人臍帶間充質(zhì)干細胞對異體人外周血單個核細胞的免疫調(diào)節(jié)作用

陳耐寒，趙仁彬，孫鷖，李麗，鄭永欽，左榮霞，張進萍，趙倩，沈濤，撒亞蓮

1.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院云南省第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心 云南省出生缺陷與遺傳病研究重點實驗室云南省臨床病毒學(xué)重點實驗室，云南昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院國家臨床重點專科血液科，云南 昆明 650032；3.云南省第一人民醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650032

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，免疫原性低，具有獨特的免疫調(diào)節(jié)特性［1-2］。近年來相繼從骨髓、脂肪、皮膚、外周血、牙髓、肌腱，以及新生兒附屬組織，如臍帶、胎盤、羊膜等組織中獲取MSCs，其中人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）因來源充足，取材方便，且無明顯的倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，成為臨床細胞治療研究的一個熱點［1-3］。

已有研究表明，MSCs 具有支持造血和免疫重建，以及在組織損傷修復(fù)與再生、自身免疫性疾病中有一定的治療作用［4］。目前在Clinicaltrials.gov 注冊的臨床試驗針對的適應(yīng)癥主包括移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）、膝骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、狼瘡性腎炎、銀屑病、早發(fā)性卵巢功能不全、燒傷、脊髓損傷、心肌梗塞以及肝硬化等疾?。?-6］。古利明等［7］觀察到hUC-MSCs 聯(lián)合抗病毒等方法在控制新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）重癥患者的炎癥反應(yīng)和組織損傷中安全有效。然而，MSCs 的臨床療效與適應(yīng)癥、治療方案、不同研究者使用的MSCs 質(zhì)量等密切相關(guān)，其中，MSCs 的質(zhì)量屬性是比較分析不同研究者研究結(jié)果的基本要素。免疫調(diào)控能力是評價MSCs 生物學(xué)有效性最為相關(guān)的重要質(zhì)量屬性之一［8-9］，通過檢測MSCs 釋放免疫調(diào)控分子、抑制促炎性免疫細胞增殖或活性、促進調(diào)節(jié)性免疫細胞增殖或極化的功能，以及MSCs 自身分泌不同類型免疫調(diào)控因子的能力等進行評價。本研究通過檢測hUC-MSCs 對異體人PBMCs 增殖能力及其CD4+CD25+CD127dim／-調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）亞群分化能力的影響，探討hUC-hMSCs 的免疫調(diào)節(jié)特性，為建立MSCs制劑質(zhì)量評價技術(shù)體系和提高實驗室檢測技術(shù)能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞及外周血 原代hUC-hMSCs 來自健康足月剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦提供的新生兒臍帶，孕婦均簽署知情同意書。提供；健康體檢人群外周血由昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院提供。本研究獲得昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準，樣本捐獻者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 淋巴細胞分離液（LSM-200）購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）（20200108）購自廣州達暉生物技術(shù)服務(wù)有限公司；胎牛血清（1932595）購自美國Gibco 公司；低糖DMEM 培養(yǎng)基（AD17218269）、RPMI1640 培養(yǎng)基（0024318）購自美國Hyclone 公司；DPBS（0034819）、MSCs Nutri-Stem XF Medium（2008115）購自以色列BI 公司；鼠抗人單克隆抗體CD3（Z6410001）、CD4（Z6410005）、CD25（Z6410045-100T）、CD127（Z6410052-100T）購自北京同生時代生物技術(shù)有限公司；hUC-MSCs 成骨（CHEM-200008）、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（CHEM-200007）購自上海麒盟生物醫(yī)藥有限公司；hUCMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒（HUXUC-90041）購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；Countstar 自動細胞計數(shù)儀購自武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司；全自動血液細胞分析儀BC-5100 購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；流式細胞儀購自安捷倫科技有限公司。

1.3hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)及成脂、成骨、成軟骨樣細胞分化潛能的鑒定 參考文獻［10］。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代hUC-MSCs，經(jīng)酶消化法傳代培養(yǎng)擴增細胞，獲得第4 代hUC-MSCs，按每孔3 × 105個接種6 孔板，待細胞達80%融合時進行成脂誘導(dǎo)分化，待細胞達60%融合時進行成骨誘導(dǎo)分化，具體操作按照試劑盒說明書進行，定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。成軟骨誘導(dǎo)分化：將3 ×105個細胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，250×g離心4 min，棄上清，預(yù)混液洗滌2 次，加入誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重懸細胞團，150 ×g離心5 min，不棄上清，直接將離心管置37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 ～48 h；當細胞團聚攏成小球時，輕彈離心管底部，使小球懸浮在液體中，隨后每隔2 ～3 d 更換誘導(dǎo)完全培養(yǎng)液，其間觀察誘導(dǎo)液和小球變化。待成脂、成骨、成軟骨持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)23 d 后終止誘導(dǎo)，棄上清，PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定，成脂、成骨樣細胞固定20 min 后，油紅O 染色鑒定是否為脂肪樣細胞，茜素紅染色鑒定是否有成骨細胞產(chǎn)生的鈣鹽沉積；離心管底的軟骨球固定1 h 后，進行脫水、石蠟包埋切片、阿利新藍染色，確定是否有軟骨細胞特征性成分酸性黏多糖存在。

