子宮內(nèi)膜癌METTL14與核糖體蛋白基因的表達(dá)相關(guān)性分析

陳瑩瑩， 劉淑鵬， 程忠平

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer， EC)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,目前發(fā)病率居女性惡性腫瘤第2位[1]。據(jù)2015年國家癌癥中心統(tǒng)計，我國子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率為每10萬63人，死亡率為每10萬22人。隨著人口老年化的加劇，其發(fā)病率及死亡率都呈逐步上升的趨勢。子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以放療、化療、靶向治療和免疫治療等綜合治療。早期(FIGO分期Ⅰ或Ⅱ期)子宮內(nèi)膜癌患者的5年生存率能達(dá)到74%～91%，但晚期(FIGO分期Ⅳ期)患者僅為20%～26%[2]。進(jìn)一步揭示內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制有利于尋找新的治療方法以降低子宮內(nèi)膜癌的死亡率。

研究表明包括DNA/RNA甲基化、組蛋白修飾等在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。多個表觀遺傳學(xué)相關(guān)分子被證實(shí)與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)，相應(yīng)的靶向藥物為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的方法和手段[3]。m6A修飾是RNA分子腺嘌呤的第6位氮原子發(fā)生甲基化修飾。修飾過程由甲基化轉(zhuǎn)移酶(比如METTL3、METTL14、WTAP、CBLL1、ZC3H13、VIRMA等)、去甲基化酶(比如FTO、ALKBH5)和甲基化閱讀蛋白(YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2等)共同參調(diào)控。有研究報道，RNA的m6A甲基化修飾能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[4]，這為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的思路。

METTL14作為m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，能夠穩(wěn)定METTL3的構(gòu)象以提高其催化活性，在m6A甲基化過程中至關(guān)重要[5]。METTL14基因點(diǎn)突變可導(dǎo)致m6A甲基化異常，引起腫瘤發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)異常、胚胎發(fā)育遲緩等[5]。在子宮內(nèi)膜癌患者中，約1.5%的患者攜帶METTL14突變，突變位點(diǎn)主要發(fā)生在298位[6]。Liu等[4]通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了METTL14突變促進(jìn)內(nèi)膜癌進(jìn)展的作用。METTL14突變降低了PHLPP2和mTORC2的m6A甲基化水平，從而促進(jìn)PHLPP2的翻譯和mTORC2的降解，激活了AKT通路，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展。

核糖體是蛋白質(zhì)翻譯的場所，其生物發(fā)生是一個高度有序的過程。在應(yīng)激情況下，核糖體活性降低，蛋白質(zhì)合成減少，細(xì)胞的生長受到抑制[7]。核糖體蛋白(ribosomal proteins, RPs)是核糖體的重要組成成分，參與核糖體組裝及rRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性調(diào)控，從而保證翻譯效率和準(zhǔn)確性。研究表明，RPs在細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[7]。其在m6A修飾中的作用及兩者在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)性未見相關(guān)報道。

本研究在公共數(shù)據(jù)庫TCGA中內(nèi)膜癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法分析了METTL14與核糖體蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)相關(guān)性，嘗試從組學(xué)層面探討m6A修飾及核糖體蛋白表達(dá)調(diào)控與子宮內(nèi)膜癌之間的相關(guān)性，為后續(xù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

所有mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)均來自于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)TCGA-UCEC，并從Genomic Data Commons(GDC)(https：∥portal.gdc.cancer.gov/)下載了mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。應(yīng)用cBioPortal平臺[8-9]對mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因(DEGs) 根據(jù)METTL14的表達(dá)水平將內(nèi)膜癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。分組后的mRNA數(shù)據(jù)使用DESeq2包[10]進(jìn)行歸一化和差異表達(dá)分析。表達(dá)水平變化超過1.5倍且調(diào)整后P<0.05的基因被認(rèn)為是顯著性差異表達(dá)基因。

1.2.2 DEGs的功能富集分析 利用在線基因注釋和分析資源Metascape(http：∥metascape.org)對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。通過基因本體論(Gene Ontology biological process， GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)富集分析差異表達(dá)基因的潛在生物學(xué)功能。

1.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析 STRING數(shù)據(jù)庫用于識別差異基因之間的潛在相互作用。置信度P≥0.4的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network， PPI)導(dǎo)入Cytoscape以構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)。使用分子復(fù)合物檢測(molecular complex detection， MCODE)插件及其默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)中的聚類模塊分析[11]。根據(jù)cytoHubba 5個拓?fù)涮卣?MCC、DMNC、MNC、degree和EPC)，作為PPI網(wǎng)絡(luò)的過濾標(biāo)準(zhǔn)。在所有5個過濾標(biāo)準(zhǔn)中均排名前30位的基因作為PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(購自BI，北美)和1%雙抗的McCoy’s 5A(Gibco,美國)培養(yǎng)基，在含0.5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1-A細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞長至80%左右匯合度時，進(jìn)行傳代和換液。

