雙陽(yáng)離子型離子液體和十八烷基修飾的混合模式硅膠固定相的制備及色譜性能

季雙琦， 靳釗， 觀文娜， 潘翔宇， 關(guān)彤

雙陽(yáng)離子型離子液體和十八烷基修飾的混合模式硅膠固定相的制備及色譜性能

季雙琦1， 靳釗1， 觀文娜2， 潘翔宇1， 關(guān)彤1

（1. 青島科技大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院, 青島 266045； 2. 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所, 青島 266101）

通過(guò)分步鍵合反應(yīng)制備了一種咪唑基雙陽(yáng)離子型離子液體和十八烷基共同修飾的混合模式硅膠色譜固定相(Sil-C18-IL-C4); 采用元素分析和紅外光譜對(duì)其進(jìn)行了表征. 分別評(píng)價(jià)了該固定相在反相色譜模式(RPLC)、 親水色譜模式(HILIC)和RPLC/HILIC混合色譜模式下的色譜分離性能, 并在HILIC模式下對(duì)6種堿基核苷類(lèi)化合物進(jìn)行分離, 考察了流動(dòng)相中有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)和水相中甲酸銨濃度對(duì)分離效果的影響. 此外, 還考察了該固定相的分離重復(fù)性. 制備的Sil-C18-IL-C4固定相的元素分析結(jié)果表明, 氮元素含量為1.65%, 碳元素含量為11.16%, 氫元素含量為2.44%. 該固定相的紅外光譜中, 2928和2856 cm?1處出現(xiàn)了—CH的不對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰, 1440 和660 cm?1處出現(xiàn)了咪唑環(huán)上C=C的伸縮振動(dòng)峰和C=N的彎曲振動(dòng)峰, 說(shuō)明十八烷基和1,5-雙(咪唑-1-基)戊烷均已接枝到硅膠表面. 色譜性能評(píng)價(jià)結(jié)果表明, Sil-C18-IL-C4固定相可表現(xiàn)出反相色譜模式和親水色譜模式分離性能, 對(duì)6種堿基核苷類(lèi)物質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離, 而且在一定的色譜條件下可以在單根色譜柱單次運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)RPLC/HILIC混合模式色譜分離, 對(duì)于處理復(fù)雜樣品中的堿基核苷類(lèi)化合物等親水物質(zhì)具有良好的應(yīng)用潛能.

咪唑基雙陽(yáng)離子型離子液體； 混合模式色譜； 固定相； 堿基核苷

高效液相色譜（HPLC）是目前應(yīng)用最廣泛的分離分析和純化技術(shù)之一， 在生命科學(xué)、 材料科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著重要作用. 目前， 單分離色譜模式如反相液相色譜（RPLC）［1，2］、 離子交換色譜（IEC）［3～5］、 正相液相色譜（NPLC）［6～8］和親水作用色譜（HILIC）［9～14］仍在HPLC中占主導(dǎo)地位. 然而， 隨著實(shí)際樣品的復(fù)雜程度不斷增加， 單分離色譜模式逐漸顯露出局限性， 導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受限.

