一種含辣木籽抗菌肽MOp2的Pickering乳液對乳餅的保鮮效果

鄒麗蓉，黃志遠(yuǎn)，董文明，王雪峰*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

乳餅是云南少數(shù)民族彝族特有的食物，其味道鮮美、口感獨(dú)特，深受云南本地人喜愛[1-2]。乳餅含有大量優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂溶性維生素和多種脂肪酸，此外還含有人體所必需的多種礦物質(zhì)，營養(yǎng)價值較高[3]。乳餅是將鮮乳過濾后除去雜質(zhì)，在鍋中進(jìn)行加熱，待鮮乳將要沸騰時加入酸水，撤火，保溫?cái)?shù)分鐘，待乳將凝結(jié)成塊時把凝塊弄碎，棄去乳清后，置于清潔的白布中壓制成型[4]。目前乳餅的生產(chǎn)方式還僅僅局限于手工作坊，這種方式不利于乳餅的保存。肖蓉等[5]研究表明，輻照保藏能夠有效延長乳餅貯藏期；李昌盛等[6]研究表明，乳餅通過真空包裝后能有效延長保質(zhì)期。上述保鮮方法均為物理保鮮法，由于生物活性肽的興起，人們對食品的保鮮開始偏向于使用抗菌肽。

抗菌肽，又稱為抗微生物肽，是一類具有廣譜抑菌活性的小分子短肽[7]?？咕牡囊志鷻C(jī)制區(qū)別于抗生素，抗菌肽不僅可以有效殺死真菌、細(xì)菌、寄生蟲等[8-9]，還不易產(chǎn)生耐藥性，因此在食品、醫(yī)療、飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域有應(yīng)用潛力[10-11]。殼聚糖作為一種陽離子多糖，是一種天然的抑菌劑，具有生物相容性、成膜性、生物降解性和無毒等優(yōu)點(diǎn)[12]。殼聚糖可以通過阻止食物和空氣之間的接觸來控制細(xì)菌，廣泛用于水果[13-14]、蔬菜[15-16]、肉類[17-18]等食品的保鮮。此外，殼聚糖具有廣譜抑菌特性[19]，對真菌、細(xì)菌和病毒有一定的抑制作用[20-21]。殼聚糖定向包埋抗菌肽制成的固體顆粒不僅可以增強(qiáng)乳液的抑菌性，殼聚糖對抗菌肽還具有一定的保護(hù)作用，可以提高抗菌肽的活性穩(wěn)定性。因此，殼聚糖在制備保鮮涂抹液方面具有很大潛力。Pickering乳液與傳統(tǒng)乳液最大的不同在于乳化劑，Pickering乳液的乳化劑為固體顆粒，固體顆粒具有不可逆吸附的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)[22]。傳統(tǒng)乳液中的乳化劑通常會導(dǎo)致泡沫、空氣滯留、刺激性等問題，而固體顆粒乳化劑可以有效避免這些問題的產(chǎn)生[23]。此外，Pickering乳液還可以作為藥物和功能活性成分包封、傳遞和釋放的微載體，在制藥工程、食品加工等領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景[24]。

本團(tuán)隊(duì)前期從辣木籽蛋白水解物中分離鑒定出一種抗菌肽MOp2，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，有望應(yīng)用于食品的防腐保鮮。因此，本研究以包埋辣木籽抗菌肽MOp2的殼聚糖為固體顆粒，制備得到Pickering乳液，將Pickering乳液作為保鮮劑應(yīng)用于乳餅，通過測定理化、微生物及感官指標(biāo)，研究Pickering乳液對乳餅的保鮮效果，為后續(xù)乳餅的保藏提供一定的應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳餅 昆明加工作坊；大豆油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；殼聚糖 河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；辣木籽抗菌肽MOp2 安徽國平藥業(yè)有限公司。

