Fbxl10通過PI3K途徑促進肺癌細胞增殖和侵襲

顧金香， 李凱銳， 吳家濤， 王璐瑤， 武世伍

(1. 蚌埠醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理學系，安徽 蚌埠 233034； 2. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，安徽 蚌埠 233034)

肺癌是威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居高不下。根據(jù)組織病理學特點，肺癌主要分為非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)兩種類型，NSCLC占肺癌的80%。腫瘤細胞轉移是肺癌的惡性生物學特征之一，也是臨床治療失敗的原因之一，發(fā)生轉移的患者已處于腫瘤的晚期而失去了手術的機會[1]?；熢侵委烴SCLC的常用方法，但其副作用大，部分患者療效不確定。隨著細胞和分子生物技術的迅速發(fā)展，對患者關鍵基因和調控分子進行個體化干預成為治療熱點[2]。

組蛋白去甲基化酶Fbxl10是泛素連接酶(Skp1-Cullin-F-box, SCF)復合體中的一種受體蛋白，它通過泛素化降解目標分子從而調控細胞的生物學過程[3]。近年來，F(xiàn)bxl10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展受到關注。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)bxl10參與了前列腺癌[4]、胃癌[5]、結腸癌[6]以及肺鱗癌[7]等多種腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程。Fbxl10對肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制尚不完全清楚，本研究通過細胞分子生物學技術探索Fbxl10在肺腺癌細胞中的表達和生物學作用以及潛在的作用機制，以期為肺腺癌治療的新靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與主要儀器

Fbxl10過表達質粒、陰性對照質粒、Fbxl10 siRNA購自上海吉凱基因科技有限公司；Lipo-fectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Fbxl10抗體購自美國Affinity Biosciences公司；PI3K抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；TRIzol試劑、反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR擴增實驗試劑盒購自北京全式金生物技術公司；胎牛血清購自美國Clark Bioscience公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Transwell小室、基質膠購自美國BD公司；結晶紫溶液購自上海碧云天生物科技有限公司。

倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；生物安全柜購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；高速離心機購自德國Eppendorf公司；微型離心機購自美國AndyBio公司；PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司；酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2 實驗分組

肺腺癌細胞株H1299(購自上海信裕生物科技有限公司)分為4組?？瞻讓φ战M(Ctrl組): H1299肺腺癌細胞株，不作任何處理；陰性質粒對照組(NC組): 使用沒有連接目的基因Fbxl10的質粒轉染肺腺癌H1299細胞株；過表達組(Fbxl10OE組): 使用成功整合目的基因Fbxl10的質粒轉染至肺腺癌H1299細胞株；干擾組(siFbxl10組): 使用RNA干擾技術特異性剔除目的基因Fbxl10，脂質體法轉染至肺腺癌H1299細胞株。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和細胞轉染 在RPMI 1640培養(yǎng)基中添加10%濃度的血清和1%青霉素-鏈霉素，配成完全培養(yǎng)基，將肺腺癌細胞H1299株放入含5%CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液，待細胞長至75%以上后進行傳代處理。細胞轉染: 消化后收集細胞，將細胞充分混勻后計數(shù)，接種于六孔板內，每孔約2×105細胞，24 h后待細胞長至70%～90%匯合度轉染為NC組、Fbxl10OE組和siFbxl10組，轉染過程嚴格按照Lipofectamine 3000說明書進行操作，在熒光顯微鏡下觀察轉染情況，2～3 d完成轉染。

1.3.2 細胞克隆形成實驗 細胞轉染36 h后收集細胞并計數(shù)，六孔板每個孔內接種500個細胞，期間每隔2～3 d換液1次，并觀察克隆形成情況，2周后顯微鏡下觀察到有明顯的克隆群落形成，倒掉孔內培養(yǎng)液，PBS洗2遍，0.1%結晶紫溶液染色25 min，純水沖洗六孔板后拍照。Image J軟件處理圖片轉換為數(shù)據(jù)并作柱狀圖分析。

1.3.3 MTT法測細胞增殖活力 細胞轉染后36 h收集細胞并計數(shù)，96孔板每孔接種5 000個細胞，設置4個復孔，72 h后每孔加20 μL加MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內含有MTT的培養(yǎng)液，每孔加200 μL DMSO溶液，置搖床低速振蕩20 min，讓其充分溶解甲臜結晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各個孔的光密度(D490)值。