混合模式色譜（MMC）的固定相采用不同特性官能團(tuán)進(jìn)行修飾， 能提供與溶質(zhì)的多重相互作用， 具有更強(qiáng)的分離選擇性和更高的分離效率［15～21］， 可以在單個(gè)色譜柱上實(shí)現(xiàn)至少兩種色譜分離模式. 常見(jiàn)的MMC種類(lèi)有： （1） RPLC/IEC模式. Bai等［22］用-甲基咪唑鎓離子液體改性硅膠固定相， 利用富電子咪唑環(huán)的-共軛作用和離子交換特性有效分離酸性蛋白質(zhì)； （2） RPLC/HILIC模式. Liu等［23］將帶有乙二醇末端的疏水烷基鏈鍵合到二氧化硅上， 利用長(zhǎng)碳鏈的疏水作用和醇羥基的氫鍵作用測(cè)定非離子乙氧基表面活性劑的乙氧基化程度（EO值）和烷基鏈分布； （3） HILIC/IEC模式. Lin等［24］將2-（甲基丙烯酰氧基）乙基三甲基硫酸銨（META）和季戊四醇三丙烯酸酯（PETA）共聚得到新型固定相， 利用META的親水基團(tuán)和離子交換作用位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)酰胺類(lèi)、 核苷類(lèi)和苯甲酸衍生物的有效分離； （4） NPLC/RPLC/IEC模式. Sun等［25］將喹啉接枝到氯丙基硅膠上制備了喹啉離子液體改性硅膠固定相， 利用喹啉基團(tuán)的偶極作用、-作用、 疏水性、 氫鍵和陰離子交換作用等， 有效分離了多環(huán)芳烴、 苯胺類(lèi)和無(wú)機(jī)陰離子類(lèi)樣品； （5） RPLC/HILIC/IEC模式. Xian等［26］將-甲基咪唑和戊烯酸修飾到硅膠表面， 利用咪唑基團(tuán)的-共軛作用、 陰離子的離子交換作用及羧基的親水作用有效分離磺酰胺、 堿基核苷和無(wú)機(jī)陰離子等樣品， 并用于奶粉中三聚氰胺的檢測(cè).

離子液體（IL）常作為功能基團(tuán)用于MMC固定相的修飾. 離子液體是一種具有低熔點(diǎn)、 高選擇性和可忽略蒸汽壓的有機(jī)鹽［27，28］. 由于離子液體獨(dú)特的理化性質(zhì)、 新穎性和可設(shè)計(jì)性， 可以將其鍵合到硅膠填料上， 構(gòu)成一類(lèi)新型的表面限制離子液體（SCIL）固定相. 該新型色譜固定相已經(jīng)被應(yīng)用于IEC、 RPLC和HILIC等多種色譜模式， 這類(lèi)固定相上的分離通常綜合了多種分離機(jī)理， 包括疏水作用、 偶極-偶極相互作用、 靜電作用、 氫鍵、-作用以及空間效應(yīng)等. 合理利用多種分離機(jī)理提升固定相的分離能力已成為重要的研究點(diǎn). 最常見(jiàn)的SCIL固定相是單陽(yáng)離子型離子液體改性硅膠固定相， 主要包括兩類(lèi)： 一類(lèi)是咪唑鎓離子液體鍵合的改性硅膠固定相［29～33］， 另一類(lèi)是喹啉類(lèi)離子液體改性硅膠固定相［26］. 單陽(yáng)離子型離子液體官能團(tuán)只能提供一個(gè)活性作用位點(diǎn)， 為了增加活性位點(diǎn)以獲得更好的分離效果， 研究者合成了多種聚合離子液體用于修飾硅膠固定相［34～41］. 然而， 由于聚合反應(yīng)的可控性較差， 導(dǎo)致所制備的固定相重復(fù)性較差.

為了解決單陽(yáng)離子型離子液體修飾硅膠提供的分離活性位點(diǎn)有限［42］和聚離子液體的聚合度可控性與重復(fù)性較差的問(wèn)題， 本文將咪唑基雙陽(yáng)離子型離子液體官能團(tuán)分步鍵合到十八烷基（C18）修飾的硅膠固定相上， 制備了RPLC/HILIC混合色譜模式硅膠固定相. 該固定相同時(shí)具有疏水作用和?作用等； 分別在反相色譜模式、 親水色譜模式和混合色譜模式下探討了其色譜保留機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

