基于點突變庫研究絲切蛋白在煙曲霉抗逆性和致病力中的作用

房凌旭，盧中一

1． 深圳市前海蛇口自貿區(qū)醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518067；

2． 深圳大學高等研究院深圳市海洋微生物組工程重點實驗室，廣東 深圳 518060

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是自然界中廣泛存在的曲霉屬真菌，其大量產生的分生孢子極易播散，可被人體吸入肺部，在一定條件下對免疫力低下人群產生致病性。煙曲霉可引起過敏性支氣管肺曲霉病、侵襲性曲霉病和慢性肺曲霉病等［1-3］。特別是煙曲霉具有較高的抗逆特性和致病力，一方面體現在其細胞壁的葡聚糖和幾丁質等成分可增強其對宿主免疫系統(tǒng)的逃逸能力；另一方面體現在其具有較強的抗氧化能力，可抵抗巨噬細胞產生的活性氧簇等［4-5］。因此，研究煙曲霉抗逆性和致病力的關鍵蛋白及相關分子機制是治療煙曲霉感染的重要前提。目前，三唑類藥物是臨床上治療煙曲霉感染的一線藥物，但臨床和環(huán)境中唑類藥物及其衍生物的廣泛施用導致煙曲霉逐漸產生耐藥性問題［6-7］。我國的一項研究顯示，從臨床樣品分離得到的159 株煙曲霉中，對伊曲康唑耐藥的煙曲霉陽性率為4.4%［8］；而SEWELL等［9］發(fā)現，從英國南部收集到的178 份土壤樣品中檢測到的唑類耐藥煙曲霉陽性率達6.7%。

絲切蛋白（Cofilin）是一種保守存在于真核生物中的肌動蛋白結合蛋白，其通過切割肌動蛋白絲（Factin）調節(jié)肌動蛋白骨架重排?，F有研究表明，Cofilin是參與真菌抗逆機制和耐藥機制的關鍵蛋白，為具有研究價值的抗真菌藥物靶點［10-11］。釀酒酵母Cofilin中部分蛋白氨基酸位點突變可影響線粒體功能，進而產生逆行信號造成部分轉運蛋白基因轉錄水平升高，最終引起突變株對藥物的耐受升高［12］。此外，煙曲霉Cofilin基因高轉錄水平可引起菌株內氧化應激相關基因和細胞壁多聚糖合成基因轉錄水平升高，提示Cofilin 在煙曲霉抗逆性和致病力方面可能具有重要作用［13］。本研究探討了Cofilin 點突變庫在煙曲霉抗逆性和致病力等方面的作用，以期為Cofilin作為治療煙曲霉感染的潛在藥物靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1菌株 煙曲霉野生株CEA17ku80Δ（WT）由法國巴斯德研究所Jean Paul Latge'教授惠贈；煙曲霉Cofilin 點突變菌株S5A、D19A-R21A、E48A、K36A、K36E 和D54A 由中國人民解放軍疾病預防控制所韓黎研究員惠贈。

1.2實驗動物 大蠟螟幼蟲購自玉米蟲農場公司。選取體表光滑，顏色淺亮，體重0.3 ~ 0.35 g 的大蠟螟幼蟲進行實驗。

1.3主要試劑 熒光白、剛果紅和FITC 偶聯(lián)的伴刀豆蛋白購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司；過氧化氫（H2O2）和山梨醇購自北京國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂購自青島海博生物科技有限公司；PCR 酶體系購自寶生物工程大連有限公司。

1.4培養(yǎng)基的配制 基礎營養(yǎng)培養(yǎng)基（MM）為深圳大學高等研究院深圳市海洋微生物組工程重點實驗室配制，成分包括：1 mL Trace element solution［FeSO4·7 H2O 5 g／L、ZnSO4·7 H2O 22 g／L、MnCl2·4 H2O 5 g／L、Na4EDTA 50 g／L、（NH4）6Mo7O24·4 H2O 1.1 g／L、H3BO311 g／L、CoCl2·5 H2O 1.6 g／L 和CaCl2·2 H2O 14.7 g／L］、50 mL 20 × Salt Solution 溶液（KH2PO430.4 g ／ L、MgSO4·7H2O10.4g／L、KCl10.4g／L 和NaNO3120g／L）、10 g 葡萄糖和15 g 瓊脂；調節(jié)MM 的酸堿度，配制成pH 10 的MM 培養(yǎng)基；在MM 中加入100 mg ／ L 熒光白，配制成熒光白培養(yǎng)基；在MM 中加入200 mg／L 剛果紅，配制成剛果紅培養(yǎng)基；在MM 中加入100 mg／L的H2O2，配制成H2O2培養(yǎng)基；在MM 中加入2.4 mol／L山梨醇，配制成山梨醇培養(yǎng)基。