1.4人PBMCs 的分離 采用Ficoll 密度梯度離心法。向EDTA 抗凝管里添加等量PBS，充分混勻，緩慢加至淋巴細胞分離液面上，500 ×g離心20 min；取乳白色中間層細胞懸液至新的離心管中，PBS 洗滌細胞，300 ×g離心5 min；棄上清，PBS 洗滌細胞，采用全自動血液分析儀計數(shù)后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1 × 109個／ L，備用。

1.5hUC-MSCs 與異體PBMCs 的共培養(yǎng) 參考文獻［11-12］。試驗分PBMCs 單獨培養(yǎng)組（對照組）及hUC-MSCs 與PBMCs 共培養(yǎng)組，每組設(shè)3 個復(fù)孔。為去除hUC-MSCs 的增殖能力，保留其分泌生物活性物質(zhì)的能力，用30 Gy 的60Co γ 射線照射預(yù)處理hUCMSCs。將hUC-MSCs 按3 × 104個／ 孔接種24 孔板，分別按1 ∶5 和1 ∶10 的比例與PBMCs 共培養(yǎng)，依次加入25 mg ／ L PHA，將培養(yǎng)板進行8 字形混勻后，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d；采用全自動血液分析儀計數(shù)活化PBMCs 的數(shù)量。

1.6hUC-MSCs 對異體PBMCs 免疫調(diào)節(jié)作用的檢測 采用流式細胞術(shù)。收集各組細胞懸液，進行細胞計數(shù)后，300 ×g離心5 min，棄上清，用含0.1%BSA 的PBS 洗滌細胞1 次，用100 μL 含0.1% BSA的PBS 重懸細胞沉淀，加入鼠抗人單克隆抗體CD3-PECY7、CD4-FITC、CD25-APC 和CD127-PE，4 ℃避光孵育30 min；用含0.1% BSA 的PBS 洗滌細胞1 次，用400 μL 含0.10% BSA 的PBS 重懸細胞，上流式細胞儀檢測CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細胞百分比。按下式計算hUC-MSCs 對PBMCs 增殖抑制率。

2 結(jié) 果

2.1hUC-MSCs 的培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見，hUC-MSCs 為貼壁生長的梭形樣細胞，見圖1A；hUC-MSCs 在向成脂肪樣細胞分化過程中，細胞形態(tài)從變?yōu)閳A形或多邊形逐漸到胞質(zhì)內(nèi)有小空泡樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，隨誘導(dǎo)時間延長，胞質(zhì)內(nèi)的小空泡樣結(jié)構(gòu)增多，并互相融合成“葡萄串”，油紅O 染色顯示胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色成熟脂滴沉積，見圖1B；茜素紅染色后呈紫紅色，表明hUC-MSCs 分化為成骨樣細胞，有鈣鹽形成并沉積，見圖1C；阿利新藍將軟骨小球中分化細胞染為藍色，表明hUC-MSCs 分化為成軟骨樣細胞，見圖1D，在hUC-MSCs 向成軟骨樣細胞分化過程中有硫酸軟骨素和氨基聚糖等酸性黏多糖產(chǎn)生。

圖1 hUC-MSCs 的形態(tài)觀察及鑒定Fig.1 Morphological observation and identification of hUCMSCs

2.2hUC-MSCs 對異體PBMCs 增殖的抑制作用 倒置顯微鏡下觀察可見，PBMCs 呈懸浮生長，細胞為圓形或橢圓形，折光性好，形態(tài)大小較為一致，在PHA作用48 h 后，細胞體積變大，隨培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)量明顯增多，聚團細胞增多，細胞團增大，呈聚團和／ 或散在分布，見圖2A；單獨培養(yǎng)組懸浮細胞數(shù)量明顯多于共培養(yǎng)組，見圖2B。hUC-MSCs 與PBMCs以1 ∶5 和1 ∶10 比例共培養(yǎng)5 d，hUC-MSCs 抑制PBMCs 增殖率分別為（81.54 ± 5.10）%和（43.37 ±3.35）%，高于單獨培養(yǎng)組。