球形多孔二氧化硅（5 μm， 10 nm， 400 m2/g）購(gòu)自日本Daisogel公司； 十八烷基三氯硅烷（純度＞95%）購(gòu)自上海麥瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司； 三乙胺（分析純）、 鳥(niǎo)苷（純度＞99%）和胞嘧啶（純度＞99%）購(gòu)自上海麥克林生化有限公司； 3-氯丙基三乙氧基硅烷（純度＞98%）、 咪唑（純度＞99%）、 1，5-二溴戊烷（純度＞98%）、 氫化鈉（純度60%， dispersion in mineral oil）、 1-氯丁烷（純度＞99.8%）、 尿嘧啶（純度＞99%）、 尿苷（純度＞99%）、 腺苷（純度＞99.5%）、 腺嘌呤（純度＞99%）、 次黃嘌呤（純度＞99%）和胸腺嘧啶（純度＞99%）均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司； 2-氯腺苷（純度＞99%）和肌苷（純度＞99.3%）購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司； 鹽酸、 二氯甲烷、 甲苯、 無(wú)水甲醇、 丙酮、 乙腈、 異丙醇和四氫呋喃均為分析純， 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 商品化反相液相色譜柱（ZORBAX Eclipse XDB-C18， 4.6 mm×150 mm， 5 μm）購(gòu)自美國(guó)Agilent公司. 所用甲苯、 乙腈、 二氯甲烷、 丙酮、 甲醇、 異丙醇和四氫呋喃等試劑均經(jīng)過(guò)4A級(jí)分子篩處理.

Waters 2695型高效液相色譜儀配置Waters 2487雙波長(zhǎng)檢測(cè)器， 美國(guó)Waters公司； Vario ELⅢ型元素分析儀， 德國(guó)Elementar公司； RPL-ZD10型裝柱機(jī)， 大連日普利科技有限公司； R-1001VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司； AVANCE-III型核磁共振波譜儀， 德國(guó)Bruker公司； Nicolet 6700FTIR Spectormeter型傅里葉變換紅外分析光譜儀， 美國(guó)Thermo公司； Maxis UHR TOF型液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀， 德國(guó)Bruker公司.

1.2　1,5-雙(咪唑-1-基)戊烷的合成

按照Scheme 1所示路線合成1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷. 稱(chēng)取1.84 g咪唑分散于50 mL干燥四氫呋喃中， 在干燥氮?dú)夥諊录尤?.0 g氫化鈉， 靜置6 h； 再加入2.76 g 1，5-二溴戊烷， 加熱冷凝回流48 h. 將反應(yīng)體系用聚丙烯濾膜過(guò)濾除去固體雜質(zhì)， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃， 向產(chǎn)物中加入甲醇使其溶解， 加入正己烷萃取分液3次， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇相溶劑后得到1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷.

Scheme 1Preparation process of 1,5?bis(imidazol?1?yl)pentane

1.3　固定相的制備

Scheme 2Preparation process of stationary phase

按照Scheme 2所示路線制備色譜固定相.

1.3.1十八烷基鍵合反應(yīng)取40.0 g硅膠， 加入20%鹽酸（200 mL）， 室溫下攪拌10 h. 將硅膠用蒸餾水洗至中性， 真空干燥， 備用. 取10.0 g干燥硅膠分散于50 mL干燥甲苯中， 在干燥氮?dú)夥諊录尤?2.0 mL三乙胺和5.5 mL十八烷基三氯硅烷， 加熱回流8 h. 將硅膠分別用甲苯和甲醇洗滌， 于65 ℃真空干燥， 得到十八烷基鍵合硅膠（Sil-C18）.

Fig.1　High resolution mass spectrum of 1,5?bis(imidazol?1?yl)pentane

Fig.2　1H NMR spectrum of 1,5?bis(imidazol?1?yl)pentane

1H NMR（600 MHz， DMSO-d6），： 7.60（t，=1.2 Hz， 1H）， 7.14（t，= 1.3 Hz， 1H）， 6.87（t，=1.1 Hz， 1H）， 3.92（t，=7.2 Hz， 2H），1.70（p，=7.3 Hz， 2H）， 1.18—1.10（m， 1H）.

1.3.2離子液體的接枝與封端將10.0 g Sil-C18硅膠分散于100 mL干燥甲苯中， 在干燥氮?dú)夥諊录尤?.0 mL三乙胺和10.0 mL 3-氯丙基三乙氧基硅烷， 加熱回流24 h. 將硅膠分別用甲苯、 甲醇和超純水洗滌， 于65 ℃真空干燥， 得到十八烷基和氯丙基鍵合硅膠（Sil-C18-MPCl）.

