乳中功能性蛋白質(zhì)分離技術(shù)研究進(jìn)展

張麗博，張 樂，梁雨馨，竇慶哲，李 春,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

乳中含有豐富的功能性蛋白質(zhì)，如具有調(diào)節(jié)嬰兒睡眠質(zhì)量、促進(jìn)腸道消化作用的α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）[1]，具有降血壓、抗氧化作用的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）[2]，可促進(jìn)鐵吸收的乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）[3]，與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的乳過氧化物酶（lactoperoxidase，LP），能分解為功能性蛋白多肽的β-酪蛋白（β-casein，β-CN）[4]，以及可抑制癌細(xì)胞增殖的乳脂肪球膜蛋白（milk fat globule membrane protein，MFGMP）[5]等。目前功能性乳蛋白在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，需求量極大。然而，由于分離技術(shù)瓶頸，大大限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用。本文綜述6 種功能性乳蛋白分離技術(shù)及具體的工藝參數(shù)，分析不同實(shí)驗(yàn)條件下的蛋白質(zhì)純度和產(chǎn)率，并對其加工規(guī)模和應(yīng)用前景進(jìn)行評價(jià)，旨在對未來乳中功能性蛋白中試和產(chǎn)業(yè)化分離提供一定的理論參考。

1 α-La和β-Lg的分離技術(shù)

1.1 超臨界CO2（supercritical carbon CO2，scCO2）分餾技術(shù)

1.1.1 scCO2分餾技術(shù)概述

由于α-La和β-Lg的等電點(diǎn)差異，分別為4.20～4.50和5.35～5.49，因此在酸性介質(zhì)中，α-La比β-Lg更易沉淀析出。scCO2分餾技術(shù)具有氣體的擴(kuò)散率和液體的密度，這一特性增加了其水溶性。scCO2的溶解度取決于熱力學(xué)平衡，而熱力學(xué)平衡受體系溫度和壓力的調(diào)節(jié)，scCO2水溶液中的CO2濃度會影響介質(zhì)的pH值，scCO2在水溶液中可以使α-La餾分析出并富集。因此，當(dāng)達(dá)到CO2水溶液在大氣壓力下達(dá)到飽和、溶液pH值降低到4.00的實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，會出現(xiàn)α-La沉淀析出而β-Lg仍存在于溶液中的現(xiàn)象。此時(shí)會形成2 種明顯的相：富含α-La而低β-Lg含量的沉淀相（固相）和富含β-Lg而低α-La含量的可溶相（液相）[6]。

1.1.2 scCO2分餾技術(shù)的應(yīng)用

Lima等[6]利用scCO2分餾技術(shù)和連續(xù)流反應(yīng)器，從分離乳清蛋白（whey protein isolate，WPI）中分離α-La和β-Lg。實(shí)驗(yàn)過程為：WPI中α-La、β-Lg的初始質(zhì)量比為1∶7.7，反應(yīng)溫度20～60 ℃及8、16、24 MPa的等壓條件下進(jìn)行。結(jié)果表明：8 MPa/55 ℃的組合是獲得α-La的最佳條件，此時(shí)α-La含量較高（α-La/β-Lg=3.84），析出相產(chǎn)率為20.9%；同時(shí)，在8 MPa/55 ℃條件下也產(chǎn)生了β-Lg高選擇性餾分（α-La/β-Lg=0.12）。因此當(dāng)工藝條件為8 MPa/55 ℃時(shí)，可以得到α-La和β-Lg的最佳產(chǎn)率。

Lima等[7]調(diào)整工藝條件為16 MPa和60 ℃，以50 g/L的WPI溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到更高產(chǎn)率的α-La和β-Lg。先將常規(guī)乳清進(jìn)行超濾、離子交換層析及噴霧干燥等步驟，得到蛋白質(zhì)含量大于90%的WPI濃縮液。離心分離后，將WPI分為固相和液相，將兩相置于間歇反應(yīng)器和連續(xù)反應(yīng)器中，通過scCO2進(jìn)行分餾和沉淀后得到α-La和β-Lg，α-La的產(chǎn)率為47.5%，β-Lg的產(chǎn)率為11.2%，純度顯著提高。

