DNA銀納米簇在功能核酸熒光生物傳感器中的應(yīng)用

王君旸， 劉爭， 張茜， 孫春燕， 李紅霞

DNA銀納米簇在功能核酸熒光生物傳感器中的應(yīng)用

王君旸， 劉爭， 張茜， 孫春燕， 李紅霞

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 長春 130062）

DNA銀納米簇(DNA-AgNCs)是以DNA為模板, 通過堿基雜環(huán)上的N原子與Ag+結(jié)合, 用NaBH4將Ag+還原得到的具有熒光性質(zhì)的新興納米探針. 由于DNA-AgNCs具有合成方法簡單、 生物相容性好和熒光發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點(diǎn), 使其在分析檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用. 本文對(duì)DNA-AgNCs的合成和熒光性質(zhì)兩個(gè)方面進(jìn)行了綜述, 分類總結(jié)了以DNA-AgNCs為無標(biāo)記熒光探針在功能核酸熒光生物傳感器方面的應(yīng)用, 對(duì)其不足與應(yīng)用潛力進(jìn)行展望, 以期為未來的研究與應(yīng)用提供借鑒.

DNA銀納米簇； 功能核酸； 熒光； 生物傳感器

金屬納米簇（Metal nanoclusters， MNCs）通常由幾個(gè)到幾十個(gè)金屬原子組成， 直徑小于2 nm， 尺寸接近于電子的費(fèi)米波長［1，2］； 超小尺寸誘導(dǎo)的量子限制效應(yīng)使金屬納米團(tuán)簇具有離散的能級(jí)水平和分子狀特性（如非同尋常的光學(xué)、 電化學(xué)、 催化、 磁性和手性等）， 其能夠通過能級(jí)間電子躍遷實(shí)現(xiàn)光吸收和發(fā)射［3，4］， 彌合了傳統(tǒng)有機(jī)金屬化合物和晶體金屬粒子之間的差距， 被認(rèn)為是單金屬原子和等離子金屬納米粒子間的橋梁［5］. MNCs常被用于傳感、 成像、 催化、 生物偶聯(lián)及電子設(shè)備等領(lǐng)域. 在傳感方面， Au， Ag， Cu及Pt納米簇已被用作傳感探針， 其中銀納米簇（AgNCs）由于其更加優(yōu)異的性質(zhì)， 受到了廣泛關(guān)注. 與容易光致漂白的有機(jī)染料相比， AgNCs具有更高的量子產(chǎn)率、 更強(qiáng)的光穩(wěn)定性、 更低的制備成本及簡單的合成方法， 與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比， AgNCs毒性低、 更加綠色環(huán)保， 且不會(huì)發(fā)生熒光閃爍. 此外， AgNCs具有較好的抗氧化性、 高表面活性、 較大的斯托克位移、 良好的生物相容性、 優(yōu)良的催化性質(zhì)、 手性以及抗菌活性性質(zhì)， 且避免了傳統(tǒng)熒光探針分子在應(yīng)用中需要分離等困難， 已成為納米團(tuán)簇領(lǐng)域發(fā)展前景最好的材料之一. 但由于AgNCs尺寸超小、 活性很高， 易發(fā)生不可逆的團(tuán)聚而降低其表面能， 形成無熒光的銀納米顆粒， 因此需要利用穩(wěn)定劑防止其聚集， 保持光學(xué)活性［6～8］. 在溶液中制備MNCs可以利用樹枝狀大分子、 蛋白質(zhì)、 DNA和硫醇（如谷胱甘肽）等作為模板， 而以DNA作為模板則具有可調(diào)控光學(xué)信號(hào)變化、 可將納米團(tuán)簇模板與分子識(shí)別相結(jié)合等優(yōu)勢. 由于DNA中堿基雜環(huán)上的N原子能與Ag+相結(jié)合， 用NaBH4作為還原劑， 將Ag+還原即可得到具有穩(wěn)定熒光性質(zhì)的DNA銀納米簇（DNA-AgNCs）［9］， 具有合成方法簡單、 制備條件溫和、 生物相容性好、 生物毒性低和熒光發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)， 使其在理化分析、 生物檢測和生物成像方面得到廣泛應(yīng)用.

功能核酸是具有特定功能和特殊結(jié)構(gòu)及序列的核酸， 被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建. 隨著對(duì)功能核酸和納米材料的結(jié)構(gòu)和功能特性研究的不斷發(fā)展， 越來越多基于納米材料的功能核酸傳感器被報(bào)道， DNA-AgNCs也得到了研究者的廣泛關(guān)注. 以DNA為模板生成的AgNCs不僅能夠作為無標(biāo)記熒光探針， 還由于其光譜特性高度依賴于DNA的序列和結(jié)構(gòu)， 已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建功能核酸熒光生物傳感器來進(jìn)行生物分析. 目前， 已有的關(guān)于DNA銀納米簇的綜述大多是對(duì)檢測的目標(biāo)物種類進(jìn)行歸納， 本綜述結(jié)合本課題組的研究工作， 從銀納米簇合成與熒光調(diào)控的視角， 對(duì)DNA-AgNCs作為無標(biāo)記熒光探針在功能核酸熒光生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)行了分類總結(jié)， 并對(duì)DNA-AgNCs目前面臨的挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展作了簡要的展望（Scheme 1）， 以期為未來的研究工作提供借鑒.

Scheme 1Application of DNA silver nanoclusters in the fluorescence biosensors based on functional nucleic acids

1 DNA銀納米簇的制備與表征

2004年， Dickson等［9］首次報(bào)道了利用寡核苷酸5'-AGGTCGCCGCCC-3'為模板， 在5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.5）中與AgNO3混合并冷卻至0 ℃， 然后加入NaBH4劇烈振搖， 從而合成DNA-AgNCs. 通過質(zhì)譜分析可知， 添加NaBH4會(huì)導(dǎo)致1～4個(gè)Ag原子與12個(gè)堿基的寡核苷酸結(jié)合. DNA-AgNCs的大小隨時(shí)間變化， 從Ag1到Ag4/寡核苷酸的團(tuán)簇尺寸隨時(shí)間變化， 在400～600 nm之間具有強(qiáng)烈的特征性電子躍遷. 在260 nm激發(fā)波長下， 在630 nm處附近可觀察到明顯的熒光發(fā)射.