1.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將HEC-1-A細(xì)胞鋪于六孔板(3×105細(xì)胞/孔)中。過夜培養(yǎng)后，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(Thermo Scientific,美國)轉(zhuǎn)染METTL14過表達(dá)質(zhì)粒(pLV-EF1α-EGFP-RF-METT-L14)，以空載作為對照進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h后換液，48 h收細(xì)胞，進(jìn)行RNA提取并實(shí)時定量PCR檢測基因表達(dá)。

1.2.6 實(shí)時定量PCR 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa公司，日本)合成cDNA。采用SYBR Primer ExTaqTm試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR。用β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

表1 本文相關(guān)的引物序列Tab.1 Relevant primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析采用log-(P value)計算并可視化。利用Graph Pad 8.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并作圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌中METTL14相關(guān)差異基因篩選結(jié)果

METTL14作為m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的主要組成部分，與其他甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用，參與了多種生物學(xué)過程[12]。根據(jù)METTL14的表達(dá)量，將來自于TCGA-UCEC隊列中的521個子宮內(nèi)膜癌樣本分為METTL14高表達(dá)組(228例患者)和METTL14低表達(dá)組(293例患者)，隨后對METTL14高、低表達(dá)組進(jìn)行差異表達(dá)基因分析和功能富集分析，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，從而得到關(guān)鍵基因，見圖1A。DESeq2差異表達(dá)基因分析顯示，與METTL14高表達(dá)組相比，METTL14低表達(dá)組中有757個差異表達(dá)基因，其中有665個基因下調(diào)，92個基因上調(diào)，見圖1B～C。

圖1 METTL14差異基因的分析Fig.1 Analysis of METTL14 differential genesA： 基于METTL14的生信分析示意圖；B： METTL14-低表達(dá)組與METTL14高表達(dá)組在子宮內(nèi)膜癌中前180個差異表達(dá)基因的熱圖；C： 子宮內(nèi)膜癌中METTL14低表達(dá)組與METTL14高表達(dá)組差異表達(dá)基因的火山圖；紅色表示上調(diào)的基因個數(shù)，藍(lán)色表示下調(diào)的基因個數(shù)

2.2 GO生物學(xué)過程分析和KEGG通路富集分析

Metascape數(shù)據(jù)庫對METTL14相關(guān)DEGs進(jìn)行GO生物學(xué)過程和KEGG功能富集分析。GO生物學(xué)過程分析顯示METTL14低表達(dá)組中下調(diào)的基因主要富集于病毒防御反應(yīng)、核染色體分離、姐妹染色單體分離、染色體定位、DNA代謝過程調(diào)控、細(xì)胞器定位、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、生殖細(xì)胞發(fā)育、繁殖相關(guān)發(fā)育等生物過程，KEGG富集分析沒有明顯的信號通路富集(圖2A)，在METTL14低表達(dá)組上調(diào)的基因主要富集于氧化磷酸化、細(xì)胞外基質(zhì)組織、SRP依賴的共翻譯蛋白的膜定位、血管發(fā)育等生物過程，KEGG主要富集于核糖體生物發(fā)生和氧化磷酸化等信號通路(圖2B)。METTL14低表達(dá)組中上調(diào)基因的GO和KEGG富集分析結(jié)果提示在子宮內(nèi)膜癌中METTL14低表達(dá)與核糖體的生物發(fā)生和氧化磷酸化有關(guān)。

圖2 METTL14差異基因相關(guān)的GO生物過程分析和KEGG功能富集分析Fig.2 GO bioprocess analysis and KEGG functional enrichment analysis associated with METTL14 differential genesA： METTL14高表達(dá)組的差異表達(dá)基因的GO生物過程分析；B： METTL14低表達(dá)組的差異表達(dá)基因的GO生物過程分析和KEGG功能富集分析