上述研究先后進(jìn)行了2 次從WPI中分離α-La和β-Lg的實(shí)驗(yàn)，通過改進(jìn)分離技術(shù)及工藝參數(shù)，使得2 種蛋白質(zhì)分離率和純度顯著提高。

1.2 選擇性熱聚集分離技術(shù)

1.2.1 選擇性熱聚集分離技術(shù)概述

選擇性熱聚集分離是一種通過調(diào)節(jié)溶液pH值和溫度使α-La聚集體分解并誘導(dǎo)其重新折疊至天然狀態(tài)，以及使β-Lg在一個(gè)可控過程中定向聚集的方法。除了上述條件外，一些其他的影響因素，包括蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、鹽的類型和濃度、螯合劑、其他蛋白質(zhì)（如酪蛋白）的存在及其濃度等都會影響熱聚集分離過程，所以可以通過控制工藝參數(shù)，使得可溶性天然形態(tài)的α-La和β-Lg產(chǎn)率最高。

1.2.2 選擇性熱聚集分離技術(shù)的應(yīng)用

Tolkach等[8]通過選用蛋白質(zhì)、乳糖和鈣含量不同的溶液，確定分離α-La和β-Lg的最優(yōu)工藝條件，當(dāng)溶液中蛋白質(zhì)含量5 g/L、乳糖含量0.5 g/L、鈣含量0.55 g/L，溶液pH值為7.5，在97 ℃熱處理30 s時(shí)，可以得到最好的分離效果，即β-Lg產(chǎn)率為99.6%，天然α-La的損失量最小，最終產(chǎn)率為24.4%。

Haller等[9]利用β-CN的熱變性動力學(xué)，采用熱處理方法對WPI溶液中的β-Lg進(jìn)行選擇性聚集，然后將其在中試離心機(jī)中從α-La富集濃縮物中分離，對于粒徑小于20 μm的顆粒團(tuán)，pH值為4.6時(shí)絮凝效果最佳，pH值為4.5時(shí)凈電荷為0，pH值為4.4時(shí)澄清度最高，即在pH值為4.4時(shí)溶液發(fā)生了最強(qiáng)絮凝，有利于20 μm以下團(tuán)聚體碎塊的分離；α-La和β-Lg均以可溶性的天然形式得到，其組分純度均大于99%，產(chǎn)率也在99%以上。

Haller等[10]在酸性條件下通過選擇性熱沉淀分離出α-La，然后再通過高通量連續(xù)離心分離法得到高純度的α-La和β-Lg。具體操作為：將WPI粉在去離子水中溶解，得到最終蛋白質(zhì)量濃度為150 g/L的WPI溶液，然后在4 ℃條件下輕輕攪拌12 h，確保蛋白質(zhì)完全溶解；在進(jìn)一步加工前，將WPI溶液溫度調(diào)至20 ℃，pH值調(diào)至3.4，通過500 L罐體加熱夾套間接加熱，可實(shí)現(xiàn)α-La的選擇性聚集；由于沉淀物中仍含有可溶性β-Lg緩沖鹽的殘留物，因此實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行了兩步回流洗滌，最終得到2 個(gè)高純蛋白組分，上清液中β-Lg純度為99.7%，洗滌后的α-La沉淀組分中不含β-Lg，純度為99.4%。

1.3 高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）分餾技術(shù)

1.3.1 HHP分餾技術(shù)概述

HHP分餾技術(shù)應(yīng)用于分離α-La和β-Lg，其分離原理為：β-Lg在一定壓力范圍內(nèi)（200～600 MPa）變化時(shí)會發(fā)生不同程度的沉淀聚集；酪蛋白在一定壓力作用下更易使β-Lg發(fā)生聚集；酸化的可濕性粉劑可誘導(dǎo)4 個(gè)β-Lg二聚體結(jié)合形成β-Lg八聚體，而α-La仍以單體形式存在。基于以上，在pH值為4.6的酸化乳清溶液中，高壓處理可誘導(dǎo)β-Lg聚集，同時(shí)保持β-Lg仍穩(wěn)定存在于富含α-La的溶液中，再將溶液離心分離，可以得到富含α-La的上清液和β-Lg沉淀物[11]。