用于構(gòu)建AgNCs的DNA可以是單鏈DNA、 雙鏈DNA或DNA納米結(jié)構(gòu). Ag+與不同堿基的親和性不同， 親和性大小遵循胞嘧啶（C）＞鳥嘌呤（G）＞腺嘌呤（A）＞胸腺嘧啶（T）的規(guī)律［圖1（A）和（B）］， 其中Ag+與C上的N3之間作用最強(qiáng)， G和A上的N7及T上的N3次之， 因此常用富C序列作為DNA-AgNCs的模板， 形成穩(wěn)定的C-Ag+-C結(jié)構(gòu)， 同時(shí)Ag+被包覆于堿基之間， 限制了銀核生長［10～12］. DNA-AgNCs的合成需要銀鹽（AgNO3）、 富C序列的寡核苷酸模板及適當(dāng)比例的還原劑（NaBH4）， 最常用的DNA∶Ag+摩爾比為1∶6， 過量的Ag+可能有助于形成等離子體納米粒子. 不同的DNA模板、 緩沖液、 pH值、 溫度及孵育時(shí)間會(huì)導(dǎo)致DNA-AgNCs的熒光存在差異［圖1（D）和（E）］. Ag+與DNA上的C堿基有較強(qiáng)親和力， 在還原劑的作用下Ag+被還原， Ag0團(tuán)簇成核. 雖然DNA-AgNCs形成的具體過程尚不清楚， 但有足夠的證據(jù)證明熒光DNA-AgNCs的簇狀結(jié)構(gòu)為桿狀［圖1（C）］， 具有自由電子核［13］.

Fig.1　(A) The synthesis process of DNA?AgNCs and the binding site of base and Ag+[10]. Copyright 2016, the Royal Society of Chemistry. (B) Schematic illustrating the potential sites of interaction between single stranded DNA and silver ions[12]. Copyright 2013 MDPI. (C) A proposed rod?like model of AgNCs, with the neutral core(grey) peripherally surrounded by base?bound Ag+(blue)[13]. Copyright 2013, Wiley?VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. (D) Varying the length of the C base leads to AgNCs varying in color[14]. Copyright 2011, American Chemical Society.(E) Varying the length of the C base leads to AgNCs varying in color[15]. Copyright 2014, American Chemical Society

常用的DNA-AgNCs表征方法如表1所示. 通過改變DNA序列、 長度及二級(jí)結(jié)構(gòu)可對(duì)其熒光發(fā)射進(jìn)行調(diào)控， 還可以通過突變、 雜交、 堿基錯(cuò)配和構(gòu)象變化改變納米簇微環(huán)境， 以及改變環(huán)境因子（如緩沖液、 pH值、 金屬離子、 大分子聚合物和小分子等）， 從而調(diào)節(jié)其光學(xué)性質(zhì)， 使得DNA-AgNCs的熒光發(fā)射可以覆蓋紫外光到近紅外（NIR）區(qū)域.

Table 1　Common characterization methods for DNA-AgNCs

2 影響DNA銀納米簇?zé)晒獾囊蛩?/h2>

DNA-AgNCs的熒光受DNA模板、 緩沖液、 pH值、 溫度及孵育時(shí)間等多種因素影響， 其中DNA模板對(duì)DNA-AgNCs的熒光影響較大. 這是因?yàn)镈NA-AgNCs的形成主要依靠Ag+與DNA中C堿基的較高親合能力， 并且DNA序列具有豐富的堿基組成以及千變?nèi)f化的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 從而使DNA-AgNCs能調(diào)控不同的發(fā)射波長. 下文將從堿基組成、 長度和二級(jí)結(jié)構(gòu)3個(gè)方面介紹DNA模板對(duì)DNA-AgNCs熒光的影響.

2.1　堿基組成的影響

通過改變DNA模板可調(diào)控合成不同熒光發(fā)射性質(zhì)的AgNCs， 且AgNCs的熒光強(qiáng)度和量子產(chǎn)率也隨之改變. 2008年， Dickson等［16］證明單鏈寡核苷酸可穩(wěn)定高熒光的AgNCs， 通過DNA序列可調(diào)節(jié)其發(fā)射顏色， 并具有高度光穩(wěn)定性和出色的緩沖穩(wěn)定性. 通過調(diào)整dC12中的堿基序列， 制備了5種不同的納米團(tuán)簇， 其DNA模板序列分別為 5'-CCCTTTAACCCC-3'（藍(lán)色）， 5'-CCCTCTTAACCC-3'（綠色）， 5'-CCCTTAATCCCC-3'（黃色）， 5'-CCTCCTTCCTCC-3'（紅色）和5'-CCCTAACTCCCC-3'（近紅外）， 具有從藍(lán)色到近紅外的可調(diào)發(fā)射以及出色的光物理特性. 系統(tǒng)和單分子熒光研究表明， 與常用的花菁染料相比， 寡核苷酸包被的Ag納米團(tuán)簇顯示出更高的光穩(wěn)定性和發(fā)射率. 2008年， Petty等［17］以dT12為模板合成的AgNCs主要發(fā)射綠色熒光， 熒光強(qiáng)度受pH值影響， 隨著pH從8變?yōu)?1， 熒光強(qiáng)度增加了100倍以上， 并證明去質(zhì)子化的氨基是綠色發(fā)射簇的結(jié)合位點(diǎn)， 以dT4C4T4為模板合成的AgNCs主要發(fā)射藍(lán)色或綠色熒光， 隨著pH值從8變?yōu)?1， 熒光強(qiáng)度增加了200倍以上， 而以dC4T4C4為模板合成的AgNCs， 寡核苷酸濃度影響團(tuán)簇的熒光光譜， 在15 μmol/L寡核苷酸的較高濃度下， 以紅色熒光發(fā)射占主導(dǎo)， 在0.5 μmol/L寡核苷酸的較低濃度下， 則與前兩種納米簇同樣發(fā)射藍(lán)色或綠色熒光. 因此， 研究者認(rèn)為以富T的寡核苷酸為模板時(shí)會(huì)形成發(fā)射藍(lán)色或綠色熒光的AgNCs， 但以富C的寡核苷酸為模板時(shí)還可形成發(fā)射紅色熒光的AgNCs. 此外， 堿基絡(luò)合和固有的團(tuán)簇穩(wěn)定性都與由DNA形成的銀簇類型有關(guān).

