮、游離α-氨基氮化合物（脯氨酸除外）和一些小分子多肽，是釀酒酵母正常生長所必須的營養(yǎng)物質[28]，研究表明葡萄汁中YAN含量過高或者不足均會導致發(fā)酵結束后的葡萄酒中高級醇含量增加[29]。試驗所用Triple M 模擬汁的初始YAN 質量濃度為（446.28±14.25）mg/L，其在不同發(fā)酵時期的質量濃度如圖4a 所示。在發(fā)酵起始階段，氮源充足，釀酒酵母大量利用YAN，對數(shù)初期的YAN 質量濃度較初始下降近20%，約100 mg/L，此階段異戊醇合成速率最高，可能與YAN 的消耗有關。在對數(shù)中期，YAN 質量濃度小幅上升，之后趨于穩(wěn)定。對數(shù)中期YAN 質量濃度上升的原因可能為發(fā)酵初始階段YAN 被大量利用導致發(fā)酵基質中氮源相較缺乏，因此釀酒酵母開始合成氨基酸以補充氮源。

表2 釀酒酵母LEF1225 不同發(fā)酵階段的有機酸含量（g/L）Table 2 The content of organic acids in different fermentation stages of S.cerevisiae LEF1225（g/L）

Triple M 模擬汁的初始亮氨酸質量濃度為（287.74±16.07）mg/L（圖4b），進入對數(shù)初期顯著增加，為（390.06±35.46）mg/L，此后發(fā)酵液中的亮氨酸質量濃度呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。與對數(shù)初期相比，對數(shù)中期的亮氨酸質量濃度減少了近63%。發(fā)酵結束后的亮氨酸質量濃度為（2.30±0.13）mg/L。發(fā)酵初始階段亮氨酸質量濃度最高的時候異戊醇的合成速率最大，由此推測該階段只有少量的異戊醇是通過Ehrlich 途徑合成的。

圖4 釀酒酵母LEF1225 不同發(fā)酵階段的氮源消耗情況Fig.4 Consumption of nitrogen in different fermentation stages of S.cerevisiae LEF1225

2.4 不同發(fā)酵階段的釀酒酵母LEF1225 轉錄組測序與分析

利用RNA-seq 對釀酒酵母LEF1225 的3 個發(fā)酵時期（對數(shù)初期A、對數(shù)中期B、對數(shù)末期C）進行轉錄組學測序與分析。測序平均產(chǎn)生21 071 058 條原始reads，通過質控過濾得到clean reads 總計185 388 216，平均數(shù)目為20 598 691，整體質控良好。將過濾后的reads 與rRNA 比對，將保留后的Unmapped_Reads 與參考基因組進行比對分析，可以定位到基因組上的有效reads 占比在94.91%～96.52%。

與發(fā)酵對數(shù)初期A 相比較，對數(shù)中期B 有1 469 個基因顯著上調(diào)，284 個基因顯著下調(diào)，其中與異戊醇合成相關基因MPC1/2/3、LEU2、BAT1/2、ALD6 的表達水平顯著下調(diào)，而SFA1 顯著上調(diào)（圖5a）。SFA1 編碼的Sfa1p 屬于III 類醇脫氫酶（EC：1.1.1.284），同時具有醇脫氫酶和谷胱甘肽依賴性甲醛脫氫酶活性，參與高級醇的合成[30]。Zhu等[31]發(fā)現(xiàn)過量表達SFA1 可以促進釀酒酵母乙醇的合成，但是否可以有效促進釀酒酵母異戊醇的合成還有待進一步驗證。LEU2 基因編碼3-異丙基蘋果酸脫氫酶，佐一含等[32]和李童等[33]都發(fā)現(xiàn)敲除LEU2 基因會導致釀酒酵母的異戊醇產(chǎn)量顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵對數(shù)初期相比，對數(shù)中期LEU2 基因的表達量顯著下降，與該階段異戊醇合成速率的變化趨勢一致。BAT1 基因編碼的支鏈氨基酸轉氨酶位于線粒體，傾向于催化α-酮酸合成氨基酸，而BAT2 基因編碼的支鏈氨基酸轉氨酶位于細胞質，傾向于催化氨基酸生成α-酮酸，進而合成高級醇[34-35]。BAT1 基因在整個對數(shù)期表達量的變化趨勢為持續(xù)下降，與發(fā)酵液中亮氨酸質量濃度的變化趨勢一致，其在對數(shù)初期的高表達量同樣與該時期較高的亮氨酸質量濃度相符合，表明在發(fā)酵初始階段，釀酒酵母LFE1225 已開始合成亮氨酸，且亮氨酸的合成作用隨發(fā)酵的進行減弱。對數(shù)期BAT2 基因的表達量變化趨勢為先下降后平穩(wěn)，表明亮氨酸的轉氨降解作用也是隨發(fā)酵的進行減弱，且對數(shù)初期之前亮氨酸的合成作用大于降解作用，對數(shù)初期之后正好相反。