1.3.4 細胞劃痕愈合實驗 細胞轉染于六孔板36 h，用10 μL白吸頭在六孔板內小心地劃一條直線(記為0 h)，然后在顯微鏡下拍劃痕的孔隙照片，保存圖片。于劃痕24 h后觀察細胞的遷移及愈合情況(記為24 h)，在顯微鏡下拍照，保存圖片用Image J軟件處理圖片轉換為數(shù)據(jù)并作柱狀圖分析。

1.3.5 Transwell遷移和侵襲實驗 將細胞轉染36 h后的各組細胞用胰酶消化2 min，再加RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心2 min，用RPMI 1640培養(yǎng)基混懸細胞沉淀，再用細胞計數(shù)板計數(shù)，加RPMI 1640培養(yǎng)基反復吹打充分混勻后，將細胞密度分別調整至1×105/mL和2.5×105/mL，用于Transwell遷移實驗和侵襲實驗。小室上室加入200 μL細胞懸液，下室加入800 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，棄掉其中的培養(yǎng)基，放回24孔板，再加PBS輕柔潤洗2次，用棉簽輕輕擦掉上室細胞，加4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，棄去后加0.1%結晶紫溶液染色20 min，棄去后加PBS清洗2次，室溫干燥。顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照，保存圖片，用Image J軟件統(tǒng)計小室細胞的遷移數(shù)，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.3.6 實時熒光定量PCR分析(qRT-PCR) 將轉染后的Fbxl10OE組、siFbxl10組、NC組和未轉染的Ctrl組分別進行RNA提取。使用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，加氯仿萃取，使其分層，再用異丙醇、乙醇提純，最后加適量的DEPC水稀釋為合適的濃度，再按照試劑盒說明書進行反轉錄成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書PCR的擴增過程，上機檢測循環(huán)過程的熒光，收集熒光數(shù)據(jù)進行后續(xù)的分析。結果用2-ΔΔCt法解釋。使用Primer 5.0設計引物見表1。實驗重復3次。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.3.7 Western印跡實驗 將轉染后的Fbxl10OE組、siFbxl10組、NC組和未轉染的Ctrl組分別進行總蛋白提取。收集轉染后的細胞，加RIPA和PMSF混合裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，用吸頭反復吹打至拉絲為止，然后放在冰上裂解30 min，期間每隔10 min渦旋振蕩15 s，4 ℃預冷，12 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心15 min，BCA試劑盒進行蛋白定量檢測。根據(jù)所測濃度加樣后進行SDS-PAGE電泳，電泳過后轉膜至PVDF膜，無蛋白快速封閉液封閉10 min，一抗孵育12～15 h(4 ℃冰箱)，第2天用TBST洗膜3次，每次10 min，再進行室溫孵育二抗2 h，發(fā)光液按照1∶1比例配成后讓條帶顯影，用化學發(fā)光儀對條帶進行曝光掃描，Image J軟件計算灰度值比值進行蛋白表達的相對定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 細胞克隆實驗

通過脂質體轉染法將過表達質粒、陰性質粒和干擾RNA，分別轉染至肺癌H1299細胞，轉染后檢測H1299細胞的克隆形成群落數(shù)情況，用Image J軟件進行分析，以陰性質粒組為對照組，結果顯示，F(xiàn)bxl10OE組形成的克隆群落數(shù)比NC組多[(36.792±0.003)vs(15.098±0.982)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，siFbxl10組形成的克隆群落數(shù)比NC組少[(5.021±0.925)vs(15.098±0.982)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。上調Fbxl10表達，H1299細胞的克隆形成能力增強，群落數(shù)增多；下調其表達，則H1299細胞的克隆形成能力減弱，群落數(shù)減少，見圖1A。

2.2 MTT實驗

MTT實驗結果顯示，在H1299細胞中分別轉染過表達質粒、陰性質粒和干擾RNA，以陰性質粒組為對照組，F(xiàn)bxl10OE組的D490高于NC組[(1.073 8±0.359 1)vs(0.712 9±0.073 2)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，siFbxl10組的D490低于NC組[(0.426 7±0.844 2)vs(0.712 9±0.073 2)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明上調Fbxl10表達，H1299細胞的增殖活力增強，下調其表達，則H1299細胞的增殖活力被抑制，見圖1B。