1.3.2 HHP分餾技術(shù)的應(yīng)用

Marciniak等[11]將含有α-La、β-Lg和酪蛋白的蛋白模型溶液用HHP技術(shù)加壓處理，使不溶的β-Lg與酪蛋白形成聚合物，溶液酸化至pH 4.6后沉淀，但α-La仍可溶；在600 MPa處理300 s的條件下，α-La和β-Lg可以得到最高的純度及產(chǎn)率，即α-La純度為86%、產(chǎn)率為77%，β-Lg純度為92%、產(chǎn)率為68%。

Marciniak等[12]基于HHP技術(shù)，分別研究5、10、15 min，600 MPa下的單循環(huán)HHP和5 min、600 MPa下的多循環(huán)HHP（1～3 個(gè)循環(huán)），在初始pH值（pH 6.66）和酸化至pH值為4.6時(shí)對干酪乳清中α-La和β-Lg分離的影響。與對照組乳清相比，酸化乳清在所有增壓條件下都引起了β-Lg的急劇聚集，在5 min、600 MPa下的多循環(huán)HHP，酸化乳清pH 4.6時(shí)，α-La的純度為75%、產(chǎn)率為95%，β-Lg純度為98%、產(chǎn)率為88%。

HHP是一個(gè)多循環(huán)連續(xù)處理技術(shù)，運(yùn)行和維護(hù)成本相對較高，但同時(shí)兼具環(huán)保、高效的特點(diǎn)，因此對于分離某些高附加值的產(chǎn)品來說仍具有開發(fā)潛力，需要進(jìn)一步研究。

2 LF和LP分離技術(shù)

2.1 膜色譜技術(shù)

2.1.1 膜色譜技術(shù)概述

膜色譜是一種成熟的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，它是基于膜過濾和液相色譜為一體的分離技術(shù)。與傳統(tǒng)樹脂色譜相比，膜色譜技術(shù)的優(yōu)勢主要在于擴(kuò)散時(shí)間短，因?yàn)榉肿优c膜中活性位點(diǎn)之間的相互作用發(fā)生在對流的通孔中，而不是發(fā)生在吸附劑顆?？變?nèi)的靜止液體中。因此，當(dāng)膜色譜技術(shù)應(yīng)用于分離高流速物質(zhì)和擴(kuò)散率小的生物大分子中時(shí)，可以有效減少生物分子的降解和變性。

2.1.2 膜色譜技術(shù)的應(yīng)用

用膜色譜分離乳清蛋白已經(jīng)在許多研究中報(bào)道過。從甜干酪乳清中，通過軸向流結(jié)構(gòu)的陽離子交換膜色譜法分離出LP和LF，經(jīng)0.1、0.2、1.0 mol/L NaCl 3 步洗脫，得到純度約為95%的LF；然后將陽離子膜面積從15 cm2增加到4 m2，LF的產(chǎn)率超過90%，然而，當(dāng)流速從3 mL/min增加到15 mL/min時(shí)，LF的膜結(jié)合能力從0.6 mg/cm2下降到0.3 mg/cm2[13]。

Chiu等[13]使用表面積分別為100、790 cm2的陽離子交換膜色譜設(shè)備，從乳清中提取LF和LP，該凈化工藝由上清液、洗滌、分步洗脫和洗滌等步驟組成，共12 個(gè)循環(huán)，增加表面積和重復(fù)循環(huán)對LP和LF的產(chǎn)率沒有影響，最終得到LF和LP產(chǎn)率分別為50.0%和73.0%。