可溶性淀粉、冰乙酸、無水硫酸鈉、三氯甲烷、碘化鉀、石油醚（沸點(diǎn)30～60 ℃）、硫代硫酸鈉（分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；煌綠乳糖膽鹽、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 山東海博生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF單人雙面超凈無菌操作臺 上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YMX-958-6L真空包裝機(jī) 泉州市億閩信貿(mào)有限公司；CR-400/410色彩色差儀 北京京海正通科技有限公司；AR224CN電子天平 深圳市德優(yōu)平科技有限公司；HPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱 無錫瑪瑞特科技有限公司；NAI-JZQ均質(zhì)器 上海那艾精密儀器有限公司；RE-52A1A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化精密科學(xué)儀器廠；BS1.6G3保鮮柜 富偉吉祥廚房設(shè)備有限公司；DHp-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將乳餅在無菌操作臺上切成3.5 cm×3.5 cm×0.5 cm、10 g大小的塊狀，分裝，分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組8 袋，每袋6 塊，約60 g，分別在貯藏0、3、7、14、21、28、35、42 d時測定指標(biāo)。

1.3.2 保鮮處理

對照組：真空包裝（乳餅→切割→真空包裝→4 ℃貯藏）。

實(shí)驗(yàn)組：Pickering乳液+真空包裝（乳餅→切割→配制保鮮液→涂抹保鮮涂抹液→真空包裝→4 ℃貯藏）。

Pickering乳液的制備：大豆油、水相質(zhì)量比為90∶10，抗菌肽-殼聚糖固體顆粒的添加量為1.75%、pH值為7，9 000 r/min均質(zhì)3 min。

將Pickering乳液倒入乳餅中并均勻涂抹，保證乳餅表面都均勻涂抹上乳液，然后將實(shí)驗(yàn)組與對照組在真空度為0.075 MPa條件下進(jìn)行包裝。

抗菌肽-殼聚糖固體顆粒的制備：

1）肽包埋的殼聚糖制備參考Pranantyo等[25]的方法并做適當(dāng)修改，將30 mg巰基殼聚糖溶解在6 mL去離子水中并過濾，將5 mg MOp2溶解在0.25 mL二甲基亞砜中，在磁力攪拌下加入到巰基殼聚糖濾液中反應(yīng)12 h，然后在去離子水中透析72 h進(jìn)行純化，得到的樣品冷凍干燥后4 ℃保存。

2）根據(jù)離子交聯(lián)法進(jìn)行固體顆粒的制備，將包埋肽的殼聚糖溶解在體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液中，制得質(zhì)量濃度2 mg/mL溶液，然后將pH值調(diào)節(jié)至4.8，在200 r/min的磁力攪拌下將1 mg/mL三聚磷酸鈉溶液緩慢加入上述溶液中并反應(yīng)8 h，將得到的固體顆粒懸浮液冷凍干燥并在4 ℃保存。

1.3.3 指標(biāo)測定

過氧化值的測定：根據(jù)GB/T 5538—2005《動植物油脂 過氧化值測定》的方法測定。

菌落總數(shù)的測定：根據(jù)GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》的方法測定。

大腸桿菌的測定：根據(jù)GB 4789.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸桿菌測定》的方法測定。

色差的測定：采用手持色差儀測定。取出待測樣品后，利用校色板校準(zhǔn)儀器，將待測樣品放置于手持色差儀正下方的色差屏圓孔下，用手按住防止漏光，然后在乳餅上選取3 個不同點(diǎn)測定，結(jié)果取平均值。

質(zhì)構(gòu)的測定：采用壓縮法對乳餅進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析，儀器參數(shù)設(shè)為：壓縮形變100%，測試速率5 mm/s，觸發(fā)力0.5 N，沿著乳餅的垂直方向進(jìn)行測試[26]。

感官評價：邀請15 名感官評價人員，根據(jù)干酪國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21375—2008《干酪（奶酪）》中感官評定指標(biāo)（稍作修改）對乳餅進(jìn)行評定，如表1所示。

表 1 乳餅感官評價表Table 1 Criteria for sensory evaluation of milk cake

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用Microsoft Office Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集整理，IBM SPSS Statistics 25軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳餅貯藏期間過氧化值的變化