圖1 各組肺癌細胞克隆增殖實驗及細胞活力實驗Fig.1 Overexpression of Fbxl10 promoted the clonal proliferation and cell viability of lung cancer cellsA: 各組肺癌H1299細胞的克隆實驗；B: 各組克隆實驗及MTT實驗比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 細胞劃痕愈合實驗

通過脂質體轉染法將過表達質粒、陰性質粒和干擾RNA分別轉染至肺癌H1299細胞，觀察上調或下調Fbxl10后肺癌H1299細胞的生長情況，24 h 后拍照觀察其劃痕愈合情況，檢測其遷移能力。與NC組相比，F(xiàn)bxl10OE組的愈合遷移距離明顯增加[(375.7±3.4)vs(121.8±6.6)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而siFbxl10組愈合遷移距離明顯減少[(36.3±7.9)vs(121.8±6.6)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。細胞劃痕實驗結果說明，上調Fbxl10，H1299細胞的遷移形成能力增強，下調Fbxl10則H1299細胞的遷移形成能力減弱，見圖2A。

2.4 Transwell遷移和侵襲實驗

通過脂質體轉染法將過表達質粒、陰性質粒和干擾RNA分別轉染至肺癌H1299細胞，觀察上調或下調Fbxl10后肺癌H1299細胞的生長情況。轉染后，用Transwell遷移和侵襲實驗檢測H1299細胞的遷移和侵襲能力。Transwell遷移實驗顯示、Fbxl10OE組透過小室的細胞數(shù)比NC組多[(327.5±9.2)vs(187.7±13.6)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；siFbxl10組透過小室的細胞數(shù)比NC組少[(84.2±4.9)vs(187.7±13.6)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Transwell侵襲實驗顯示，F(xiàn)bxl10OE組透過Matrigel基質膠的細胞數(shù)比NC組多[(180.9±12.4)vs(120.3±4.7)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而siFbxl10組透過Matrigel基質膠的細胞數(shù)比NC組少[(37.3±6.5)vs(120.3±4.7)，n=3]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Transwell侵襲實驗結果說明，上調Fbxl10表達，H1299細胞的遷移、侵襲能力增強，下調其表達，則H1299細胞的遷移、侵襲能力減弱，見圖2B。

圖2 各組劃痕、遷移和侵襲實驗結果Fig.2 Fbxl10 promoted the migration and invasion of lung cancer cellsA: 各組H1299細胞劃痕愈合實驗；B: 各組H1299細胞的Transwell遷移和侵襲實驗(結晶紫染色)

2.5 qRT-PCR實驗和Western印跡實驗

通過脂質體轉染法將過表達質粒、陰性質粒和干擾RNA分別轉染至肺癌H1299細胞，結果如圖3A、B所示，qRT-PCR實驗及Western免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，轉染過表達質粒時成功上調H1299細胞中Fbxl10 mRNA和蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；敲低其表達時也成功下調H1299細胞中Fbxl10 mRNA和蛋白的表達(P<0.01)。而隨著Fbxl10表達上調，PI3K蛋白表達也上調(P<0.01)，qRT-PCR結果顯示，隨著Fbxl10上調，PI3K mRNA水平也相應增高(P<0.01)，但蛋白表達差異不明顯，見圖3。

圖3 Fbxl10過表達后Fbxl10及PI3K表達均增加Fig.3 After H1299 cells was transfected with Fbxl10OE, both Fbxl10 and PI3K expressions increasedA: H1299細胞中Fbxl10和PI3K相對mRNA表達；B: H1299細胞中Fbxl10和PI3K相對蛋白的表達；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

3 討 論

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，5年生存率約為6%。肺癌的組織學類型中約80%為NSCLC，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma, LA)是NSCLC的主要亞型，具有獨特的組織學特征,與肺鱗狀細胞癌相比，更容易發(fā)生早期轉移。尤其是中低分化腺癌，通常被診斷時已發(fā)生了遠處轉移，局部更容易對正常肺組織形成侵襲和破壞。在過去的幾十年里，靶向治療和免疫治療已被廣泛應用于NSCLC的治療。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些靶向治療肺腺癌的驅動基因，但由于肺癌的表型特征較多，需要研究和發(fā)現(xiàn)更多的靶向驅動基因以滿足個體化治療的需要。表觀遺傳因子在肺癌的精準診斷和個體化治療上已經(jīng)引起了關注[8]，F(xiàn)bxl10對肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制目前尚不完全清楚。