Voswinkel等[14]使用離子交換徑向流裝置改進(jìn)了流體分布狀態(tài)。首先，在pH 7.0條件下，β-Lg和牛血清白蛋白與陰離子交換劑結(jié)合；然后，將第1步得到的滲透液引入pH 4.8的陽離子交換器中，使LF、LP和免疫球蛋白結(jié)合，而β-Lg被過濾除去；接著采用徑向流裝置和50 倍膜面積對該工藝的可擴(kuò)展性進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)室條件下，LF純度為97%、產(chǎn)率為66%；在中試條件下，LF的純度和產(chǎn)率分別下降至89%和39%。

2.2 多模態(tài)色譜技術(shù)

2.2.1 多模態(tài)色譜技術(shù)概述

與離子交換層析不同，即使是在低/中等離子強(qiáng)度條件下，染料親和層析也允許蛋白質(zhì)吸附。高效色譜載體必須具有結(jié)合能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高及被非特異性蛋白吸附的可能性低等物理特性；還需有功能性基團(tuán)，與不同配體（如三嗪染料）形成交聯(lián)及固定化等結(jié)構(gòu)特性。因此，這些特性使殼聚糖成為多模態(tài)色譜法分離蛋白質(zhì)的理想載體材料[15]。

2.2.2 多模態(tài)色譜技術(shù)的應(yīng)用

Daniela等[15]研究一種新型多模態(tài)殼聚糖色譜矩陣的應(yīng)用，可直接從干酪乳清中獲得LF和WPI，無需任何預(yù)處理；采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化序列，這一序列包括使用氨基磺酸修飾的殼聚糖微球捕獲LF，然后使用縮水甘油酯三甲基銨修飾的殼聚糖微球捕獲大量剩余蛋白。結(jié)果表明，LF的純度為70%、產(chǎn)率為68%，WPI在乳清中的回收量為2.71 mg/mL。

Nicolás等[16]開發(fā)了一種新型、低成本的染料殼聚糖多模態(tài)基質(zhì)，通過吸附、洗脫等步驟從乳清中分離純化出LP和LF，且具有較小的交叉污染。實(shí)驗(yàn)首先以橙色熒光染料為固定化配體合成殼聚糖微球，直接從乳清中吸附LP和LF，然后通過微分洗脫從染料殼聚糖多模態(tài)基質(zhì)中分離LP和LF。在接觸時(shí)間2 h內(nèi)，LP和LF幾乎被完全吸附（＞90%）。最后，利用響應(yīng)面法確定了LP和LF的最佳洗脫條件，即先用1 mol/L NaCl在pH 9.0條件下洗脫LP，然后用2 mol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)50%聚丙二醇在pH 9.0條件下洗脫LF。經(jīng)過3 個(gè)連續(xù)凈化循環(huán)后，可以得到2 種分離產(chǎn)物（LP和LF），LP的產(chǎn)率為70%，LF的產(chǎn)率為60%，且純度較高，交叉污染小。

María等[17]采用交聯(lián)殼聚糖微球與固定化黃色熒光染料作配體，從甜乳清中分離LF，最大吸附量為51.14～58.28 mg/g基質(zhì)，微球吸附了甜乳清中約95%的LF，并洗脫出其中80%的LF，最終純度大于90%、產(chǎn)率達(dá)77%。

上述研究利用天然聚合物殼聚糖分離乳清蛋白，可以得到高純度的LP和LF。此外，多模態(tài)矩陣還具有無需對乳清進(jìn)行預(yù)處理、具有良好的機(jī)械阻力、在吸附、洗滌和洗脫步驟后得到的蛋白質(zhì)更容易回收等特點(diǎn)。

2.3 模擬移動床（simulated moving bed，SMB）技術(shù)

2.3.1 SMB技術(shù)概述

傳統(tǒng)的柱層析是分離蛋白質(zhì)的主要技術(shù)，與其他分離方法相比，柱層析價(jià)格高昂，而SMB技術(shù)是一種使柱式工藝更高效、更經(jīng)濟(jì)的方法。SMB是通過在柱上切換閥門或柱在旋轉(zhuǎn)器上移動，實(shí)現(xiàn)模擬固相和液相之間的逆流操作。逆流操作的優(yōu)點(diǎn)有：可以使液體流的吸附作用更加高效；生產(chǎn)效率更高；原料使用效率、生產(chǎn)效率和產(chǎn)品濃度增加；緩沖溶液消耗和工廠面積規(guī)模減少。