取4.0 g Sil-C18-MPCl氯丙基鍵合硅膠分散于50 mL干燥甲苯中， 在干燥氮?dú)夥諊录尤?.3 g 1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷， 加熱回流6 h. 用甲醇、 超純水沖洗， 于65 ℃真空干燥， 得到十八烷基鍵合和離子液體接枝的硅膠（Sil-C18-IL）.

將3.0 g Sil-C18-IL硅膠分散于50 mL干燥乙腈中， 加入0.2 mL 1-氯丁烷， 加熱回流6 h； 用甲醇、 超純水、 丙酮洗滌， 于65 ℃真空干燥， 得到丁基封端的十八烷基鍵合和離子液體接枝的硅膠（Sil-C18-IL-C4）.

1.4　色譜條件

以四氫呋喃/異丙醇混合液為勻漿液， 丙酮為頂替液， 在40 MPa下將Sil-C18-IL-C4硅膠裝填入 150 mm×4.6 mm不銹鋼色譜柱中.

RPLC分離模式： 流動(dòng)相為甲醇-水， 流速1 mL/min， 柱溫25 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm， 進(jìn)樣量5 μL.

HILIC分離模式： 流動(dòng)相為乙腈-甲酸銨緩沖溶液， 流速1 mL/min， 柱溫25 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm， 進(jìn)樣量10 μL.

RPLC/HILIC混合模式： 流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L甲酸銨緩沖溶液， 流速1 mL/min， 柱溫25 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm， 進(jìn)樣量10 μL.

2 結(jié)果與討論

2.1　MMC色譜固定相的表征

2.1.11，5-雙（咪唑-1-基）戊烷的表征合成的1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷分子式為C11H16N4， 采用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其進(jìn)行分析， 結(jié)果如圖1所示. 質(zhì)譜圖中103.0754的峰對(duì)應(yīng) ［M+2H］2+峰，205.1438的峰對(duì)應(yīng)［M+H］+峰，227.1253的峰對(duì)應(yīng)［M+Na］+峰. ［M+H］+峰的測(cè)量值與理論值的相對(duì)誤差為4.9×10?6， 因此高分辨質(zhì)譜表征結(jié)果與化合物的分子式相符.

采用核磁共振氫譜進(jìn)一步分析了所合成化合物. 如圖2所示，7.6對(duì)應(yīng)1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷中1號(hào)位C=N雙鍵C上的氫核，7.14 和6.87 分別對(duì)應(yīng)2號(hào)和3號(hào)位C=C雙鍵C上的氫核，3.92對(duì)應(yīng)4號(hào)位與咪唑上的N相連的亞甲基的氫核，1.70和1.18分別對(duì)應(yīng)5號(hào)和6號(hào)位亞甲基的氫核， 以上數(shù)據(jù)證實(shí)合成的產(chǎn)物為1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷.

2.1.2Sil-C18-IL-C4硅膠固定相的表征采用傅里葉紅外光譜儀分別對(duì)裸硅膠、 Sil-C18、 Sil-C18-MPCl、 Sil-C18-IL和Sil-C18-IL-C4進(jìn)行了測(cè)定. 圖3譜線中1100 cm?1處的吸收峰為硅膠上Si—O鍵的彎曲振動(dòng)峰， 3425和1628 cm?1處的吸收峰分別為硅膠表面殘留的硅羥基O—H鍵的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)峰. 與裸硅膠相比， Sil-C18的紅外光譜在2928和2856 cm?1處出現(xiàn)了—CH的不對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰， 說(shuō)明十八烷基已鍵合到SiO2上. Sil-C18-IL和Sil-C18-IL-C4的紅外光譜均出現(xiàn)了1440和660 cm?1處的吸收峰， 為咪唑環(huán)上C=C的伸縮振動(dòng)峰和C=N的彎曲振動(dòng)峰， 說(shuō)明1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷已經(jīng)通過(guò)親核取代反應(yīng)接枝到硅膠表面.