2.2　長度的影響

合成AgNCs的DNA模板通常為12個(gè)堿基或者更多. 2010年， Koszinowski和Ballweg［18］報(bào)道只有 6個(gè)堿基的DNA模板不能合成具有熒光性能的AgNCs. 然而， 2013年， 汪爾康等［19］首次合成了由DNA單體（dC， dA， dT和dG）保護(hù)的銀納米團(tuán)簇， 還預(yù)測了它們的光致發(fā)光特性. TEM和EDS表征結(jié)果表明， 除dA外， dT， dC和dG也可用作合成銀納米簇的模板. 基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF-MS）分析結(jié)果表明， dT和dA保護(hù)的銀納米簇具有相似的譜圖， 都結(jié)合奇數(shù)個(gè)銀原子， 均包含Ag9信號(hào)， 且Ag9信號(hào)最強(qiáng)， 而dC僅觀察到Ag9信號(hào)， dG則只觀察到Ag7信號(hào). 但只有dC保護(hù)的銀納米簇顯示出強(qiáng)熒光發(fā)射， 為使用富含胞嘧啶的DNA鏈合成熒光銀納米簇的優(yōu)點(diǎn)提供了證據(jù). 這說明DNA鏈?zhǔn)倾y納米簇較好的合成模板， 但DNA單體與Ag原子間的鍵不牢固、 易斷裂， 可能是DNA-AgNCs不夠穩(wěn)定的原因. 2021年， 本課題組［20］用C6G5C6與富T序列相連（P1-C6G5C6）作為銀納米簇合成模板， 熒光強(qiáng)度相對(duì)于C6G5C6增強(qiáng)7倍， 相對(duì)于P1-C12增強(qiáng)1.3倍， 說明除銀納米簇模板序列， 與模板所連接的DNA長度及堿基均會(huì)造成DNA-AgNCs熒光強(qiáng)度的不同.

2.3　二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1發(fā)夾結(jié)構(gòu)2009年， O’Neill等［21］利用環(huán)上有3～12個(gè)C堿基的發(fā)夾狀DNA合成熒光DNA-AgNCs， 根據(jù)波長與化學(xué)穩(wěn)定性分為4種不同類型， 依靠環(huán)上C的數(shù)量進(jìn)行調(diào)節(jié). 2011年， Tzeng等［22］發(fā)現(xiàn)以5'-CGCGC12CGCG-3'莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA為模板合成的AgNCs比以寡胞嘧啶dC12直鏈DNA為模板形成的AgNCs熒光強(qiáng)度明顯升高. 而對(duì)于具有莖臂堿基錯(cuò)配的DNA序列則無法在高濃度下產(chǎn)生AgNCs， 表明發(fā)夾結(jié)構(gòu)有利于AgNCs的形成. 同時(shí)， 調(diào)整發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生從黃色到紅色不同熒光發(fā)射的DNA-AgNCs. 2016年， 唐點(diǎn)平等［23］利用環(huán)部為dC6的發(fā)夾序列合成了具有強(qiáng)熒光的DNA-AgNCs， 而當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)， 形成的不規(guī)則結(jié)構(gòu)顯著削弱了Ag與C殘基之間的反應(yīng)， 進(jìn)一步擾亂了AgNCs周圍的微環(huán)境， 從而減弱了熒光強(qiáng)度.

2.3.2雙鏈結(jié)構(gòu)相比單鏈DNA（ssDNA）， 雙鏈DNA（dsDNA）具有更加剛性的結(jié)構(gòu)和更加明確的構(gòu)象. 然而， 完全互補(bǔ)的dsDNA沒有多余的位點(diǎn)用于合成AgNCs， 故dsDNA不能用于形成有效的熒光AgNCs. 因此形成dsDNA-AgNCs的前提條件是dsDNA缺陷（圖2）， 如含錯(cuò)配堿基、 脫堿基位點(diǎn)（AP）、 間隙堿基位點(diǎn)（Gap）或者凸起堿基位點(diǎn)（Bulge）. 2011年， 任勁松等［24］利用堿基錯(cuò)配的dsDNA模板在特定位置合成熒光AgNCs， 熒光強(qiáng)度大小順序?yàn)門-C>T-G>T-T. 分子級(jí)別的AgNCs位于dsDNA錯(cuò)配堿基位點(diǎn)， 而DNA模板依然保持完整結(jié)構(gòu). 基于堿基錯(cuò)配的dsDNA模板形成的AgNCs的熒光量子產(chǎn)率為8.1％（相對(duì)于乙醇中的羅丹明B）， 高于ssDNA模板形成的AgNCs的量子產(chǎn)率（5.3％）， 表明堿基錯(cuò)配的dsDNA比ssDNA形成的AgNCs效果更佳［圖2（A）］. 因此， 以dsDNA-AgNCs作為功能性生物探針可鑒定單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism， SNP）. 2011年， 邵勇等［25］發(fā)現(xiàn)dsDNA中的AP 位點(diǎn)可以生成AgNCs， 并且對(duì)于對(duì)面是胞嘧啶且側(cè)面是鳥嘌呤的AP位點(diǎn)（GXG-C）具有高度選擇性 ［圖2（B）］. 基于AP位點(diǎn)微環(huán)境依賴的AgNCs， 建立了檢測SNP的“Signal on”型熒光傳感系統(tǒng)， 并成功應(yīng)用于SNP檢測. 2012年， 邵勇等［26］發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA雙鏈體中C堿基對(duì)面為缺口位點(diǎn)（Gap-C）時(shí)， 可作為快速合成AgNCs的模板， 且具有明亮的熒光發(fā)射和化學(xué)穩(wěn)定性［圖2（C）］. Gap-C會(huì)高度選擇性地形成熒光AgNCs， 用于SNP的實(shí)際檢測. 以GAP-C為模板形成的DNA-AgNCs， 經(jīng)560 nm光激發(fā)可在643 nm處出現(xiàn)強(qiáng)熒光峰， 其熒光量子產(chǎn)率約為47.2％， 而完全匹配的dsDNA只存在非常弱的熒光.