2.3.2 SMB技術(shù)的應(yīng)用

SMB技術(shù)是一種連續(xù)色譜技術(shù)。Jonatan等[18]采用20 柱SMB工藝從濃縮乳清蛋白中分離LP和LF，以單柱突破實(shí)驗(yàn)的色譜循環(huán)為基礎(chǔ)，采用一種簡化的方法設(shè)計(jì)SMB流程。將SMB過程數(shù)據(jù)與突破性實(shí)驗(yàn)的理論放大數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，生產(chǎn)率提高48%，緩沖液用量減少，且目標(biāo)蛋白濃度提高6.5 倍，LP和LF在洗脫液中的回收率分別為88%和105%。

SMB技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化方面的應(yīng)用目前還相對較少，而Mueller等[19]將SMB技術(shù)用于分離葡萄糖和果糖，也取得了比較顯著的分離效果。

3 β-CN分離技術(shù)

3.1 膜分離技術(shù)——低溫微濾技術(shù)

3.1.1 低溫微濾技術(shù)概述

對于酪蛋白組分的分離主要包括選擇性沉淀和低溫膜過濾[20]。使用微濾膜分離β-CN的原理和特點(diǎn)主要有以下幾方面：微濾分離過程不會改變膠束酪蛋白濃縮物中β-CN的數(shù)量；與α-酪蛋白（α-casein，α-CN）和κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN）不同的是，β-CN從酪蛋白膠束中的解離受到溫度的影響；β-CN在低溫（＜5 ℃）牛乳中，從酪蛋白膠束分離到血清相的過程是可逆的。因此使用微濾聚合膜，可以在低溫下從脫脂牛乳中分離出β-CN。

3.1.2 低溫微濾技術(shù)的應(yīng)用

在發(fā)酵蛋白豐富的乳制品，如新鮮干酪和“希臘風(fēng)味”酸乳的生產(chǎn)過程中，通常采用離心分離或膜過濾的方法來增加干物質(zhì)含量。而相關(guān)研究[21]表明，通過微濾技術(shù)也可以改變膠束酪蛋白濃縮液中β-CN的含量。

Hekken等[22]利用巴氏殺菌脫脂牛乳，使用低溫（4 ℃）微濾膜（0.1 μm、0.2 μm、100 kDa截留），在0.8 mL/min的流速下進(jìn)行過濾。獲得的滲透產(chǎn)物用微濾膜（100 kDa截留）進(jìn)行過濾，以增加保留液的固體（β-CN）含量，β-CN純度達(dá)到52%～75%。該技術(shù)操作簡便、分離效率高，但產(chǎn)量較低，適合大規(guī)模分離純化β-CN。

Mahony等[23]提出的工藝中，β-CN與其他牛乳血清蛋白的分離效率比Hekken等[22]高。在低溫過濾前先將牛乳放置于低溫貯藏室12～48 h，使其冷卻至1～2 ℃后再經(jīng)離心分離，可使β-CN從酪蛋白膠束中分離到脫脂牛乳的血清相；然后將380 L脫脂牛乳進(jìn)行低溫過濾（1～2 ℃、0.5 μm）后再在6 ℃條件下對其進(jìn)行超濾和滲濾（10 kDa截留）操作，可進(jìn)一步純化β-CN；最后在25 ℃條件下，使用微濾膜（0.5 μm）對β-CN作進(jìn)一步濃縮處理，β-CN的純度達(dá)到90%以上、產(chǎn)率為10%～20%。