Fig.3　Infrared spectra of bare silica, Sil?C18, Sil?C18?MPCl, Sil?C18?IL and Sil?C18?IL?C4

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Sil-C18-IL-C4硅膠固定相的成功制備， 分別對(duì)裸硅膠、 Sil-C18、 Sil-C18-MPCl、 Sil-C18-IL和Sil-C18-IL-C4中的C， N和H元素含量進(jìn)行了測(cè)定， 結(jié)果列于表1（數(shù)值為3次平行測(cè)試結(jié)果的平均值）. 與裸硅膠相比， Sil-C18中C和H元素的含量分別增加至9.36%和2.28%， 證實(shí)十八烷基已鍵合到裸硅膠表面. Sil-C18-MPCl中的C和H元素含量分別增加至10.50%和2.29%， 證實(shí)3-氯丙基已鍵合到Sil-C18硅膠上. Sil-C18-IL的元素分析結(jié)果顯示， 由于1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷中含有N和C原子， 使得其N(xiāo)和C元素的含量分別達(dá)到1.68%和11.01%， 證實(shí)1，5-雙（咪唑-1-基）戊烷通過(guò)親核取代反應(yīng)接枝到Sil-C18-MPCl上. 在Sil-C18-IL-C4中， C和H元素含量分別為11.16%和2.44%， 比Sil-C18-IL有所增加.

Table 1　Elemental analysis results of bare silica, Sil?C18, Sil?C8?MPCl, Sil?C18?IL and Sil?C18?IL?C4(n=3)

根據(jù)紅外光譜和元素分析表征結(jié)果， 可推斷Sil-C18-IL-C4色譜固定相制備成功.

2.2　色譜柱保留機(jī)理

2.2.1反相色譜模式由于固定相上含有非極性的C18基團(tuán)， 本文選擇在反相色譜模式（RPLC）下即流動(dòng)相為甲醇-水（體積比85/15）， 利用尿嘧啶、 苯酚、 4-硝基氯苯和萘4種不同極性（從強(qiáng)極性到非極性）的探針?lè)肿訉?duì)固定相的反相色譜性能和柱效進(jìn)行評(píng)價(jià)， 并與商品化HPLC柱進(jìn)行對(duì)比， 結(jié)果如圖4所示.

對(duì)比圖4（A）與（B）可見(jiàn)， Sil-C18-IL-C4柱在反相色譜條件下可以實(shí)現(xiàn)對(duì)4種探針?lè)肿拥姆蛛x， 且對(duì)不同極性物質(zhì)的保留均強(qiáng)于商品化HPLC柱. 由表2可以看出， 在反相色譜條件下， Sil-C18-IL-C4柱的理論塔板數(shù)比商品化HPLC柱高， 說(shuō)明該條件下Sil-C18-IL-C4柱有較高的柱效. 對(duì)比圖4（B）與（C）可見(jiàn)， 隨著流動(dòng)相中甲醇相比例的降低， 2種疏水物質(zhì)4-硝基氯苯和萘的保留增強(qiáng)， 說(shuō)明在上述條件下溶質(zhì)在固定相上的保留遵循反相色譜模式.

Fig.4　Reversed?phase mode chromatographic performance evaluation chromatograms

Table 2　Column efficiency data of two columns under reversed-phase conditions

2.2.2親水色譜模式在親水色譜模式（HILIC）下， 色譜固定相對(duì)分離物質(zhì)的保留行為及選擇性不僅與色譜固定相的種類(lèi)有關(guān)， 還與流動(dòng)相組成、 流動(dòng)相中緩沖鹽濃度等因素有著密切關(guān)系， 因此選擇最優(yōu)的流動(dòng)相對(duì)物質(zhì)的分離非常重要. 核苷類(lèi)物質(zhì)為強(qiáng)極性化合物， 因此本實(shí)驗(yàn)選擇核苷類(lèi)物質(zhì)為待分離對(duì)象， 系統(tǒng)考察流動(dòng)相中乙腈含量和甲酸銨濃度對(duì)待分離物保留行為的影響.

