藥物化學(xué)實驗綜合性改革的設(shè)計與實踐*

楊 潔，曾 嶸，袁 懿，歐陽勤

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)，重慶 400038)

藥物化學(xué)(Medicinal chemistry)是一門發(fā)現(xiàn)與發(fā)明新藥、合成化學(xué)藥物、闡明藥物化學(xué)性質(zhì)、研究藥物分子與機體細胞(生物大分子)之間相互作用規(guī)律的綜合性學(xué)科，是藥學(xué)領(lǐng)域中的重要學(xué)科[1]。近年來，生物學(xué)、計算機學(xué)、物理學(xué)、信息學(xué)等學(xué)科不斷交叉融入傳統(tǒng)的藥物化學(xué)中，最新的藥物化學(xué)研究早已不僅僅拘泥于單純的藥物合成，研究內(nèi)容和形式都在不斷擴充，使得藥物化學(xué)又成為一個備受關(guān)注的朝陽學(xué)科[2]。并且隨著祖國不斷地繁榮昌盛，我國醫(yī)藥事業(yè)對藥物研發(fā)人才的需求也越加巨大，培養(yǎng)綜合性全面發(fā)展的藥學(xué)人才也成為了當(dāng)代藥物化學(xué)教學(xué)的最終目標(biāo)[3]。目前，全國高等學(xué)校本科生藥物化學(xué)實驗課程仍以傳統(tǒng)的化學(xué)合成實驗為主，單純地重復(fù)驗證經(jīng)典藥物的合成，不僅與有機化學(xué)實驗課程內(nèi)容較為重復(fù)，且缺少與生物學(xué)和計算機學(xué)等學(xué)科交叉融合，已經(jīng)不能完全體現(xiàn)當(dāng)代藥物化學(xué)課程的特征。分析原因可能是：(1)我國藥學(xué)的初步發(fā)展主要依賴于化學(xué)合成；(2)過去的研究條件較差，而藥物分子水平相互作用實驗，以及計算機模擬對接實驗要求的實驗條件和實驗成本較高。因此，為使藥物化學(xué)實驗課程更加貼近現(xiàn)代藥物化學(xué)的研究規(guī)律，以及滿足藥物化學(xué)人才培養(yǎng)的需求，進行了本次藥物化學(xué)實驗綜合性改革。

1 藥物化學(xué)實驗綜合性改革的方式

根據(jù)藥物化學(xué)的學(xué)科特點和現(xiàn)代藥物化學(xué)的最新科研思路，通過查閱文獻資料并與相關(guān)教師充分討論，作者嘗試性地在傳統(tǒng)合成實驗的基礎(chǔ)上將藥物化學(xué)實驗課程進行改革，具體如下。

1.1課程內(nèi)容改革

1.1.1加入藥物活性測定實驗 本科生在傳統(tǒng)的學(xué)生實驗中幾乎接觸不到生物學(xué)相關(guān)的實驗，但目前藥物化學(xué)及其他方向的科學(xué)研究中，生物學(xué)實驗卻占據(jù)了極大的比重。因此，創(chuàng)新性地引入藥物分子水平的相互作用的實驗不僅能讓學(xué)生更加直觀地認識藥物發(fā)揮的實際藥理作用，加深藥物化學(xué)理論知識的理解，還能掌握分子生物學(xué)實驗相關(guān)的基本操作，為將來進行科學(xué)研究打下一定基礎(chǔ)[4]。

1.1.2加入計算機輔助藥物設(shè)計實驗 在傳統(tǒng)教學(xué)過程中，單靠文字描述和二維圖片展示很難使學(xué)生理解化合物的立體結(jié)構(gòu)、藥物分子與受體的作用方式及藥物的構(gòu)效關(guān)系等[5]。隨著計算機技術(shù)和現(xiàn)代教育的發(fā)展，多媒體輔助教學(xué)集成文字、聲音、圖片、影像、動畫等各類信息，被廣泛應(yīng)用于課堂教學(xué)中，成為傳播知識不可或缺的先進教育技術(shù)[6]。將Sybyl-X、PyMOL等計算機軟件應(yīng)用于藥物化學(xué)教學(xué)，構(gòu)建藥物、蛋白的三維分子模型，不但可以幫助學(xué)生更加深刻地理解藥物發(fā)揮作用的方式和原理，還能生動形象地向?qū)W生展現(xiàn)有趣的藥物微觀世界，期望可以起到激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的作用[7-8]。