Fbxl10是一種組蛋白去甲基化酶，是二甲基和三甲基H3K79脫甲基酶[9]。表觀遺傳學(epigenetics)修飾包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、核小體定位和非編碼RNA調控的轉錄后基因調控。其中，目前研究最深入的是DNA甲基化和組蛋白修飾[10]。組蛋白的修飾包括磷酸化、甲基化、泛素化和乙?；?，其中組蛋白甲基化修飾在轉錄后調控過程中起重要作用。Fbxl10是JmjC家族的重要成員，在哺乳動物細胞中普遍表達[11]，F(xiàn)bxl10除含有JmjC結構域外，還含有一個CXXC-zinc-finger結構域、PHD結構域(plant homeodomain)、F-box結構域和富含亮氨酸的重復結構域[12-13]。JmjC結構域是其發(fā)揮去甲基化酶活性所必需的，F(xiàn)bxl10通過CXXC鋅結構域募集多梳抑制復合物1(polycomb repressive complexes 1, PRC1)到未甲基化CpG區(qū)來影響DNA甲基化和基因沉默[14]。Fbxl10是泛素連接酶SCF復合體中的一種受體蛋白，它通過泛素化降解目標分子而發(fā)揮調控細胞生物學過程的作用。

在細胞的正常生理代謝中，F(xiàn)bxl10可以發(fā)揮多種調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)轉染Fbxl10過表達質粒時成功上調H1299細胞中Fbxl10 mRNA或蛋白的表達；轉染Fbxl10干擾RNA時也成功下調H1299細胞中Fbxl10 mRNA或蛋白的表達。本研究發(fā)現(xiàn)與NC組比較，過表達Fbxl10時，PI3K的mRNA或蛋白也隨之而升高，敲低Fbxl10時，PI3K的mRNA或蛋白也隨之而下降。過表達Fbxl10后，該腫瘤細胞的增殖、遷移能力增強，敲低表達后則作用相反。因此設想，F(xiàn)bxl10促進癌細胞增殖和侵襲能力有可能是通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路實現(xiàn)的[5]。

PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，多年來，它在健康和疾病方面的功能一直是研究的焦點[15-16]。PI3K/AKT/mTOR信號通路也是抗癌藥物開發(fā)的主要靶點[17]。研究發(fā)現(xiàn)，使用PI3K激活劑SLC39A5，可以激活PI3K/AKT信號通路在肺腺癌中發(fā)揮致癌作用[18]。PI3K/mTOR通路可能是參與肺癌進展的一個關鍵機制。考慮到Fbxl10在腫瘤發(fā)展中的關鍵作用，本研究通過過表達Fbxl10后，PI3K表達量也相應增加，F(xiàn)bxl10可能通過靶向PI3K/mTOR途徑在肺腺癌進展中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)[7]，F(xiàn)bxl10可以通過調節(jié)雷帕霉素通路的磷脂酰肌醇3-激酶/AKT/哺乳動物靶蛋白，抑制糖酵解并誘導肺鱗癌細胞自噬；敲除Fbxl10可抑制肺鱗癌的體外細胞增殖和體內腫瘤生長[7]。本研究細胞學實驗顯示，在肺腺癌細胞中過表達Fbxl10，可以促進肺腺癌細胞株H1299的增殖、遷移和侵襲能力，同時也可以促進PI3K的表達，由此推測，F(xiàn)bxl10促進癌細胞增殖和侵襲能力有可能通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路實現(xiàn)的。這也是該基因對肺癌的調控作用的一種補充。

H1299細胞系是從NSCLC患者的肺細胞中建立的，廣泛應用于生物醫(yī)學研究，作為一種永生化細胞系，可以無限地分裂。本研究結果提示Fbxl10在肺癌細胞的侵襲、轉移中起重要作用，F(xiàn)bxl10有望成為抗腫瘤轉移治療的潛在靶點。未來研究的重點是進一步對Fbxl10的結構、功能及作用機制進行深入探討，以及對其抑制劑開展研究，為Fbxl10最終成為抗肺腺癌轉移治療的新靶標打下堅實的基礎。