2.3 子宮內(nèi)膜癌中METTL14與核糖體生物發(fā)生具有相關(guān)性

為了進(jìn)一步探討METTL14與核糖體生物發(fā)生之間的潛在相關(guān)性，使用STRING數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，繪制以METTL14為核心的PPI網(wǎng)絡(luò)，并對其進(jìn)行MCODE和cytoHubba分析，然后經(jīng)過功能富集分析，篩選出關(guān)鍵的基因(圖3A)?；谒胁町惢虻腜PI網(wǎng)絡(luò)(圖3B)，MCODE分析確定了評分最高的基因模塊1(Module 1)。模塊1包含31個中心節(jié)點(diǎn)基因下調(diào)，分別是KCNC4、SSR4、HSPBP1、RPL13、PLEC、FAU、RPL28、RPL18、RPL18A、RPS28、RPLP2、RPLP1、RPL35、RPS26、RPS15、UBBP4、GNB2L1、RPS11、RPL8、RPS14、RPS21、RPS2、RPS11、UBA52、UBC、SIL1、RPL12、SIL1、KCNC3、RPSAP58、RPL39，其中RPSAP58和RPL39，其他基因表達(dá)上調(diào)(圖3C)。對模塊1中的這些基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要富集于SRP依賴的共翻譯蛋白的膜定位、靶向膜的共翻譯蛋白、核轉(zhuǎn)錄mRNA分解代謝過程和rRNA加工等生物過程，涉及到核糖體生物發(fā)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等信號通路，見圖3D。

圖3 METTL14相關(guān)差異基因的蛋白互作和富集分析Fig.3 Protein interactions and enrichment analysis of METTL14-related differential genesA： PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因確定的數(shù)據(jù)分析示意圖；B： PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；紅色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)基因，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表下調(diào)基因；C： MCODE分析中評分最高的模塊1；D： 模塊1中基因的GO和KEGG富集分析

2.4 子宮內(nèi)膜癌中METTL14與核糖體蛋白呈負(fù)相關(guān)

由以上的結(jié)果，本課題組推測METTL14可能與所有核糖體亞基的功能均相關(guān)。對METTL14及核糖體蛋白相關(guān)基因進(jìn)行了共表達(dá)分析。結(jié)果顯示，在203種核糖體蛋白相關(guān)基因中，超過80%基因顯示出顯著的負(fù)相關(guān)性，25%基因的相關(guān)性系數(shù)介于-0.67和-0.4之間(圖4A)。模塊1中的8個核糖體蛋白關(guān)鍵候選基因與METTL14的相關(guān)系數(shù)均在0.4左右，見圖4B，且這8個基因在內(nèi)膜癌中發(fā)生了突變，見圖4C。將這8個基因與METTL14進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)這8個基因均與METTL14呈負(fù)相關(guān)(RPL18：R=-0.61，P<0.001；RPL18A：R=-0.4,P<0.001；RPL28：R=-0.66,P<0.001；RPL35：R=-0.51,P<0.001；RPL36：R=-0.51,P<0.001；RPLP2：R=-0.59,P<0.001；RPS21：R=-0.48,P<0.001；RPS28：R=-0.29,P<0.001)，見圖4D。

圖4 METTL14與核糖體蛋白基因的相關(guān)性Fig.4 Correlation of METTL14 with ribosomal protein genesA： 共表達(dá)分析顯示METTL14和核糖體蛋白相關(guān)基因表達(dá)上具有負(fù)相關(guān)性；R： Spearman秩相關(guān)系數(shù)；B： 8個RP與其他核糖體蛋白(ribosomal proteins， RP)及METTL14之間的表達(dá)相關(guān)系數(shù)，R： Spearman秩相關(guān)系數(shù)，所有數(shù)據(jù)均為絕對值；C： 子宮內(nèi)膜癌中8個RP的基因突變情況；D： 子宮內(nèi)膜癌中METTL14與8種核糖體蛋白之間的共表達(dá)情況

2.5 子宮內(nèi)膜癌中METTL14與核糖體蛋白基因在mRNA水平上呈負(fù)相關(guān)

為了驗(yàn)證METTL14與核糖體蛋白相關(guān)基因在內(nèi)膜癌中表達(dá)相關(guān)性，本研究用內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1-A進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先，采用過表達(dá)質(zhì)粒及shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法對METTL14基因進(jìn)行過表達(dá)和敲減。在過表達(dá)和敲減成功的基礎(chǔ)上(圖5A和C)，檢測METTL14過表達(dá)和敲減之后核糖體蛋白相關(guān)基因的mRNA表達(dá)情況。在METTL14過表達(dá)組中，RPL28(P=0.000 5)和RPL36(P<0.000 1)的mRNA水平較對照組表達(dá)水平下調(diào)，而RPL35(P=0.853)、RPLP2(P=0.962)、RPS21(P=0.011)和RPS28(P=0.089)的mRNA水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5B。RPL18(P=0.023 4)和RPL18A(P=0.007 2)的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在METTL14敲減組中，RPL28(P<0.000 1)和RPL36(P=0.002 9)的mRNA水平較對照組表達(dá)水平上調(diào)，而RPL18(P=0.140)、RPL18A(P=0.326)、RPL35(P=0.008)、RPLP2(P=0.104)、RPS21(P=0.332)和RPS28(P=0.251)的mRNA水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5D。由此可見，體外內(nèi)膜癌細(xì)胞系中RPL28和RPL36這2個基因均與METTL14的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其他6個基因無明顯相關(guān)性。