圖2 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)中細胞Fig.2 Inverted microscopy of cells in culture

2.3hUC-MSCs 對PBMCs 中Treg 細胞亞群的調(diào)節(jié)作用 hUC-MSCs 與PBMCs 以1 ∶5 和1 ∶10 比例共培養(yǎng)5 d，流式細胞術(shù)檢測顯示，共培養(yǎng)組中CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細胞亞群百分比分別為（3.64 ± 0.49）%和（2.61 ± 0.26）%，見圖3。與對照組［（2.11 ± 0.14）%］比較，hUC-MSCs 促進Treg細胞亞群增殖，上調(diào)效率分別為（41.73 ± 4.66）%和（19.39 ± 5.62）%。

圖3 CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細胞亞群流式圖Fig.3 Flow cytometry of CD4+CD25+CD127dim／-Treg cell subsets

3 討 論

MSCs 是存在于多種組織器官間質(zhì)中的一類成體干細胞，主要通過組織塊貼壁法、酶消化法進行原代培養(yǎng)，經(jīng)酶消化法傳代擴增、純化細胞［10，13］。目前主要從3 個方面進行MSCs 的鑒別［14］，即形態(tài)學(xué)觀察到細胞貼壁生長，梭形，似成纖維細胞；細胞表型為CD73、CD90 與CD105 陽性細胞百分比≥95.0%，而CD34、CD45、HLA-DR、CD14 或CD11b、CD79a 或CD19 的陰性細胞百分比≤2.0%；MSCs 具有成脂、成骨以及成軟骨的分化潛能。本研究采用前期課題組建立的組織塊貼壁培養(yǎng)法獲取的hUC-MSCs（已完成hUC-MSCs 表型鑒定［10］），觀察到hUC-MSCs 具有分化為成脂肪樣細胞、成骨樣細胞和成軟骨樣細胞的潛能，提示本研究平臺制備的hUC-MSCs 符合國際干細胞協(xié)會制定的鑒定標準［10，14］。

MSCs 具有向受損組織器官歸巢，通過自分泌和／或旁分泌改善局部微環(huán)境，以及多向分化潛能和獨特的免疫調(diào)節(jié)特性等特點，使其在臨床細胞治療研究中發(fā)揮著重要作用［2，5-6］。MSCs 制劑的臨床安全性和有效性受其質(zhì)量屬性的影響，其中免疫調(diào)節(jié)特性是評價MSCs 臨床療效最為相關(guān)的重要質(zhì)量屬性之一［8-9］。本研究將hUC-MSCs 與PBMCs 以1 ∶5 和1 ∶10 的比例共培養(yǎng)5 d，采用全自動血液細胞分析儀檢測活化PBMCs 數(shù)量，流式細胞儀檢測CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細胞亞群百分比，觀察到hUC-MSCs抑制異體PBMCs 增殖，而促進Treg 細胞亞群分化，其作用強度與hUC-MSCs 數(shù)量成正比，即有劑量依賴性；與韓曉燕等［9］、劉夢婷［12］等、POLTAVTSEV等［15］報道一致。以上結(jié)果提示，hUC-MSCs 發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用。

已有的研究表明，MSCs 抑制活化PBMCs 增殖作用不受刺激淋巴細胞活化因子類型的影響［12，15-16］。刺激淋巴細胞活化的因子有PHA、刀豆蛋白A、葡萄球菌A 蛋白、美洲商陸有絲分裂原、CD2 mAb、CD3 mAb 和IL-2 等非特異性免疫刺激劑，以及特異性抗原，其中應(yīng)用較為廣泛的是PHA。POLTAVTSEV等［15］觀察到hUC-MSCs 抑制PHA 活化的PBMCs，Transwell 間接培養(yǎng)使MSCs 對PBMCs 增殖的抑制作用顯著降低。TSE 等［16］用CD3 nAb 和CD28 CD3 nAb 刺激PBMCs，與人骨髓MSCs 共培養(yǎng)7 d 后，用3H-胸腺嘧啶核苷摻入法檢測活化PBMCs 的增殖情況，結(jié)果顯示，MSCs 顯著抑制了PBMCs 增殖。本課題組已報道MSCs 抑制CD3-mAb 聯(lián)合IL-2、IFNγ 等活化的DC-CIK 細胞增殖以及TNF-α 等細胞因子的釋放［17］。在hUC-MSCs 與PBMCs 共培養(yǎng)體系中，預(yù)處理MSCs 的培養(yǎng)體系類似單向混合淋巴細胞反應(yīng)，其預(yù)處理方法常用的有細胞周期非特異性抑制劑絲裂霉素C 或60Co γ 射線照射［11-12，18-19］，目的是抑制其增殖而保留分泌生物活性物質(zhì)的能力；如果不對MSCs 進行預(yù)處理，其培養(yǎng)體系類似雙向混合淋巴細胞反應(yīng)。已有研究表明，MSCs 抑制異體PBMCs增殖的能力不受MSCs 是否接收預(yù)處理的影響，均可觀察到MSCs 有抑制PBMCs 增殖的能力［12，17-18，20］。