Fig.2　Schematic diagram of the formation of fluorescent silver nanoclusters on a double?stranded structure

(A) Mismatched pairs[24]. Copyright 2011, Wiley?VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. (B) Debase site[25]. Copyright 2011, IOP Publishing Ltd. (C) Interstitial site[26]. Copyright 2012, Elseiver B.V.

2.3.3三螺旋結(jié)構(gòu)由于Ag+可以特異性取代三鏈體DNA的CG.C+堿基中胞嘧啶的N3質(zhì)子形成新的三鏈體（CG.CAg+）， 即使是在中性pH值下， 也能穩(wěn)定平行基序三鏈體［27］. Ag+與CG.C+三重態(tài)的特定相互作用確保了Ag+僅能作用于CG.C+三重態(tài)的Hoogsteen氫鍵. 2012年， 任勁松等［28］以三螺旋DNA為模板獲得了均一的AgNCs［圖3（A）］. 所制備的AgNCs被證明在CG.C+位點(diǎn)， 并且對(duì)Cl-具有異常的穩(wěn)定性. 首次以未修飾的DNA作為模板制備可定位、 均一和超穩(wěn)定的AgNCs. 此外， 通過這種三螺旋DNA實(shí)現(xiàn)了在DNA納米模板上精確控制熒光AgNCs的排列.

2.3.4i-motif結(jié)構(gòu)i-motif是由富含胞嘧啶的寡核苷酸片段在酸性環(huán)境下形成的四鏈體結(jié)構(gòu). 由于胞嘧啶在酸性環(huán)境下（特別是pH≤5.8時(shí)）可以被質(zhì)子化， 質(zhì)子化的胞嘧啶可與未質(zhì)子化的胞嘧啶通過氫鍵形成Hoogsteen堿基配對(duì). 兩條富含胞嘧啶的寡核苷酸片段部分質(zhì)子化后， 通過C?C配對(duì)形成穩(wěn)定的平行雙螺旋， 2個(gè)平行雙螺旋上的堿基對(duì)以交替排列和互相嵌入的形式形成四螺旋結(jié)構(gòu)， 它是目前已知的唯一具有有序插層作用的核酸結(jié)構(gòu). 2009年， Petty等［29］以2個(gè)形成i-motif的寡核苷酸d（TA2C4）4和d（C4A2）3C4為模板合成了AgNCs， 分別發(fā)射紅色和綠色熒光［圖3（B）］， 且分別在弱酸性和堿性溶液中熒光性能較強(qiáng). 最大的紅色熒光發(fā)射強(qiáng)度在pH值為6時(shí)， 此時(shí)寡核苷酸的i-motif結(jié)構(gòu)也最穩(wěn)定， 在pH值為8～9時(shí)， 綠色熒光發(fā)射強(qiáng)度最大.

Fig.3　Schematic diagram of the formation of fluorescent silver nanoclusters on different structures

(A) Triple helix[28]. Copyright 2012, Oxford University Press. (B) i?Motif[29]. Copyright 2009, American Chemical Society. (C) G?quadruplex[31]. Copyright 2011, Elsevier B.V. (D) Benzene ring[32]. Copyright 2013, The Royal Society of Chemistry.

2.3.5G-四鏈體結(jié)構(gòu)G-四鏈體（G-quadruplex）是由富含鳥嘌呤堿基G的寡核苷酸片段在單價(jià)陽離子存在下， 通過鳥嘌呤之間的Hoogsteen氫鍵形成鳥嘌呤-四聚平面， 然后通過-堆積聚集而成的穩(wěn)定、 高度有序的四鏈DNA螺旋結(jié)構(gòu). 2012年， 汪爾康等［30］以G-四鏈體結(jié)構(gòu)的AS1411序列（結(jié)合癌細(xì)胞中過表達(dá)的核仁素的G四鏈體）為模板， 合成了在420 nm（ex=325 nm）和680 nm（ex=510 nm）處具有雙發(fā)射熒光信號(hào)的DNA-AgNCs， 結(jié)合熒光、 CD、 MALDI-TOF-MS和TEM等表征證明了AS1411形成AgNCs后， 仍保持其結(jié)構(gòu)以及與癌細(xì)胞中核仁素結(jié)合的特性， 同時(shí)這一結(jié)合特性顯著增強(qiáng)AgNCs的熒光強(qiáng)度， 并驗(yàn)證了結(jié)合不同G-四鏈體的熒光增強(qiáng)通用性. 由于許多功能性核酸（如人類端粒和某些核酸適配體）都具有富G序列， 在功能條件下可折疊成G-四鏈體， 該方法在未來的研究中具有廣闊的應(yīng)用空間. 此外， 細(xì)胞毒性測定結(jié)果表明， AgNCs對(duì)細(xì)胞的毒性作用很小， 進(jìn)一步證明了該方法在腫瘤細(xì)胞成像中的適用性， 并已成功用于HeLa細(xì)胞的熒光成像. 2018年， 李娜等［31］首次利用圓二色光譜和熒光光譜等技術(shù)對(duì)G-四鏈體拓?fù)?序列與其模板化的AgNCs進(jìn)行研究［圖3（C）］， 發(fā)現(xiàn)具有反平行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的G-四鏈體模板產(chǎn)生的AgNCs熒光強(qiáng)于平行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的AgNCs熒光. 臨近環(huán)基比在環(huán)基中對(duì)AgNCs的熒光有更顯著的影響， 并且腺嘌呤主要表現(xiàn)出熒光增強(qiáng)作用， 胸腺嘧啶則相反. 因此， 包含臨近環(huán)基的腺嘌呤且具有反平行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的G-四鏈體是制備強(qiáng)熒光銀納米簇的良好模板. 該研究有助于更深入地了解G-四鏈體模板與AgNCs之間的相關(guān)性， 并有助于理解和利用它們的獨(dú)特屬性.