Johannes等[21]研究在β-CN含量降低的情況下，利用溫?zé)嵛V技術(shù)，中試批量生產(chǎn)β-CN濃縮物和膠束酪蛋白濃縮物，其中β-CN的分離在低溫（≤5 ℃）下用膜過濾完成。以脫脂牛乳為原料，采用溫?zé)嵛V技術(shù)，用陶瓷膜（孔徑約1 μm）在50 ℃條件下獲得膠束狀酪蛋白濃縮物。濃縮液在2～3 ℃條件下貯藏40 h，誘導(dǎo)β-CN從酪蛋白膠束中分離出來。用微濾膜（0.3 μm，有機(jī)膜）在低于5 ℃條件下從冷藏濃縮物中分離β-CN。β-CN滲透液加熱至50 ℃，然后在50 ℃條件下用超濾膜（10 kDa截留，有機(jī)膜）過濾，β-CN膠束發(fā)生聚集，β-CN的純度為92.64%、產(chǎn)率高達(dá)18.07%。

3.2 選擇性沉淀分離技術(shù)

3.2.1 選擇性沉淀分離技術(shù)概述

選擇性沉淀法是利用β-CN的鈣敏感性，在堿性溶液中加入CaCl2，將β-CN組分從原料酪蛋白膠束中分離出來。研究表明，溶液pH＞7時(shí)β-CN更容易沉淀，進(jìn)而可以在不使用高速離心的條件下分離出β-CN，分離出的β-CN再通過過濾和脫礦等步驟進(jìn)一步純化[24]。

3.2.2 選擇性沉淀分離技術(shù)的應(yīng)用

Katharina等[24]研究在中試規(guī)模提高酪蛋白組分的得率和純度，并確定影響β-CN分離的主要工藝參數(shù)，如冷提取時(shí)間和分離速率等。將80 L膠束酪蛋白粉（蛋白質(zhì)含量3.2%）置于攪拌機(jī)內(nèi)，在30 ℃條件下攪拌15 min。首先在連續(xù)分離器中，從αs-CN和β-CN中通過選擇性沉淀分離出κ-CN。將含有αs-CN和β-CN的上清液冷卻至5 ℃以下，并去除礦物質(zhì)。將溶液pH值調(diào)整為4.6，放置2 h，使β-CN處于血清分離階段，再經(jīng)連續(xù)噴嘴分離器分離。分離后，在富含β-CN的上清液中發(fā)現(xiàn)有少量αs-CN，再將上清液加熱至35 ℃，溶液pH值調(diào)整為4.6，保持15 min，可得到濃縮β-CN餾分。結(jié)果表明，根據(jù)β-CN組分中酪蛋白總含量計(jì)算得到純度，β-CN的純度和產(chǎn)率分別為68.7%～89.6%和10%～32%。

Thomas等[25]以脫脂牛乳為原料生產(chǎn)3 種膠束酪蛋白濃縮物，通過選擇性沉淀得到3 個(gè)酪蛋白組分，并使用溫度控制臥螺離心機(jī)將含有酪蛋白沉淀物的固相從液相中分離出來，在連續(xù)分離過程中產(chǎn)生3 個(gè)酪蛋白餾分，通過設(shè)定不同的運(yùn)行參數(shù)，如離心加速度、進(jìn)料速率、螺旋輸送機(jī)與碗的差速、堰徑等，使獲得的固體餾分總固體含量、β-CN純度和產(chǎn)率最大。分離β-CN基本上不受應(yīng)用離心力變化的影響，而當(dāng)堰徑為56 mm、進(jìn)料速率為9.0 kg/h、螺旋輸送機(jī)與碗的差速為30 min-1、進(jìn)料溫度和臥槽溫度均增至30 ℃時(shí)，得到β-CN的固體含量、純度和產(chǎn)率最大，分別為40.9%、92.1%和27.5%。

除了加工規(guī)模對β-CN的分離結(jié)果有影響之外，一些環(huán)境因素，如溫度、pH值和CaCl2濃度均對β-CN的純度和產(chǎn)率有影響。因此，需要進(jìn)一步研究環(huán)境因素對酪蛋白組分純度和產(chǎn)率的影響。

4 MFGMP分離技術(shù)

4.1 微濾技術(shù)