與發(fā)酵對數(shù)中期B 相比，對數(shù)末期C 有361個基因顯著上調(diào)、1 378 個基因顯著下調(diào)，其中ILV5、LEU9、PDC6、THI3、ADH6、ALD2/3/5 的表達水平顯著下調(diào)，而ADH1 和ADH2 顯著上調(diào)（圖5a）。在發(fā)酵的對數(shù)末期，ILV5、LEU9、PDC6、THI3和ADH6 的顯著下調(diào)可能與該發(fā)酵階段異戊醇合成速率降低有關。ILV5 基因編碼乙酰羥酸還原酶，其表達量在整個對數(shù)期表現(xiàn)出先平穩(wěn)后下降的趨勢，推測線粒體內(nèi)由上述酶催化的從丙酮酸到α-酮異戊酸的過程主要發(fā)生在對數(shù)期的前期。LEU9 基因編碼α-異丙基蘋果酸合酶，其在對數(shù)期表達量的變化趨勢同樣為先平穩(wěn)后下降，可能與其對應酶的催化作用主要發(fā)生在對數(shù)期前期有關。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能為釀酒酵母LFE1225 在發(fā)酵初始階段大量利用YAN 導致發(fā)酵基質中YAN 含量相較缺乏，因此釀酒酵母開始通過Harris 途徑合成亮氨酸等氨基酸，同時產(chǎn)生異戊醇，并且隨發(fā)酵的進行以及釀酒酵母自身合成氨基酸的積累，該途徑的作用慢慢減弱。與發(fā)酵對數(shù)中期相比，對數(shù)末期酮酸脫羧酶編碼基因PDC6 的表達量顯著下降，與該時期異戊醇合成速率變化趨勢一致，THI3 基因也表現(xiàn)出類似的趨勢。THI3 編碼類丙酮酸脫羧酶，亮氨酸的降解主要由該酶催化，同時其也可催化異亮氨酸的降解，并且在丙酮酸脫羧酶存在的條件下可催化芳香族氨基酸的脫羧反應[36]。楊青[37]研究發(fā)現(xiàn)敲除THI3基因的菌株S2 發(fā)酵后蒸餾酒中的相對異戊醇含量比出發(fā)菌株S1 降低了28.3%。

圖5 基因轉錄差異比較（a）和差異表達基因Pathway 富集分析（b）Fig.5 Comparison of gene transcription differences（a） and pathway enrichment analysis of differentially expressed genes（b）

將A-Vs-B 時期B-Vs-C 時期的顯著差異基因進行KEGG 代謝通路富集，以P 值小于0.05 作為顯著性富集標準。如圖5b 所示，A-Vs-B 時期的差異表達基因主要富集在糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）、糖酵解/糖異生（Glycolysis / Gluconeogenesis）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）等糖代謝通路，而B-Vs-C時期的差異表達基因主要富集在與細胞膜代謝相關的途徑如類固醇生物合成（Steroid biosynthesis）、脂肪酸延伸及代謝（Fatty acid elongation，F(xiàn)atty acid metabolism）等，以及次級代謝物生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）等代謝通路。差異基因在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）途徑?jīng)]有顯著富集。