2.3.6其它結(jié)構(gòu)2013年， Zamora等［32］以一個(gè)疏水性苯環(huán)為核心， 在不同位點(diǎn)共價(jià)連接2個(gè)或3個(gè) ssDNA， 二聚體的DNA鏈在鄰位和間位， 三聚體則處于交替位置. 由于苯環(huán)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響不大， 因此增強(qiáng)的熒光取決于鏈的分布［圖3（D）］. 在二聚體的情況下， 鄰位衍生物顯示出比間位衍生物更高的熒光， 說明鏈之間的緊密相鄰能更好地促進(jìn)AgNCs的形成. 而以三聚體合成的AgNCs比單獨(dú)一條單鏈DNA（PolyC12）合成的AgNCs熒光強(qiáng)度高約60倍， 且其熒光在開始的24 h內(nèi)未像單鏈樣品中那樣顯著衰減， 并在避光保存20 d后， 其熒光強(qiáng)度仍得以保持， 三聚體獲得的高熒光是由于鄰近鏈之間的合作效應(yīng)， 能夠更好地穩(wěn)定AgNCs并防止其熒光猝滅.

3 DNA銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸傳感器

DNA-AgNCs作為一種新型的熒光納米材料， 是熒光分析領(lǐng)域研究的重要對(duì)象， 已成為熒光納米材料的研究熱點(diǎn). 近年來， 針對(duì)如何增強(qiáng)或減弱DNA-AgNCs熒光生物傳感器的熒光， 已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究. 本文將分別總結(jié)增強(qiáng)和減弱DNA-AgNCs熒光生物傳感器熒光的方法， 以求為后續(xù)DNA-AgNCs的熒光分析方法的研究提供思路.

3.1　基于DNA銀納米簇的熒光增強(qiáng)

3.1.1G堿基Yeh等［33］設(shè)計(jì)了一種納米簇信標(biāo)（Nano cluster beacon， NCB）［圖4（A）］， NCB由2個(gè) 短的線性DNA探針組成， 一個(gè)是由5'-CCCTTAATCCCC-3'形成的AgNCs探針， 另一個(gè)是序列為 3'-G4（TG4）2TG3-5'的G-rich探針， 二者互相接近而發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光， AgNCs的熒光增強(qiáng)約500倍. 利用實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀進(jìn)一步證實(shí)了紅色熒光發(fā)射來自DNA雙鏈體， 并證明了熒光增強(qiáng)機(jī)制的可逆性. 另外， 探索了其它堿基對(duì)熒光的增強(qiáng)作用， 發(fā)現(xiàn)對(duì)于富A鏈未觀察到紅色熒光增強(qiáng)， 富C鏈似乎誘導(dǎo)了不可逆的簇轉(zhuǎn)移， 而富T鏈鄰近DNA-AgNCs時(shí)發(fā)射綠色熒光. 基于該原理， Yeh等［34］在2012年以變色納米簇信標(biāo)作為熒光探針， 根據(jù)AgNCs與DNA增強(qiáng)子序列之間的排列， 調(diào)節(jié)cNCB的熒光發(fā)射顏色， 用于檢測SNP， 并可在UV激發(fā)下用肉眼輕松識(shí)別.

Fig.4　(A) Schematic showing red fluorescence enhancement of DNA?AgNCs through proximity with a G?rich overhang and NCB probe design[33]. Copyright 2010, American Chemical Society.(B) Schematic diagram of Ag emitter on symbiotic long DNA template model and application[37―39]. Copyright 2015, The Royal Society of Chemistry.(C) Schematic illustration of fluorescence switching for Cyt12?AgNCs by adding Ag+[40]. Copyright 2015, Elsevier B.V.(D) Schematic illustration of fabrication of DNA?AgNCs and DNA?AgNCs coated with Tween 80(DNA?AgNCs@tween 80) and their application for Cyt c assay[43]. Copyright 2018, Elsevier B.V.

2012年， Li等［35］基于目標(biāo)物親和誘導(dǎo)DNA雜交和富G序列增強(qiáng)AgNCs熒光， 提出了結(jié)合誘導(dǎo)熒光“Turn on”檢測-凝血酶的方法. 作者設(shè)計(jì)了2條DNA序列： 一條由5'-CCCTTAATCCCC-3'的AgNCs成核序列、 12 nt的雜交序列、 T5的spacer與Apt15適配體組成； 另一條由Apt29適配體、 T5的spacer、 12 nt的雜交序列與富G序列組成. 當(dāng)互補(bǔ)序列為30 nt時(shí)， 不加入目標(biāo)物即有強(qiáng)烈的紅色熒光信號(hào)， 最終優(yōu)化結(jié)果為12 nt互補(bǔ)序列最佳， 能夠保證當(dāng)體系不含目標(biāo)物時(shí)， 所設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列不形成穩(wěn)定雜交鏈， 以此保證背景最低. 作者研究了不同G堿基個(gè)數(shù)的overhang對(duì)AgNCs的熒光增強(qiáng)效果， 以15個(gè)G堿基的序列熒光增強(qiáng)效果最佳， 與前2個(gè)研究使用富G序列相同， 均為3'-G4（TG4）2TG3-5'. 當(dāng)靶蛋白存在時(shí)， 2種適配體探針均與靶蛋白結(jié)合， 引發(fā)與各適配體相連的互補(bǔ)序列相互雜交， 從而使富G的overhang與AgNCs緊密相鄰， 導(dǎo)致熒光顯著增強(qiáng). 該方法無需洗滌分離， 且在均相體系中完成. 基于該原理的檢測方法可以擴(kuò)展到其它使用2種探針與同一靶分子結(jié)合的應(yīng)用中.