圖5 METTL14與核糖體相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證Fig.5 qPCRvalidation of METTL14 and ribosome-related genesA： METTL14過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后METTL14表達(dá)，***P<0.001；B： METTL14過表達(dá)后8個核糖體蛋白相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量；C： METTL14敲減質(zhì)粒(shRNA2)后METTL14表達(dá)水平；D： METTL14表達(dá)降低后8個核糖體蛋白相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

以上結(jié)果顯示METTL14在子宮內(nèi)膜癌中與核糖體蛋白呈負(fù)相關(guān)。這提示METTL14在子宮內(nèi)膜癌中的作用可能通過調(diào)節(jié)核糖體的生物發(fā)生來發(fā)揮作用。

3 討 論

m6A甲基化是最常見的RNA修飾，是發(fā)育和疾病的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控機(jī)制[13]，其在不同癌癥中的生物學(xué)功能和潛在機(jī)制各不相同。在本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌中，m6A通路相關(guān)調(diào)控基因METTL14表達(dá)與核糖體蛋白之間存在負(fù)相關(guān)性，METTL14下調(diào)可能促進(jìn)核糖體生物發(fā)生，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。

Liu等[4]報道70%的子宮內(nèi)膜癌患者的m6A甲基化水平降低，促進(jìn)腫瘤的增殖。METTL14的功能缺失/突變或METTL3的下調(diào)可通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的AKT活性來促進(jìn)腫瘤的增殖和發(fā)生[4]。經(jīng)過生信分析發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白基因的表達(dá)與METTL14表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示核糖體生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成可能是METTL14作用機(jī)制之一。

核糖體生物合成作為細(xì)胞增殖和生長的重要生物學(xué)過程，能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的存活、增殖、生長、侵襲和耐藥性，其在腫瘤中廣泛失調(diào)[14]。核糖體亞基的基因改變在腫瘤中也很常見[15]。因此，許多核糖體蛋白，例如RPL36、RPL28、RPL18和RPLP2，可作為腫瘤診斷和/或預(yù)后的潛在標(biāo)志物[16]。本研究經(jīng)過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)核糖體基因和METTL14之間在表達(dá)上存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，提示兩者之間存在可能的調(diào)控作用。但m6A通路調(diào)節(jié)核糖體的生物發(fā)生是否與核糖體的mRNA甲基化直接相關(guān)仍需進(jìn)一步探討。根據(jù)m6A結(jié)合蛋白(甲基化閱讀器)的不同，m6A甲基化可使mRNA的穩(wěn)定性降低或增強(qiáng)，也可影響mRNA的翻譯、剪接或核轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。本研究生信分析發(fā)現(xiàn)METTL14與8個RPs相關(guān)的基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，細(xì)胞系中驗(yàn)證僅有RPL28和RPL36基因表達(dá)與METTL14呈負(fù)相關(guān)。這提示在研究METTL14與核糖體蛋白的關(guān)系時，應(yīng)考慮甲基化結(jié)合蛋白在此過程中發(fā)揮的作用。

此外，越來越多的研究表明不同類型的細(xì)胞的RNA均存在廣泛的m6A甲基化修飾[18]，m6A通路可以通過影響RNA穩(wěn)定性調(diào)控細(xì)胞代謝和細(xì)胞周期。本研究發(fā)現(xiàn)除了核糖體相關(guān)基因外，與線粒體相關(guān)的基因，尤其是氧化磷酸化、血管生成和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用有關(guān)的通路，在子宮內(nèi)膜癌中也受到METTL14失調(diào)的影響。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜癌中，METTL14與核糖體蛋白在mRNA表達(dá)水平上呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，核糖體相關(guān)機(jī)制可能是m6A甲基化通路作用于子宮內(nèi)膜癌中的途徑之一，這為后續(xù)子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)機(jī)制研究提供了潛在數(shù)據(jù)支撐，并為臨床診療提供了潛在的分子靶點(diǎn)。