2.5 釀酒酵母轉錄因子與異戊醇代謝途徑編碼基因

目前，針對釀酒酵母異戊醇代謝的轉錄調(diào)控研究較少，僅報道了Leu3p 作為轉錄調(diào)控因子參與了支鏈氨基酸和高級醇的代謝調(diào)控[38-39]?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)Leu3p 可調(diào)控異戊醇合成途徑中的ILV2、ILV5、LEU1、LEU2、LEU4 和BAT1 等基因[40]。為了探討轉錄因子在釀酒酵母生理代謝過程中與異戊醇合成的關系，將釀酒酵母現(xiàn)報道的124 個轉錄因子（www.yeastract.com）和異戊醇代謝相關的33 個編碼基因進行表達趨勢分析（圖6）。如圖所示，結果分為8 種趨勢，僅Profile6 和Profile7 具有顯著性（P＜0.05）。在Profile6 中，沒有異戊醇代謝相關基因，卻有轉錄因子Leu3p 的編碼基因LEU3。在Profile7 中，異戊醇代謝相關的BAP2、ILV2、PDC1 和SFA1 等4 個基因與GCN4 等20個轉錄因子具有相同的表達趨勢。利用YEASTRACT 數(shù)據(jù)庫（www.yeastract.com） 分析發(fā)現(xiàn)，GAT1、ADR1、UPC2、GCN4、RPN4、RFX1、CUP2、RIM101、RLM1、SUM1、TYE7、GAL4、RME1 和USV1 等14 個轉錄因子與異戊醇代謝途徑BAP2、ILV2、PDC1 和SFA1 等4 個基因中的一個或兩個基因具有相互作用（圖7）[41]。

圖6 釀酒酵母轉錄因子和異戊醇代謝相關基因的表達趨勢分析Fig.6 Analysis of expression trends of transcription factors and isoamyl alcohol metabolism-related genes in S.cerevisiae

圖7 Profile 7 中差異表達轉錄因子與異戊醇代謝相關基因的相互關系Fig.7 The relationship between differentially expressed transcription factors and genes related to isoamyl alcohol metabolism in Profile 7

3 結論

通過分析本土釀酒酵母LFE1225 發(fā)酵進程中異戊醇合成、碳氮源代謝以及轉錄組學等，解析釀酒酵母LFE1225 的異戊醇合成機制。釀酒酵母LFE1225 在整個發(fā)酵階段可以合成（336.62±4.66）mg/L 異戊醇，其中65%在對數(shù)期合成，隨著發(fā)酵的進行，異戊醇合成速率逐漸降低，且異戊醇合成速率與乙醇合成速率、高級醇合成速率、糖消耗速率具有顯著的正相關。釀酒酵母LFE1225 在發(fā)酵進入對數(shù)期前快速利用YAN，并合成一定量的亮氨酸，此階段異戊醇合成速率最高，進入對數(shù)期后，亮氨酸才開始被快速利用，反而YAN 含量變化不顯著。據(jù)此推測在發(fā)酵初始階段，異戊醇合成速率最高的時候只有少量的異戊醇是通過Ehrlich途徑合成的。

通過分析不同發(fā)酵時期釀酒酵母LFE1225的轉錄組，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵對數(shù)期內(nèi)LEU2、BAT1/2、ILV5、LEU9、PDC6、THI3、ADH6 等異戊醇代謝相關基因的表達量呈下降趨勢，與此階段異戊醇合成速率的變化趨勢一致，這些基因表達量的變化可能是異戊醇產(chǎn)率逐漸降低的原因。盡管現(xiàn)有文獻報道認為轉錄因子LEU3 在調(diào)控酵母異戊醇代謝中具有重要作用，但是本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)其在表達水平上有顯著變化，但通過分析釀酒酵母轉錄因子與異戊醇代謝相關基因的表達趨勢發(fā)現(xiàn)，14 個轉錄因子GAT1、ADR1、UPC2、GCN4、RPN4、RFX1、CUP2、RIM101、RLM1、SUM1、TYE7、GAL4、RME1 和USV1 等可能參與了釀酒酵母LFE1225 異戊醇代謝的調(diào)控。這些轉錄因子在異戊醇代謝中的作用還需要進一步試驗驗證。