另外， 將G堿基插入到富C的DNA序列中也可以增強(qiáng)DNA-AgNCs的熒光強(qiáng)度. 2019年， 錢和等［36］以C6G5C6序列合成量子產(chǎn)率為28％的DNA-AgNCs. 以此DNA-AgNCs為探針， 用于降壓保健食品中卡托普利的靈敏檢測， 具有良好的線性響應(yīng)， 并適用于復(fù)雜基質(zhì)的實(shí)際樣品檢測.

3.1.2AgNCs毗鄰等離子體共振和配體-金屬-金屬間的電荷轉(zhuǎn)移（Ligand-to-metal-metal charge transfer， LMMCT）能夠?qū)е裸y簇臨近而增強(qiáng)熒光， 為發(fā)光銀納米材料的實(shí)驗(yàn)和理論研究提供了新的視角. 2015年， 尹斌成等［37］發(fā)現(xiàn)通過弱熒光AgNCs相互靠近能夠增強(qiáng)熒光發(fā)射強(qiáng)度［圖4（B）］. 通過調(diào)控間隔序列長度， 改變DNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 能夠有效控制AgNCs的熒光強(qiáng)度. 與單獨(dú)帶有T15的單一成核序列形成的AgNCs相比， 以間隔T15的DNA模板形成的S-T15/AgNCs熒光增強(qiáng)850倍. 而S-A（約450倍）， S-C（約250倍）和S-G（約300倍）均未觀察到間隔子長度依賴性的熒光現(xiàn)象. S-T15/AgNCs的量子產(chǎn)率為16.3%， 并能在15分鐘內(nèi)快速合成. 基于該原理， 結(jié)合靶標(biāo)特異性導(dǎo)致核酸適配體發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換， 使得適配體兩端較暗的DNA-AgNCs靠近， 進(jìn)而增強(qiáng)了銀納米簇的熒光. 熒光增強(qiáng)的強(qiáng)度與靶標(biāo)濃度呈正相關(guān)， 可用于“Turn on”熒光生物傳感器的構(gòu)建， 比如基于T-Hg2+-T誘導(dǎo)ssDNA構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)夾的Hg2+傳感器［38］和基于鉛離子誘導(dǎo)ssDNA構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)镚四鏈體的Pb2+傳感器［39］.

3.1.3金屬離子2015年， Kim等［40］建立了以Ag+觸發(fā)DNA-AgNCs的熒光開關(guān)檢測Ag+的方法. Ag+通過在2個(gè)Cyt12-AgNCs之間形成橋來誘導(dǎo)形成Cyt12-AgNCs的二聚體結(jié)構(gòu)， 使得熒光從弱紅色變?yōu)閺?qiáng)綠色［圖4（C）］. 由Ag+觸發(fā)熒光開關(guān)， 具有很高的選擇性和靈敏度（10 nmol/L）， 且響應(yīng)時(shí)間短， 即使在其它金屬離子存在的情況下仍可成功檢測. 2016年， 張靜等［41］發(fā)現(xiàn)Zn2+可增強(qiáng)AgNCs熒光， 基于此建立了同時(shí)檢測赭曲毒素A（OTA）和黃曲霉毒素B1（AFB1）的熒光方法. 將OTA適體和AFB1適體共同固定在磁珠表面， 并分別與信號(hào)探針1（Sp1）和信號(hào)探針2（Sp2）雜交. 當(dāng)2種霉菌毒素存在時(shí)， 適體與靶標(biāo)結(jié)合釋放Sp1和Sp2， 磁性分離后， 上清液中的Sp1和Sp2作為相應(yīng)的模板， 合成具有不同熒光發(fā)射峰的AgNCs. 同時(shí)， 在合成AgNCs的過程中， 加入Zn2+后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)， 2個(gè)熒光峰不重疊， 因此可以實(shí)現(xiàn)高靈敏同時(shí)檢測.

3.1.4大分子擁擠環(huán)境2017年， Li等［42］在高密度葡聚糖誘導(dǎo)的擁擠環(huán)境中制備了AgNCs， 比水溶液中制備的AgNCs具有更小的粒徑和更高的熒光量子產(chǎn)率. 2019年， 王偉等［43］合成了一種熒光增強(qiáng)的吐溫80與DNA-AgNCs結(jié)合體（DNA-AgNCs@tween 80）［圖4（D）］， 可用于檢測細(xì)胞色素c（Cytochrome c， Cyt c）和其它生物硫醇. DNA-AgNCs能在終濃度0.1% tween 80的“疏水口袋”中緊密堆積， 實(shí)現(xiàn)了由聚集誘導(dǎo)的DNA-AgNCs的發(fā)射熒光增強(qiáng)， 通過電子轉(zhuǎn)移提高了Cyt c對(duì)AgNCs的猝滅效應(yīng)， 從而提高檢測靈敏度. 該方法的熒光強(qiáng)度與Cyt c濃度在0.8～20000 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， 檢測限為0.8 nmol/L. 最后， 監(jiān)測Dox， J5和S6處理后的HCT-116和BGC-823腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中Cyt c的變化， 結(jié)果表明Cyt c的水平隨著Dox， J5和S6的存在而降低. 這種具有高靈敏度、 簡單性和良好生物相容性的突破性納米探針為探索細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子機(jī)制和篩選天然藥物提供了廣闊的前景. 2019年， Eun等［44］利用三聚氰胺（Mel）和DNA序列5'-CCCTTAATCCCC-3'中具有強(qiáng)大氫鍵的T堿基之間發(fā)生的特異性相互作用， 合成了Mel-DNA-AgNCs復(fù)合物， DNA模板環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致其它Ag+的結(jié)合， 從而增強(qiáng)熒光效率和穩(wěn)定性. 在（DNA）∶（Ag+）∶（NaBH4）=1∶6∶3， pH=7.0， 25 ℃條件下制得的Mel-DNA-AgNCs效果最佳， 熒光效率增強(qiáng)3倍， 穩(wěn)定性長達(dá)70 d. 此外， Mel-DNA-AgNCs對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌表現(xiàn)出的抗菌活性要優(yōu)于單獨(dú)的DNA-AgNCs.