Fig.5　Effect of acetonitrile content on retention of base nucleosides in HILIC chromatography mode

首先， 在保持流動(dòng)相中緩沖鹽濃度為 20 mmol/L不變的前提下， 通過(guò)改變流動(dòng)相中有機(jī)相乙腈的體積分?jǐn)?shù)， 考察了該色譜柱在親水色譜模式下流動(dòng)相中有機(jī)相比例對(duì)待分離物質(zhì)保留行為的影響. 從圖5可以看出， 隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的遞減， 待分離物質(zhì)在固定相上的保留逐漸減弱， 證實(shí)在上述條件下合成的固定相具有典型的HILIC模式的色譜分離性能， 可以通過(guò)調(diào)節(jié)有機(jī)相的含量來(lái)改變不同待分離物質(zhì)的保留行為， 從而提高各分離物質(zhì)間的分離度.

在固定流動(dòng)相中乙腈與甲酸銨體積比為90：10的前提下， 進(jìn)一步考察了水相中甲酸銨濃度對(duì)待分離物質(zhì)保留行為的影響. 如圖6所示， 待分離物質(zhì)在固定相上的保留能力隨甲酸銨濃度的遞增有不同程度的變化. 其原因如下： （1） 流動(dòng)相中甲酸銨濃度越高， 在固定相表面形成的親水層越厚， 使得待分離物質(zhì)與固定相的相互作用增強(qiáng)， 保留時(shí)間延長(zhǎng)； （2） 隨著流動(dòng)相中甲酸銨濃度的提高， 降低了流動(dòng)相中水的摩爾分?jǐn)?shù)， 使溶質(zhì)在十八烷基長(zhǎng)鏈上的保留減弱； （3） 流動(dòng)相中甲酸銨濃度越高， 對(duì)離子交換相互作用抑制越明顯.

Fig.6　Effect of ammonium formate concentration on retention of base nucleosides in HILIC chromatography mode

綜合上述因素， 確定了分離6種堿基核苷類(lèi)化合物的優(yōu)化條件： 流動(dòng)相A為乙腈， B為40 mmol/L甲酸銨水溶液； 流速1 mL/min； 柱溫25 ℃； 梯度洗脫條件為0～1 min， 95%A， 1～11 min， 95%～90%A， 11～13 min， 90%A. 如圖7所示， Sil-C18-IL-C4色譜柱對(duì)這6種堿基核苷類(lèi)化合物表現(xiàn)出良好的分離效果.

Fig.7　Chromatographic separation of 6 base nucleosides on Sil?IL?C4 column

2.2.3RPLC/HILIC混合色譜模式研究中發(fā)現(xiàn)， Sil-C18-IL-C4固定相在不同的流動(dòng)相體系中表現(xiàn)出不同的分離模式. 將乙腈-20 mmol/L甲酸銨溶液作為流動(dòng)相， 在改變流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)的情況下分離了9種不同極性的探針?lè)肿? 如圖8所示， 隨著流動(dòng)相中乙腈含量的降低， 親水性溶質(zhì)（堿基核苷類(lèi)化合物）在Sil-C18-IL-C4柱上的保留明顯降低， 表現(xiàn)出典型的HILIC色譜模式保留特征； 與之相反， 當(dāng)乙腈含量降低時(shí)， 疏水性溶質(zhì)（4-硝基氯苯和萘等）的保留更強(qiáng)， 表現(xiàn)出典型的RPLC色譜模式保留特征. 這說(shuō)明上述條件下在單根色譜柱上單次運(yùn)行即可實(shí)現(xiàn)RPLC/HILIC的混合分離模式.

Fig.8　Effect of acetonitrile content on retention of nine compounds with different polarities in mixed chromatography mode

2.4　Sil-C18-IL-C4色譜柱的重復(fù)性

對(duì)圖8中9種待分離樣品連續(xù)進(jìn)樣10次， 考察了Sil-C18-IL-C4色譜柱的重復(fù)性. 結(jié)果表明， 9種待分離樣品在色譜柱中保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.27%～1.04%（=10）， 證實(shí)其具有較好的分離重復(fù)性.