影響油脂氧化的因素有油脂存放時間、光、熱等[27]，過氧化值是監(jiān)測脂質(zhì)氧化的常見指標(biāo)。由圖1可知，隨著貯藏時間的不斷延長，對照組與實(shí)驗(yàn)組乳餅過氧化值均呈現(xiàn)上升趨勢，在貯藏前7 d，實(shí)驗(yàn)組與對照組差異并不顯著，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組采用了真空包裝，一定程度上阻止了空氣與乳餅的直接接觸。從第7天開始，對照組與實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），較實(shí)驗(yàn)組而言，對照組過氧化值上升更明顯，這可能是由于Pickering乳液覆蓋在乳餅上，進(jìn)一步阻斷了乳餅與空氣和光的接觸[28]。

圖 1 乳餅貯藏期間的過氧化值Fig. 1 Change in peroxide value during milk cake storage

2.2 乳餅貯藏期間菌落總數(shù)的變化

由表2可知，隨著貯藏時間的不斷延長，不同組別乳餅的菌落總數(shù)出現(xiàn)顯著變化（P＜0.05）。貯藏7～14 d，對照組菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，這是因?yàn)槿轱炘谫A藏過程會產(chǎn)生乳酸菌與酵母菌，隨著其大量繁殖，乳餅的pH值不斷下降，導(dǎo)致不耐酸細(xì)菌死亡，菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢[29]。隨著貯藏時間延長，菌落再次出現(xiàn)增長趨勢。實(shí)驗(yàn)組貯藏42 d內(nèi)菌落總數(shù)顯著低于對照組，表明Pickering乳液中2 種抗菌成分抑制了微生物的增長。其中，殼聚糖通過阻止細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)來達(dá)到抑菌效果[30]。而抗菌肽則是通過擾亂細(xì)胞體內(nèi)的正常代謝活動，從而達(dá)到抗菌作用[31]。但在貯藏35 d以后菌落總數(shù)增長幅度變大，可能是因?yàn)镻ickering乳液中抗菌肽釋放完畢，乳液對微生物的抑制作用減弱。

表 2 乳餅貯藏過程中菌落總數(shù)變化Table 2 Changes in total viable count during milk cake storage 104 CFU/g

2.3 乳餅貯藏期間大腸桿菌數(shù)量的變化

由表3可知，隨著貯藏時間的延長，對照組在貯藏28 d時檢出大腸桿菌，這可能是由于在真空包裝的過程中空氣中含有大腸桿菌的芽孢進(jìn)入到了真空袋內(nèi)，導(dǎo)致大腸桿菌的出現(xiàn)。根據(jù)云南食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)DB S53/009—2016《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 乳餅》規(guī)定，乳餅中大腸桿菌含量不得超過103CFU/g，對照組在貯藏35 d時大腸桿菌超標(biāo)，而實(shí)驗(yàn)組并未檢出大腸桿菌，這是因?yàn)镻ickering乳液中的抗菌肽MOp2對大腸桿菌具有抑制作用，使其不能生長繁殖，從而延長了乳餅的貯藏時間。

表 3 乳餅貯藏過程中大腸桿菌數(shù)量的變化Table 3 Changes in E. coli count during milk cake storage 103 CFU/g

2.4 乳餅貯藏期間色差的變化

由圖2可知，乳餅的亮度值（L*）隨貯藏時間的延長而減小，從第7天開始，實(shí)驗(yàn)組與對照組出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），對照組下降趨勢明顯快于實(shí)驗(yàn)組，這是因?yàn)槿轱炠A藏過程中，在微生物與酶的共同作用下，脂肪與蛋白質(zhì)分別被水解為游離脂肪酸、低分子肽和氨基酸。由于影響光反射物質(zhì)的組成發(fā)生變化，導(dǎo)致L*不斷降低[32]，由于實(shí)驗(yàn)組涂抹了Pickering乳液，抑制了微生物的活動，進(jìn)而阻礙了脂肪與蛋白質(zhì)的水解，因此實(shí)驗(yàn)組下降趨勢比對照組慢。乳餅的黃度值（b*）隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。從第14天開始，實(shí)驗(yàn)組與對照組的b*呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），這是因?yàn)殡S著貯藏時間的延長，對照組中影響蛋白質(zhì)的微生物與酶發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變軟、崩解。另一方面，由于脂肪分解形成游離脂肪酸，而蛋白質(zhì)骨架松散無法固定脂肪，導(dǎo)致脂肪沉淀在乳餅中，而實(shí)驗(yàn)組因?yàn)镻ickering乳液中的抗菌肽發(fā)生作用，減緩了b*的上升趨勢，因此對照組b*增加趨勢顯著快于實(shí)驗(yàn)組[33]。