1.5煙曲霉Cofilin 點突變庫的構建 引物序列見表1，由華大基因科技有限公司合成。通過引物F1和R1（引入突變位點），以煙曲霉菌株CEA17ku80Δ基因組為模板擴增Cofilin 編碼基因片段及上游同源臂（長度1 000 ~ 1 500 bp），同時利用引物F2 和R2 擴增上述基因組中Cofilin 編碼基因另一部分片段；此外，分別通過引物F3 和R3、F4 和R4 以含有篩選標記的質粒和煙曲霉基因組為模板，擴增篩選標記hph 片段及Cofilin 編碼基因下游同源臂（長度1 000 ~ 1 500 bp）；最終利用引物F1 和R4 將上述片段按濃度比1 ∶3 ∶3 ∶1 進行片段融合，并采用原生質體轉化方式導入CEA17ku80Δ 中原位替換Cofilin編碼基因，經篩選并使用引物seqS 和seqA 測序驗證后獲得煙曲霉Cofilin 點突變株。

表1 煙曲霉Cofilin 點突變庫引物Tab.1 Primers for Cofilin point mutation library of A.fumigatus

1.6煙曲霉Cofilin 點突變庫的抗逆性檢測 通過應激試驗分析Cofilin 點突變庫在不同刺激下對煙曲霉抗氧化、抗高滲透壓和抗細胞壁干擾等方面的影響。將WT 和Cofilin 點突變庫煙曲霉的孢子用滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至5 × 107個／ mL，分別取2 μL 接種至不同成分培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)60 ～72 h 后觀察菌落生長情況。

1.7煙曲霉Cofilin 點突變庫細胞壁甘露糖合成及分布的檢測 通過FITC 偶聯(lián)的伴刀豆蛋白熒光標記Cofilin 點突變庫煙曲霉中的甘露糖，分析Cofilin點突變對煙曲霉細胞壁中甘露糖合成及分布的影響。用含0.01% Tween 20 的滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋煙曲霉孢子至5 × 107個／ mL，取2 μL 接種至含2 mL MM 液體培養(yǎng)基的6 孔板（底部放置10 mm×10 mm 蓋玻片），在37 ℃下培養(yǎng)14 ～16 h；加入200 μL FITC 偶聯(lián)的伴刀豆蛋白，在30 ℃下孵育1 h；用去離子水清洗2 次，將蓋玻片取出后倒扣至含抗熒光淬滅劑的載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8煙曲霉Cofilin 點突變庫的致病力分析 采用大蠟螟幼蟲感染試驗分析Cofilin 點突變對煙曲霉致病力的影響。用含0.01% Tween 20 的無菌磷酸鹽緩沖液將5 × 107個／ mL 煙曲霉孢子重懸。用微量注射器將10 μL 孢子懸液注入大蠟螟幼蟲左排最下端腹足。設2 個對照組，一組大蠟螟幼蟲注射10 μL 含0.01% Tween 20 的無菌磷酸鹽緩沖液，另一組不做任何處理。每組16 只。注射后置于37 ℃遮光培養(yǎng)，每12 h 記錄大蠟螟幼蟲存活情況。

1.9統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 5 軟件進行大蠟螟幼蟲感染實驗生存曲線及顯著性分析，P值及顯著性分析采用Log-rank（Mantel-Cox）檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1煙曲霉Cofilin 點突變庫的位點選取及構建本實驗構建了煙曲霉Cofilin 點突變位點K26A、E56A、D11A-E12A、K41A-K42A 和R59A-R61A。選取的煙曲霉Cofilin 點突變庫包括：單位點突變S5A（第5 位點絲氨酸突變?yōu)楸彼幔?、K26A（第26 位點賴氨酸突變?yōu)楸彼幔36A（第36 位點賴氨酸突變?yōu)楸彼幔?、K36E（第36 位點賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?、E48A（第48 位點谷氨酸突變?yōu)楸彼幔?、D54A（第54 位點天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔?、E56A（第56 位點谷氨酸突變?yōu)楸彼幔┮约半p突變D11A-E12A（第11 位點天冬氨酸和第12 位谷氨酸均突變?yōu)楸彼幔19A-R21A（第19 位點天冬氨酸和第21 位點精氨酸均突變?yōu)楸彼幔?、K41A-K42A（第41 位點賴氨酸和第42 位點賴氨酸均突變?yōu)楸彼幔┖蚏59A-R61A（第59 位點精氨酸和第61 位點精氨酸均突變?yōu)楸彼幔?，見圖1。篩選及測序結果表明煙曲霉Cofilin 點突變株構建正確。

圖1 煙曲霉Cofilin 點突變庫中選取的突變位點Fig.1 Mutation sites selected from Cofilin point mutation library of A.fumigatus