3.2　基于DNA銀納米簇的熒光減弱

3.2.1巰基在半胱氨酸（Cys）或其它生物硫醇的存在下， DNA-AgNCs中銀原子空的軌道能接受硫原子的電子產(chǎn)生S—Ag鍵， 并發(fā)生DNA-AgNCs供體到硫醇基團(tuán)受體的電子轉(zhuǎn)移， 同時(shí)伴隨DNA-AgNCs粒徑變大， AgNCs聚集形成非熒光的納米顆粒， 使得DNA-AgNCs的熒光被強(qiáng)烈猝滅. 2011年， 汪爾康等［45］發(fā)現(xiàn)DNA-AgNCs的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著生物硫醇濃度的增加而有效猝滅， 生物硫醇中的巰基（—SH）能夠與AgNCs中的Ag+形成S—Ag鍵， 導(dǎo)致發(fā)射波長紅移， 而與濃度高出10倍的其它氨基酸反應(yīng)時(shí)， DNA-AgNCs的熒光沒有發(fā)生改變. 利用該原理可對(duì)半胱氨酸（Cys）、 高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH） 3種生物硫醇進(jìn)行檢測， 并用于人血漿樣品的檢測. 由于硫普羅寧（Tiopronin）是一種含巰基的甘氨酸衍生物， 因此也能夠與DNA-AgNCs中Ag+形成穩(wěn)定的Ag—S鍵， 使得AgNCs的熒光被猝滅［46］. 此外， 在乙酰膽堿酯酶（AChE）存在下， 乙酰硫代膽堿（ATCh）氯化物經(jīng)過催化水解生成硫代膽堿（TCh）， 由于含有硫醇基團(tuán)， 與生物硫醇相似， 因此也可以根據(jù)該原理檢測AChE活性［圖5（A）］［47］.

Fig.5　(A) Schematic illustration of the assay strategy for the detection of biothiols(a) and acetylcholinesterase activity(b) based on DNA?AgNCs[47]. Copyright 2016, Elsevier B.V.(B) Schematic diagram of principle for individual detection of His and Cys[56]. Copyright 2019, Springer?Verlag GmbH Austria, part of Springer Nature.(C) Schematic illustration of the analysis of miR?21 based on the distance?dependent PET between DNA?AgNCs and G?quadruplex/hemin[61]. Copyright 2017, American Chemical Society.(D) Schematic illustration of DNA?AgNCs nano?bioprobe based on FRET for the determination of miRNA?21[62]. Copyright 2020, Elsevier B.V.

值得注意的是， 2011年， 任勁松等［48］發(fā)現(xiàn)在硫醇化合物存在的情況下， 某些DNA-AgNCs（如 dC12-AgNCs）的熒光可以增強(qiáng)， 這可能是由于Ag—S形成了新的電荷轉(zhuǎn)移通道或者巰基化合物引起微環(huán)境的改變所致. 通過使用不同的DNA模板， 可以觀察到針對(duì)硫醇化合物的不同熒光響應(yīng)模式， 說明AgNCs的性質(zhì)具有模板依賴性. 所制備的dC12-AgNCs的發(fā)射帶集中在615 nm處， 其量子產(chǎn)率為18.6％. dC12-AgNCs用于檢測硫醇化合物的最佳溫度為25 ℃， 在pH=4～9范圍內(nèi)效果良好， 在pH=7時(shí)獲得最大熒光發(fā)射信號(hào)， 表明dC12-AgNCs可用于在生理pH值下檢測硫醇化合物. Cys/Hcy/GSH均能夠?qū)е耫C12-AgNCs的熒光顯著增強(qiáng)， 增強(qiáng)規(guī)律遵循Hcy>GSH>Cys的順序， 這似乎與硫醇化合物的電荷提供能力的順序一致.

3.2.2金屬離子某些金屬離子能夠誘導(dǎo)DNA-AgNCs的猝滅， 如Ag+， Au3+， Cu2+和Hg2+等， 其機(jī)理暫不明確， 目前研究者對(duì)此有以下推測： Xie等［49］認(rèn)為10-10親金屬相互作用是金屬離子與納米簇結(jié)合的主要原因， 如Hg2+與Ag+或Au3+， 但Zn2+和Cd2+也具有10卻不能誘導(dǎo)熒光猝滅， Morishita等［50］認(rèn)為具有高氧化還原電位的金屬離子（例如Ag+， Au3+， Cu2+和Hg2+）能夠?qū)⒌蛢r(jià)金屬氧化， 驅(qū)動(dòng)金屬離子與AgNCs相互作用， 從而猝滅熒光， NaBH4無法對(duì)這種金屬誘導(dǎo)的猝滅恢復(fù)， 而低氧化還原電位離子則不能猝滅熒光， 也有研究者認(rèn)為金屬離子結(jié)合到金屬納米簇表面， 改變了電荷轉(zhuǎn)移狀態(tài)， 引起金屬納米簇?zé)晒忖纾?1］.