圖 2 乳餅貯藏期間L*（A）和b*（B）的變化Fig. 2 Changes in color parameters L* (A) and b* (B) during milk cake storage

2.5 乳餅貯藏期間質(zhì)構(gòu)特征的變化

由表4可知，2 組乳餅樣品的硬度隨著貯藏時間的延長均出現(xiàn)了先增大后降低的變化，其中對照組乳餅硬度下降較快，實(shí)驗(yàn)組硬度下降較為緩慢，且從貯藏21 d開始2 組之間具有顯著差異（P＜0.05）。這是由于剛開始乳餅柔軟而富有彈性，隨著貯藏時間的延長，乳餅中的水分逐漸減少而變硬，故硬度會有所上升，之后由于酶的作用，造成蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[34]，使乳餅內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得疏松，質(zhì)地發(fā)生軟化、彈性下降等一系列變化。實(shí)驗(yàn)組與對照組的黏附性不具有顯著差異。2 組樣品的回復(fù)性在貯藏過程中隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。

表 4 乳餅貯藏期間質(zhì)構(gòu)的變化Table 4 Changes in texture properties of milk cake during storage

2.6 乳餅貯藏期間感官品質(zhì)的變化

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，乳餅的感官發(fā)生了一定的變化，在貯藏前21 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與對照組在感官評分上相差不大，這是因?yàn)? 組都采用了真空包裝，在一定的時間內(nèi)可以防止乳餅的腐敗變質(zhì)，起到了一定的保鮮效果[35]。貯藏21 d后，實(shí)驗(yàn)組與對照組感官評分出現(xiàn)了明顯差異，這是因?yàn)殡S著時間的延長，真空包裝的保鮮效果逐漸降低，由于實(shí)驗(yàn)組涂抹了Pickering乳液，可以更好地起到抑菌效果，延長保質(zhì)期。貯藏42 d時對照組的感官總評分平均值為15.0 分，實(shí)驗(yàn)組為26.7 分，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組。

圖 3 乳餅貯藏期間的感官評分雷達(dá)圖Fig. 3 Radar map for sensory evaluation of milk cake during storage

3 結(jié) 論

為了延長乳餅的貯藏期，以包含辣木籽抗菌肽MOp2的殼聚糖固體顆粒為乳化劑制備Pickering乳液，通過不同理化指標(biāo)的測定，研究Pickering乳液對乳餅貯藏期間品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：涂抹Pickering乳液的實(shí)驗(yàn)組乳餅在貯藏42 d內(nèi)未出現(xiàn)腐敗變質(zhì)，其中前35 d內(nèi)感官品質(zhì)較好，未涂抹Pickering乳液的對照組乳餅在貯藏28 d時品質(zhì)開始下降，前21 d品質(zhì)較好；在整個貯藏期間，實(shí)驗(yàn)組乳餅的過氧化值和菌落總數(shù)的增長速率明顯低于對照組，且在貯藏28 d時對照組檢出大腸桿菌，35 d時對照組大腸桿菌超標(biāo)，而實(shí)驗(yàn)組并未檢測出大腸桿菌；同時，與對照組相比，Pickering乳液有效減緩了乳餅色差值與質(zhì)構(gòu)的變化。在整個貯藏期間，Pickering乳液減緩了乳餅過氧化值的增長，抑制了菌落總數(shù)和大腸桿菌的生長，減緩了色差值和質(zhì)構(gòu)的變化，有效延長了乳餅的貯藏期，可為后續(xù)乳餅的防腐保鮮提供一定的應(yīng)用參考。