2.2煙曲霉Cofilin 點突變庫的抗逆性 相比于WT，Cofilin 點突變庫中攜帶D11A-E12A、K26A、E56A 和R59A-R61A 的煙曲霉在MM 培養(yǎng)基上菌絲生長能力減弱，提示Cofilin 及其部分氨基酸位點對煙曲霉菌絲生長具有重要作用。此外，Cofilin 點突變庫中煙曲霉對細胞壁干擾劑熒光白（100 mg ／ L）和剛果紅（200 mg ／ L）的敏感性與WT 無顯著差異，提示這些Cofilin 點突變可能不影響煙曲霉細胞壁完整性及細胞壁相關應激信號通路。在pH 10 的MM 培養(yǎng)基和含有山梨醇的高滲培養(yǎng)基中，Cofilin 點突變庫中煙曲霉與WT 生長狀態(tài)無顯著差異，提示這些Cofilin 點突變未影響煙曲霉對酸堿度和高滲透壓的應激能力。但攜帶D19A-R21A 和K36A 的煙曲霉菌株在H2O2培養(yǎng)基中菌絲的生長能力強于WT，提示這些突變導致煙曲霉對外界氧化壓力的耐受水平升高；而攜帶K36E 的煙曲霉菌株在H2O2培養(yǎng)基中的生長受到明顯抑制，提示該突變導致煙曲霉對氧化壓力的耐受能力減弱。上述結果提示，Cofilin 及其部分氨基酸位點在煙曲霉氧化應激信號通路中具有重要作用。見圖2。

圖2 煙曲霉Cofilin 點突變庫抗逆性試驗Fig.2 Stress resistance test of Cofilin point mutants of A.fumigatus

2.3煙曲霉Cofilin 點突變庫細胞壁中甘露糖的合成及分布 熒光顯微鏡下觀察顯示，Cofilin 點突變菌株與WT 的甘露糖含量無明顯區(qū)別，但攜帶K36A和E56A 的煙曲霉菌株出現菌絲頂端甘露糖聚集現象，提示這些Cofilin 位點突變可能影響了細胞壁中甘露糖的分布，見圖3。

圖3 熒光標記Cofilin 點突變庫細胞壁中的甘露糖觀察Fig.3 Microscopy of fluorescent-labeled mannose in cell walls of Cofilin point mutants

2.4煙曲霉Cofilin 點突變庫的致病力 S5A、D11AE12A、K36E、K41A-K42A、E48A、D54A 對大蠟螟幼蟲的致病力與WT 相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2分別為0.182、0.495 9、0.124 4、0.567 5、0.068 89、0.236 6，P分別為0.613 4、0.561 6、0.724 3、0.551 3、0.793、0.626 7），提示這些Cofilin 點突變未顯著性影響煙曲霉對大蠟螟幼蟲的致病力。此外，與WT 相比，D19A-R21A、K26A 和K36A 使煙曲霉對大蠟螟幼蟲的致病力顯著增強（χ2分別為5.364、6.6、13.39，P分別為0.020 6、0.010 2、0.000 2），而E56A 和R59AR61A 使煙曲霉對大蠟螟幼蟲的致病力顯著減弱（χ2分別為4.443、4.18，P分別為0.035 1、0.040 9）。上述結果顯示，Cofilin 及其部分氨基酸位點對煙曲霉的致病力具有重要作用。見圖4。

圖4 大蠟螟幼蟲感染試驗分析Cofilin 點突變對煙曲霉致病力的影響Fig.4 Analysis of effect of Cofilin point mutation on virulence of A.fumigatus by infection test in Galleria mellonella larval