4.1.1 微濾技術(shù)概述

與離心式分離不同，膜過濾是一個(gè)壓力驅(qū)動的過程，通過篩選尺寸將膠體顆粒從懸浮液中分離出來。微濾聚合膜從血清蛋白中分離出MFGMP，是目前較為常用的一種分離方法，且對產(chǎn)品的污染較小。其中微濾聚合膜中的陶瓷膜使用較為廣泛，因其具有對壓力、pH值和清潔劑的耐受性更高等特性。使用微濾膜分離MFGMP，可在過濾過程中優(yōu)化膜孔徑等工藝參數(shù)，得到高純度MFGMP材料。

4.1.2 微濾技術(shù)的應(yīng)用

Hansen等[26]通過對原料全脂牛乳進(jìn)行陶瓷膜微濾，從酪蛋白膠束和乳清蛋白中分離脂肪球，從而實(shí)現(xiàn)MFGMP的分離。鮮牛乳在微濾前加熱到50 ℃，所用管狀陶瓷膜的2 種不同孔隙大小為0.8、1.4 μm，并將跨膜壓力分別設(shè)置為120、50 kPa。過濾后，濾液用圓盤式離心機(jī)在50 ℃條件下離心分離成奶油相和血清相。奶油相在4 ℃貯存12 h后，使用攪拌器攪拌，在此期間，大部分MFGMP碎片從脂肪球（黃油相）中分離出來，轉(zhuǎn)移到脫脂乳相。黃油顆粒在60 ℃水浴熔化，排除所有固有水相（黃油血清），脂肪相在4 ℃結(jié)晶后收集。將脫脂乳和黃油血清組分混合并調(diào)整至pH 4.8（MFGMP的等電點(diǎn)）后，在4 ℃條件下分離80 min。在1.4 μm孔徑（膜表面積1.05 m2）下，可以得到脂肪的最低滲透率（2.5%）和蛋白質(zhì)的最高滲透率（97%），并且產(chǎn)生一個(gè)含有7%極性脂質(zhì)和30% MFGMP的分離物，其中非MFGMP的污染僅占總蛋白含量的25%。此外，微濾前后的溫和巴氏殺菌（72 ℃、15 s）對過濾效率、MFGMP成分和產(chǎn)率沒有影響，MFGMP的純度為75%、產(chǎn)率為24%。

Jukkola等[27]采用3 種透濾方式，即脫脂牛乳超濾滲透以及分別用鹽水和水作為濾透介質(zhì)的微濾滲透，通過微濾（孔徑1.4 μm、過濾表面積0.005 m2）從原料乳中分離出乳脂球，并闡明它們對乳脂球穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)滲透的影響。3 種過濾介質(zhì)都會使蛋白濃度顯著降低（約90%），但水和鹽水產(chǎn)生的膜污染相對較小，過濾性能更好。此外，脫脂牛乳超濾滲透的滲透通量降低，由于改變了成分和降低了表觀黏度，在所有滲透溶液中乳的膠體穩(wěn)定性下降。

Wolfgang等[28]用酸和凝乳酶誘導(dǎo)的酪蛋白凝固可以從酪乳中除去所有的酪蛋白膠束，并通過微濾膜過濾掉所有的乳清蛋白，從而分離出MFGMP。在未加熱或低溫加熱的酪乳中，酸化的酪乳（pH 4.5）離心后，MFGMP殘留在上清液中，乳清中MFGMP的產(chǎn)率會隨pH值的升高和溫度的降低而增加，所以在25 ℃、pH 6.4和40 ℃、pH 7.5條件下，酪蛋白的去除率最高，MFGMP的產(chǎn)率最高。因此與酸化相比，使用凝乳酶凝乳法獲得的MFGMP產(chǎn)率更高。

目前，利用微濾技術(shù)從未加工的原料乳中分離純化MFGMP材料的研究相對較少。Jukola等[29]利用陶瓷膜（1.4 μm）對原料乳進(jìn)行過濾，結(jié)果表明，從脂肪球中分離出純度為88%的MFGMP，并且只損失了3%的脂肪。Jukola等[30]用同樣的方法，利用巴氏殺菌乳通過連續(xù)3 次的稀釋和濃縮等步驟，得到產(chǎn)率為93%的MFGMP。