PBMCs 包括淋巴細胞和單核細胞，以T 淋巴細胞為主。獲取PBMCs 的常用方法是密度為1.077 ±0.002 2 的Ficoll-Hypaque（聚蔗糖-泛影葡胺，也稱淋巴細胞分離液）密度梯度離心法［12，17］，但獲得的PBMCs 中會混雜有約10%的其他血細胞。為獲取純度高的T 淋巴細胞，可選用免疫磁珠、流式分選、親和板結(jié)合分離、脫脂棉柱與尼龍棉柱等方法［21-22］，但面臨費用、技術(shù)平臺等因素的限制。另外，當前由于國家法律法規(guī)對血源的管理，限制了實驗室長期穩(wěn)定大量獲取健康個體人群PBMCs 的來源，對于評價不同批次、相同批次不同代次MSCs 的免疫調(diào)節(jié)能力時，面臨結(jié)果重復(fù)性、可比性差的問題；因此有必要考慮建立健康人群永生化免疫細胞庫的問題。

Treg 細胞是T 細胞的一個重要亞群，對維持機體免疫動態(tài)平衡具有重要作用，其數(shù)量的增加和／或功能異?？蓪?dǎo)致自身免疫性疾?。?3］。Treg 細胞亞群是CD4 陽性細胞中的一類免疫調(diào)節(jié)細胞，其細胞膜表面高表達CD25 是其主要特點之一。目前用于檢測Treg 細胞的標記物組合主要有CD4+CD25+CD127dim／-與CD4+CD25+FOXP3+；CD127 為IL-7α鏈受體，在CD4+CD25+Treg 細胞中的表達呈持續(xù)性低水平；而Foxp3 為轉(zhuǎn)錄抑制因子，需要進行破膜后檢測［23-24］。因此，本研究選用檢測Treg 細胞亞群的方案為CD4+CD25+CD127dim／-，在體外觀察到hUCMSCs 促進Treg 細胞分化，提示其發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)特性。已有研究表明，MSCs 通過分泌生物活性物質(zhì)影響不同類型免疫細胞的增殖分化，大部分哺乳動物來源的MSCs 分泌IDO 為主的免疫負調(diào)節(jié)分子，而小鼠來源的MSCs 以上調(diào)NO 為主發(fā)揮抑制淋巴細胞增殖的作用［25］。MSCs 的生物學(xué)特性受微環(huán)境的調(diào)節(jié)，MSCs 發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用還是免疫調(diào)節(jié)作用由微環(huán)境中炎癥介質(zhì)的種類和濃度決定［4，10］。即MSCs 免疫原性具有可塑性，其表型可極化為MSC1 和MSC2［4，25-26］。MSC1 為促炎表型，MSC2 具有免疫抑制特性。但靜息狀態(tài)的MSCs 為免疫原性較弱的細胞，不表達或低表達HLA-DR、CD40、CD80 及CD86等T 細胞活化需要的第二信號分子。然而，在急性炎癥反應(yīng)微環(huán)境中有高濃度的TNF-α、IFNγ 等炎性因子存在，或TLR3 激活劑作用下，MSCs 極化為抗炎的MSC2，有利于促進組織的損傷修復(fù)。另一方面，在IL-10、TGF-β 等抗炎因子存在，或TLR4 低劑量，短時間的刺激下，靜息狀態(tài)的MSCs 極化為促炎的MSC1，有利于啟動組織損傷早期的免疫應(yīng)答。鑒于此，MSCs 是在炎癥微環(huán)境“授權(quán)”后激活免疫調(diào)節(jié)特性。但是MSCs 表型極化的分子機制尚不十分清楚，加之機體內(nèi)病理微環(huán)境存在時空動態(tài)變化，這無疑為制定MSCs 治療方案、療效評價增加了復(fù)雜性，提示MSCs 的臨床應(yīng)用工作仍任道重遠。

綜上所述，本研究證實，hUC-MSCs 在體外抑制PBMCs 增殖及促進CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細胞亞群表達上調(diào)，揭示hUC-MSCs 在體外淋巴細胞增殖試驗中發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用。通過檢測hUCMSCs 抑制活化PBMCs 增殖、促進Treg 細胞亞群增殖的能力可作為評價hUC-MSCs 生物學(xué)有效性的指標之一。