1.2教學(xué)方法創(chuàng)新 加入討論匯報環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)實驗中，學(xué)生僅以實驗報告的形式單向地向教師呈現(xiàn)實驗結(jié)果，通過加入最后的討論匯報部分，不僅可以提高學(xué)生的表達能力，還可以形成一個學(xué)生與教師之間、學(xué)生與學(xué)生之間雙向討論的局面，改變教師單方面輸出知識的傳統(tǒng)形式，讓每一個學(xué)生都參與進來，學(xué)會主動地思考和解決問題。

1.3教學(xué)模式創(chuàng)新 采用虛擬與實際相結(jié)合的教學(xué)模式。虛擬與實際相結(jié)合，將傳統(tǒng)實驗強化和延伸，是目前實驗教學(xué)改革的一個重要方向[9]。本次綜合性實驗改革通過生物實驗測定藥物的活性，直觀形象地讓本科生認識到藥物所發(fā)揮的具體藥效，還利用計算機軟件模擬蛋白與藥物的對接方式，顯示藥物與受體的結(jié)合原理，并以三維圖形的形式展示分子相互作用的動態(tài)過程，使原本抽象的教學(xué)內(nèi)容能夠直觀地呈現(xiàn)在學(xué)生面前。不僅能豐富藥物化學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容和形式，還能充分調(diào)動本科生的學(xué)習(xí)能動性和求知欲。

2 藥物化學(xué)實驗綜合性改革的設(shè)計與實踐

2.1合成藥物的確定 作為藥物化學(xué)實驗改革項目，突出“藥物”的特點是必要的，合成的化合物必須是藥物或者藥物的中間體[10]。合成過程中考慮所用原料、試劑、儀器的安全性也是非常重要的一點。此外，實驗方法要求簡單可靠，反應(yīng)條件溫和，耗時不宜過長，提純方法不宜太復(fù)雜，操作難度適中。并且第二部分還將用第一部分合成的藥物進行生物活性測定，這就要求藥物具有比較明顯的生物活性，且藥物靶蛋白的活性易于測定，能給本科生一個直觀的結(jié)果。為此作者首先從對酶活性具有明顯抑制作用的藥物著手，考慮了乙酰膽堿酯酶抑制劑溴新斯的明和他克林、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利、環(huán)氧合酶抑制劑對乙酰氨基酚和阿司匹林等多個預(yù)選方案(圖1)。后期通過文獻查閱和預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)溴新斯的明的合成需要用到對神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)具有嚴重損害性的溴甲烷，卡托普利的合成存在步驟復(fù)雜、產(chǎn)率較低且手性不易控制的缺點，環(huán)氧合酶的活性測定方法較為復(fù)雜。而他克林具有合成方法簡便快捷、原料毒性低、乙酰膽堿酯酶的活性測定方法成熟的優(yōu)點，適合本科生藥物化學(xué)實驗，因此最后選用乙酰膽堿酯酶抑制劑他克林作為本次實驗改革的藥物。

圖1 對酶活性具有明顯抑制作用的藥物

2.2生物試劑盒的選擇 市面上有多種乙酰膽堿酯酶活性測定試劑盒，所用原理大都為：乙酰膽堿酯酶(AChE)催化乙酰膽堿(ACh)水解生成膽堿，膽堿與二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)作用生成 5-巰基-硝基苯甲酸(TNB)，TNB 在412 nm處有吸收峰，通過測定412 nm處吸光度的增加速率，來計算AChE活性。但作者在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，不同試劑盒在操作方法、結(jié)果穩(wěn)定性方面稍有區(qū)別，例如：Solarbio公司試劑盒的操作步驟要求加完樣品和試劑后，在10、190 s時分別讀取412 nm處的吸光度，而Sigma-Aldrich公司的試劑盒要求在2、10 min時讀取412 nm處的吸光度，顯然后者對實驗者的熟練度要求更低，更適合第一次接觸生物實驗的本科生。因此通過預(yù)實驗和討論，作者最終選擇了結(jié)果穩(wěn)定、操作方法適合本科生的Sigma-Aldrich公司的乙酰膽堿酯酶活性測定試劑盒。