4.2 超濾技術(shù)

4.2.1 超濾技術(shù)概述

用超濾膜分離純化MFGMP有以下2 個(gè)特點(diǎn)：在工業(yè)生產(chǎn)中，超濾法分離具有能耗低、操作簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)；超濾法可以有效減少小MFGMP片段的損失。而在黃油和無水乳脂的生產(chǎn)過程中，會產(chǎn)生酪乳和黃油血清副產(chǎn)品，它們富含MFGMP組分，可作為大規(guī)模分離純化MFGMP組分的理想原料?；谝陨?，黃油血清是富集MFGMP的最佳來源；超濾是一種有效的乳蛋白分離富集方法。

4.2.2 超濾技術(shù)的應(yīng)用

Wang Meng等[31]通過無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析不同膜通量（30、50、100 kDa）的超濾膜對黃油血清中分離并富集MFGMP結(jié)果的影響。首先通過酸沉淀、加入鈣鹽和加熱法去除黃油血清酪蛋白膠束和脂類成分，獲得酸性黃油血清。分別在膜通量為30、50、100 kDa下從酸性黃油血清中分離MFGMP。超濾膜處理溫度為30 ℃，膜入口壓力為0.15 MPa，進(jìn)料流量為0.2 m/s，整個(gè)過程pH值為7。最后將分離富集得到的MFGMP保留液凍干，-20 ℃保存。各組共鑒定出616 種MFGMP，其中可通過膜通量為30、50、100 kDa超濾膜的MFGMP分別為395、399、484 種，因100 kDa膜MFGMP的滲透性較低，而非MFGMP的滲透性較高，所以100 kDa膜的分離效率最高。

乳清酪乳是乳清奶油加工成黃油的副產(chǎn)品，含有豐富的MFGMP。Zheng Shan等[32]用乳清酪乳經(jīng)膜過濾（去除乳清酪乳中的大部分乳糖和灰分）和超臨界萃?。ㄖ惶崛》菢O性脂類）等步驟分離出MFGMP。乳酪乳清經(jīng)超濾濃縮后，再經(jīng)25 ℃條件下滲濾（10 kDa截留），將保留液噴霧干燥，得到的乳清酪乳粉采用二氧化碳超臨界萃取（35 MPa、50 ℃），最終從乳清酪乳中提取出一種富含MFGMP的材料，MFGMP產(chǎn)率為73%。

功能性乳蛋白分離技術(shù)及工藝參數(shù)概述如表1所示。

表 1 功能性乳蛋白分離技術(shù)及工藝參數(shù)Table 1 Techniques and processing parameters for functional milk protein separation

5 結(jié) 語

本文對乳中功能性蛋白質(zhì)，包括α-La、β-Lg、LF、LP、β-CN和MFGMP的分離技術(shù)及工藝流程進(jìn)行概述，對不同蛋白質(zhì)的分離方法，包括選擇性沉淀法、色譜法、scCO2分餾技術(shù)、HHP分餾技術(shù)、SMB技術(shù)、膜過濾、膜色譜等分離技術(shù)和應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，表明分離不同乳蛋白可根據(jù)分離條件和要求選擇不同的方法。其中，SMB技術(shù)在分離LF和LP時(shí)，因其具有分離效率高、產(chǎn)物純度高、污染小等特點(diǎn)，可能將會逐漸被用于分離各種蛋白質(zhì)組分。

目前，人們對于乳營養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值的認(rèn)識越來越全面，對乳制品的需求量也在不斷增長，因此也推動了乳中功能性蛋白質(zhì)的開發(fā)和應(yīng)用，但因分離技術(shù)單一、工序復(fù)雜、分離效率低、生產(chǎn)規(guī)模小等原因，也限制了乳中功能性蛋白進(jìn)一步的分離純化及加工利用。因此繼續(xù)完善大規(guī)模分離純化乳蛋白的技術(shù)、提高乳蛋白分離效率、增加分離過程中產(chǎn)生的廢料利用率等，均是未來研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。