3 討 論

蛋白間相互作用是蛋白行使生物學功能的重要方式，而蛋白表面的電荷分布是決定蛋白間相互作用的關鍵因素［14］。本研究利用丙氨酸掃描構建的點突變庫揭示了Cofilin 在煙曲霉抗逆性和致病力等方面的作用。丙氨酸掃描是將蛋白表面帶電荷的氨基酸突變?yōu)楸彼?，以評估蛋白功能及關鍵活性位點等。由于丙氨酸體積小且不帶電荷，通常認為丙氨酸掃描僅改變蛋白表面的電荷分布而不影響蛋白結構［15-17］。本研究選擇了煙曲霉Cofilin 中N-端的帶電荷氨基酸，由于Cofilin 的N-端存在保守的磷酸化位點（已證明在煙曲霉Cofilin 的第五位絲氨酸［13］），而該位點附近的蛋白表面可能與Cofilin 上游調控蛋白的磷酸激酶和去磷酸酶存在相互作用，因此該處帶電荷表面具有重要的生物學活性［18］。本研究中選取位點主要基于以下考慮：①Cofilin 是煙曲霉必需基因，過多的位點突變更易造成蛋白失活使菌株死亡，不利于點突變庫的構建；②進行常規(guī)的多位點同時突變后，往往需要在突變框內進行下一輪單位點或雙位點突變以確定關鍵功能位點，并不能根本性降低工作量；③本研究僅選取感興趣的Cofilin N-端進行突變，整體點突變工作量不大；④位點的選取主要參照了前人對釀酒酵母Cofilin位點的研究工作，以便進行研究工作的橫向比較［12］；⑤選取的氨基酸位點主要集中于α 螺旋和β 折疊等蛋白二級結構區(qū)域，以便分析剛性區(qū)域在Cofilin生物學功能中的重要作用。其中，單位點突變包括S5A、K26A、K36A、K36E、E48A、D54A 和E56A，其中S5A 用來模擬Cofilin 去磷酸化過程，K26 用來分析曲霉屬保守的Loop 區(qū)域中帶電荷氨基酸位點的生物學功能，K36、E48、D54 和E56 的選取參考釀酒酵母Cofilin 的研究［12］。此外，本研究引入了K36E 作為K36A 的對照，以便分析不同突變模式在研究蛋白關鍵帶電荷氨基酸功能中的作用。對于雙突變位點，本研究選取了D11A-E12A、D19A-R21A、K41AK42A 和R59A-R61A，這些位點的選取參照了前人研究中釀酒酵母的Cofilin 點突變模式，可能參與調節(jié)線粒體功能［12］。

本研究結果顯示，Cofilin 點突變D11A-E12A、K26A、E56A 和R59A-R61A 可減弱煙曲霉菌絲的生長能力，該現象的產生可能與點突變Cofilin 調控細胞骨架actin 功能的異常有關。現有研究證實，Cofilin表面的帶電荷氨基酸對actin 有直接的調節(jié)作用。如釀酒酵母Cofilin 中氨基酸位點D10 和E11（分別對應煙曲霉Cofilin 中的D11 和E12）參與對細胞骨架actin 的調節(jié)功能，因此這些位點的突變可導致細胞骨架actin 形態(tài)異常［12］。其他研究顯示，actin 與細胞的極性生長具有重要功能聯(lián)系［11］。上述研究提示，Cofilin 及其部分帶電荷氨基酸可通過調節(jié)actin的生物學功能影響煙曲霉菌絲的極性生長能力。

JIA 等［13］研究發(fā)現，Cofilin基因轉錄水平升高可導致煙曲霉氧化應激能力增強，提示Cofilin 可能參與煙曲霉的氧化應激信號通路。本研究進一步證實，Cofilin 中的帶電荷氨基酸位點可能是該蛋白在煙曲霉氧化應激中行使功能的分子基礎。值得注意的是，本研究發(fā)現，K36E 與K36A 對H2O2的耐受能力不同，提示該位點及附近的帶電荷氨基酸（或化學側鏈）可能調控了Cofilin 在煙曲霉氧化應激信號通路中的功能。同時也提示，除常見的丙氨酸和亮氨酸等點突變模式外，對蛋白中帶電荷氨基酸進行反向電荷突變有助于對關鍵氨基酸功能及其分子機制的研究。

有研究發(fā)現，Cofilin基因轉錄水平升高可導致煙曲霉細胞壁中β-1，3-葡聚糖和幾丁質等合成的增加，提示Cofilin 在煙曲霉細胞壁多糖的合成及細胞壁完整性信號通路中具有重要作用［13］。雖然本研究中的Cofilin 點突變對細胞壁中甘露糖的合成量無明顯影響，但K36A 和E56A 可引起甘露糖在煙曲霉菌絲頂端的聚集，這種現象可能與細胞壁完整性信號通路或菌絲的極性生長有關。

本研究發(fā)現，Cofilin 點突變可影響煙曲霉對大蠟螟幼蟲的致病能力，其中D19A-R21A、K26A 和K36A 導致煙曲霉對大蠟螟幼蟲的致病力顯著增強，產生這種現象的原因是這些點突變可能提高了煙曲霉中線粒體的功能活性。其依據為釀酒酵母Cofilin 中的雙突變D18A-R20A（對應于煙曲霉Cofilin 的D19A-R21A）可導致線粒體功能異?；钴S，而有研究證實，在格特隱球菌中，線粒體活性升高增強真菌的致病力［19］。此外，本研究同時發(fā)現，E56A 和R59A-R61A 引起煙曲霉對大蠟螟幼蟲的致病力減弱，這一現象可能與這些菌株的菌絲生長能力減弱有關。

綜上所述，本研究通過點突變庫揭示了Cofilin及其氨基酸位點在煙曲霉抗逆性和致病力等方面具有關鍵作用，其相關的分子機制應是進一步研究的重點。隨著研究的不斷深入，Cofilin 作為治療煙曲霉及其他致病真菌感染的潛在藥物靶點將具有廣闊的發(fā)展前景。