2.3分子對接方法的選擇 作者所在教研室擁有理論浮點運算峰值可達11.34TFlops的高性能集群，學(xué)生可以通過X-shell直接登錄服務(wù)器，并遠程調(diào)用分子對接軟件進行相關(guān)的課程訓(xùn)練。目前，常用的分子對接軟件包括：薛定諤藥物設(shè)計軟件，Discovery Studio，Sybyl-X，Autodock等。對于薛定諤藥物設(shè)計軟件和Discovery Studio，目前本校沒有教學(xué)使用的相關(guān)版權(quán)；Autodock為開源軟件，但是其分子對接操作相對較復(fù)雜，對沒有Linux系統(tǒng)使用經(jīng)驗的學(xué)生而言可能會具有一定的難度；而Sybyl-X是一款功能強大的藥物設(shè)計模擬軟件，是Tripos公司專門為藥物小分子與生物大分子科研者設(shè)計的分子模擬軟件，也是目前分子模擬常用的軟件之一[11]。而且Sybyl-X使用較為方便，學(xué)生可以通過遠程登錄，調(diào)用服務(wù)器上的軟件進行學(xué)習(xí)。因此，作者選擇Sybyl-X作為課程學(xué)習(xí)的軟件，學(xué)生將根據(jù)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)合口袋，進行分子對接，軟件會根據(jù)結(jié)合情況分別進行打分。但Sybyl-X在作圖方面有一定的缺陷，較難繪出理想的圖像。PyMOL是一款分子三維圖像顯示軟件，由DELANO W L編寫，能形象地表達分子動態(tài)過程，目前對教學(xué)免費試用。因此，作者選擇PyMOL軟件供學(xué)生學(xué)習(xí)，向?qū)W生演示小分子的三維結(jié)構(gòu)，以及用球棍、飄帶等多種方式顯示蛋白三維結(jié)構(gòu)的方法，并找到蛋白與藥物相互作用的關(guān)鍵氨基酸，具有圖像色彩鮮艷，結(jié)構(gòu)形象的優(yōu)點[8]。

2.4改革實踐 在具體的實驗教學(xué)實踐中，將實驗改革課程分為4個部分，包括藥物他克林的合成、他克林的生物活性測定、他克林與蛋白的模擬對接、結(jié)果匯報(圖2)。在結(jié)果匯報方面，在傳統(tǒng)書面實驗報告的基礎(chǔ)上，加入討論匯報環(huán)節(jié)。每組學(xué)生制作幻燈片，以報告的形式分析實驗數(shù)據(jù)、匯報實驗結(jié)果，并討論實驗中發(fā)現(xiàn)的問題及自己的思考，同時教師和其他學(xué)生也可以向他們提出問題。通過這種形式，不僅可以鍛煉學(xué)生的獨立思考能力和表達能力，還能促進師生之間的交流，加深學(xué)生對知識點的記憶。同時有4名指導(dǎo)教師根據(jù)學(xué)生的綜合表現(xiàn)給出實驗分數(shù)。作者期望通過這樣一個較為系統(tǒng)的實驗改革，讓學(xué)生了解藥物化學(xué)的研究思路和方法，培養(yǎng)學(xué)生對藥物化學(xué)學(xué)科及藥物化學(xué)課程的興趣。

圖2 綜合性藥物化學(xué)實驗課程流程

3 藥物化學(xué)實驗綜合性改革的效果和總結(jié)

將藥物化學(xué)實驗進行綜合性改革，創(chuàng)新性地引入生物活性測定和計算機模擬藥物設(shè)計實驗，經(jīng)過1年的實踐證明取得了良好的效果。