3 結(jié) 論

采用分步鍵合反應(yīng)制備了新型咪唑基雙陽(yáng)離子型離子液體和十八烷基共同修飾的混合模式硅膠色譜固定相（Sil-C18-IL-C4）； 采用元素分析和紅外光譜對(duì)該固定相進(jìn)行了表征， 紅外光譜圖能較好地描述每一階段產(chǎn)物的特征峰， 結(jié)合元素分析結(jié)果可證明混合模式固定相鍵合成功. 分別在反相色譜模式（RPLC）、 親水色譜模式（HILIC）和RPLC/HILIC混合色譜模式下對(duì)固定相的色譜分離性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)， 結(jié)果顯示Sil-C18-IL-C4色譜固定相對(duì)堿基核苷類(lèi)化合物有優(yōu)異的分離選擇性及良好的分離重復(fù)性， 對(duì)物質(zhì)的保留能夠提供疏水作用、作用、 氫鍵作用及偶極作用等， 且特定條件下該固定相可以在單根色譜柱單次運(yùn)行實(shí)現(xiàn)RPLC/HILIC混合色譜分離模式. 后續(xù)工作將進(jìn)一步研究該固定相的生物樣品分離性能.

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Preparation and Chromatographic Performance of Mixed-mode Silica Stationary Phase Modified by Double Cationic Ionic Liquid and Octadecyl Group

JIShuangqi1， JINZhao1， GUANWenna2*， PanXiangyu1， GuanTong1

（，，266045，；，，266101，）

In this paper， a mixed-mode silica chromatography stationary phase（Sil-C18-IL-C4） modified by imidazole-based double cationic ionic liquid and octadecyl group was prepared by a step-by-step bonding reaction. The stationary phase was characterized by elemental analysis and infrared spectroscopy. The chromatographic separation performance of the stationary phase in reversed-phase mode（RPLC）， hydrophilic mode（HILIC） and RPLC/HILIC mixed-mode were evaluated， respectively， and 6 base nucleosides were separated in HILIC mode. The influence of the volume fraction of the organic phase and the concentration of ammonium formate in the aqueous phase on the separation effect was also investigated. In addition， the repeatability of stationary phase separation was investigated. Elemental analysis and characterization of the prepared Sil-C18-IL-C4 stationary phase show that the nitrogen content was 1.65%， the carbon content was 11.16%， and the hydrogen content was 2.44%. In the characterization results of infrared spectroscopy， the asymmetric and symmetric stretching vibration peaks of —CH appeared at 2928 and 2856 cm?1， and the stretching of C=C on the imidazole ring appeared at 1440 and 660 cm?1. The vibration peaks and the bending vibration peaks of C=N indicate that both octadecyl and 1，5-bis（imidazol-1-yl）pentane were grafted onto the silica surface. The chromatographic performance evaluation results showed that the Sil-C18-IL-C4 mixed-mode silica stationary phase could simultaneously exhibit reversed-phase and hydrophilic-interaction chromatographic separation performance， and could completely separate 6 kinds of base nucleosides. Moreover， under certain chromatographic conditions， the RPLC/HILIC mixed separation mode can be realized in a single run of a single chromatographic column. It has good application potential for solving hydrophilic substances such as base nucleosides in complex samples.

Imidazole-based double cationic ionic liquid； Mixed mode chromatography； Stationary phase； Base nucleoside

O657

A

10.7503/cjcu20220008

2022-01-05

2022-03-15.

觀文娜, 女, 博士, 高級(jí)工程師, 主要從事高性能色譜柱制備技術(shù)的研究. E-mail:guanwn@qibebt.ac.cn

中國(guó)科學(xué)院儀器設(shè)備功能開(kāi)發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目資助.

Supported by the Instrument and Equipment Function Development Technology Innovation Project, Chinese Academy of Sciences.

（Ed.： N， K）