3.1實驗項目設(shè)置更加合理 藥物化學(xué)是連接化學(xué)和藥學(xué)的橋梁，主要涉及設(shè)計、發(fā)現(xiàn)、開發(fā)創(chuàng)新藥物[5]。現(xiàn)代藥物化學(xué)除了傳統(tǒng)的化學(xué)合成外，已經(jīng)融合了生物學(xué)和計算機學(xué)等內(nèi)容。而在本次綜合性實驗改革中，學(xué)生熟練地掌握了藥物合成的實驗技能；通過乙酰膽堿酯酶活性測定試劑盒測定合成的他克林的抑酶活性，并繪制半數(shù)抑制濃度(IC50)曲線(圖3 A、B)，直觀認識藥物發(fā)揮的藥理活性；通過計算機模擬對接乙酰膽堿酯酶與他克林，讓學(xué)生更形象地認識到藥物的空間結(jié)構(gòu)，并對藥物與靶點作用的微觀世界也有了深刻的認識，使枯燥、抽象的藥物結(jié)構(gòu)和藥物化學(xué)知識變得直觀、易懂(圖3 C、D)；最后通過對自己的實驗結(jié)果進行分析總結(jié)，提高了學(xué)生的獨立思考和表達的能力，既能活躍課堂氣氛、加強學(xué)生和教師間的交流，也加深了學(xué)生對知識點的記憶。

A、B：乙酰膽堿酯酶-他克林IC50曲線；C、D：乙酰膽堿酯酶與他克林模擬對接結(jié)果。

3.2學(xué)生綜合素質(zhì)得以提高 在本次實驗改革中，學(xué)生對新的教學(xué)模式均展現(xiàn)出了極高的興趣，不僅課前認真預(yù)習(xí)，獨立思考反應(yīng)機理，查找之前沒有接觸過的生物實驗和計算機模擬對接的相關(guān)介紹，在實驗過程中也勇于向教師提出問題，膽大心細。最后的展示討論部分，學(xué)生雖然是第1次上臺匯報自己的實驗結(jié)果，但是大家認真準(zhǔn)備PPT，記錄實驗現(xiàn)象，分析實驗操作的目的，激烈地討論實驗中遇到的問題，查閱文獻討論新方法(圖4)。大多數(shù)學(xué)生還在匯報中提到他們在藥物IC50概念，酶活性的測定原理及方法，移液槍的使用，以及利用計算軟件模擬藥物與靶蛋白之間的相互作用等方面有所收獲。此綜合實驗不僅鍛煉了學(xué)生解決問題的能力，加強了科學(xué)嚴謹?shù)膽B(tài)度，還激發(fā)了學(xué)生對科研的積極性和興趣。

圖4 代表性學(xué)生匯報PPT

3.3加深學(xué)生對藥物化學(xué)課程的理解 本次綜合性實驗改革在傳統(tǒng)藥物合成的基礎(chǔ)上，加入了藥物的生物活性測定和藥物與靶蛋白的計算機模擬對接實驗內(nèi)容，通過實踐操作，向本科生呈現(xiàn)了現(xiàn)代藥物化學(xué)研究的完整思路，也讓他們對于藥物化學(xué)和生命科學(xué)、計算機學(xué)、信息學(xué)的相互交叉有了更加深刻的體會，提高學(xué)生對本專業(yè)的使命感和自豪感，為以后進入藥學(xué)科研行業(yè)奠定了一定基礎(chǔ)。

4 總 結(jié)

本次藥物化學(xué)實驗綜合性改革，打破傳統(tǒng)實驗單純地重復(fù)驗證經(jīng)典藥物合成的模式，創(chuàng)新性地引入藥效實驗及計算機模擬對接的實驗內(nèi)容，將實驗的內(nèi)容、形式都進行了豐富。實驗過程中課堂氣氛活躍，學(xué)生對于未接觸過的生物實驗和計算機模擬對接實驗均展現(xiàn)出了極高的求知欲和積極性。通過本次實驗改革不僅讓學(xué)生全面扎實地掌握藥物化學(xué)知識，還讓本科生對當(dāng)代藥物化學(xué)的研究思路更加清晰，確實培養(yǎng)學(xué)生的科技創(chuàng)新能力，對于高素質(zhì)藥物化學(xué)人才的培養(yǎng)的模式和體系起到一定的實踐和探索作用。