Cu2+是一種高效熒光猝滅劑， 因?yàn)樗ㄟ^電子或能量轉(zhuǎn)移具有順磁性. 2011年， Zhang和Ye［52］根據(jù)Cu2+離子猝滅DNA-AgNCs的熒光， 設(shè)計(jì)了檢測Cu2+的“Turn off”熒光傳感器. 該方法具有出色的選擇性和靈敏度， 檢測限為10 nmol/L. 當(dāng)Cu2+存在時(shí)， 可以在10 min內(nèi)觀察到DNA-AgNCs的熒光猝滅， 從而進(jìn)行快速分析檢測. 利用金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸鹽（EDTA）與DNA-AgNCs競爭Cu2+， 證實(shí)了猝滅反應(yīng)的主要原因是金屬與金屬的相互作用. 根據(jù)Cu2+猝滅DNA-AgNCs的熒光原理， 可以設(shè)計(jì)與Cu2+相互作用物質(zhì)的“Turn on”型熒光檢測體系， 如組氨酸（His）、 焦磷酸酯（PPi）和喹諾酮類藥物等. 2014年， Zhou等［53］利用Cu2+與組氨酸（His）的咪唑殘基相互作用， 使Cu2+從DNA-AgNCs/Cu2+組裝體中解離釋放， 導(dǎo)致DNA-AgNCs熒光恢復(fù)， 實(shí)現(xiàn)對(duì)His的檢測. 2016年， Ma等［54］基于Cu2+對(duì)550 nm光激發(fā)的DNA-AgNCs的猝滅能力、 Cu2+和焦磷酸酯（PPi）的強(qiáng)結(jié)合能力以及堿性磷酸酶（ALP）將PPi轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽（Pi）的能力， 建立了檢測PPi或ALP的熒光檢測體系. 2018年， 王仁君等［55］利用Cu2+與喹諾酮類藥物相互作用， 設(shè)計(jì)了一種基于Cu2+調(diào)節(jié)DNA-AgNCs熒光的痕量喹諾酮檢測體系. 用Cu2+離子猝滅DNA-AgNCs的熒光， 加入喹諾酮類藥物導(dǎo)致熒光強(qiáng)度恢復(fù). 該檢測方法對(duì)4種代表性喹諾酮類藥物均表現(xiàn)出良好的靈敏度. 2019年， Liu等［56］構(gòu)建了由ssDNA模板5'-CCCTTAATCCCCTTTTTTTTTTTTTTT-CCCTAACTCCCC-3'合成的DNA-AgNCs作為雙熒光發(fā)射的DNA-AgNCs團(tuán)簇組成的比率型熒光納米探針， 用于Cys和His的高靈敏度和高選擇性檢測［圖5（B）］. 在470 nm光激發(fā)下DNA-AgNCs在560 nm處出現(xiàn)弱綠色熒光峰， 而在550 nm光激發(fā)時(shí)會(huì)在595 nm處發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光. 當(dāng)Cu2+存在時(shí)， 能夠增強(qiáng)綠色熒光， 猝滅紅色熒光. 基于Cys/His， Cu2+和DNA-AgNCs的相互競爭作用設(shè)計(jì)了檢測Cys/His的比率型熒光納米探針. 通過添加Ni2+作為掩蔽劑可以將Cys區(qū)別于His， 添加-乙基馬來酰亞胺（NEM）則可以將His區(qū)別于Cys.

Hg2+也能夠猝滅DNA-AgNCs的熒光， 但是在低濃度的范圍內(nèi)依然能夠?qū)崿F(xiàn)“Turn on”型定量檢測. 2011年， Lan等［57］以5′-CCC（TTCC）2TT（CCAA）2CCC-3′合成的DNA-AgNCs（量子產(chǎn)率為61%）為熒光探針， 基于Hg2+對(duì)銀簇的猝滅效應(yīng)檢測Hg2+， 線性范圍為2.5～50 nmol/L， 檢出限為0.9 nmol/L. 2015年， Peng等［58］以5'-CCCACCCACCCGCCCA序列合成的AgNCs靠近G-rich序列（5'-AGGGAGGGAGGGA-GGG）時(shí)， 熒光信號(hào)增強(qiáng)200倍. 在兩端設(shè)計(jì)雜交互補(bǔ)序列， 與雜交前單鏈DNA-AgNCs相比， 雜交雙鏈DNA-AgNCs的熒光更強(qiáng)更穩(wěn)定. 在汞或銅離子存在時(shí)， AgNCs熒光被猝滅， 以此檢測汞或銅離子. 利用EDTA作掩蔽劑， 可選擇性地檢測含有Cu2+等金屬離子溶液中的Hg2+. 利用Hg2+與其它物質(zhì)相互作用恢復(fù)AgNCs的熒光原理設(shè)計(jì)檢測方案. 2017年， Xie等［59］利用Hg2+猝滅DNA-AgNCs的熒光及Hg2+和三聚氰胺間的強(qiáng)配位能力， 當(dāng)Hg2+和三聚氰胺在1000 r/min下反應(yīng)15 min時(shí)， DNA-AgNCs的熒光得以恢復(fù). 基于此方法檢測三聚氰胺的線性范圍為0.2～4 μmol/L， 檢出限為0.1 μmol/L， 比美國食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)三聚氰胺的安全限值低200倍， 可用于奶粉和原料奶中三聚氰胺的檢測.

3.2.3G-四鏈體/血紅素復(fù)合物G-四鏈體/血紅素復(fù)合物不僅具有類似過氧化物酶的活性， 還能作為電子受體有效地猝滅某些熒光團(tuán)的熒光. 熒光團(tuán)與G-四鏈體/血紅素復(fù)合物之間發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electron transfer， PET）， 此過程與熒光團(tuán)和G-四鏈體/氯化血紅素之間的距離直接相關(guān)， PET的猝滅效率隨著二者距離的增加而成比例地下降. 2013年， 汪爾康等［60］首次在DNA-AgNCs和 G-四鏈體/血紅素（hemin）復(fù)合物之間觀察到PET， 同時(shí)伴隨著DNA-AgNCs熒光的降低. 該方法中， 平行G-四鏈體序列和傳感序列互補(bǔ)成發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 目標(biāo)物與傳感序列的特定組合觸發(fā)G-四鏈體序列釋放， 結(jié)合血紅素， 形成穩(wěn)定的G-四鏈體/hemin復(fù)合物. 該復(fù)合物對(duì)PET有利， 因?yàn)樗笹-四聯(lián)體與hemin緊密結(jié)合， 促進(jìn)電子從DNA-AgNCs轉(zhuǎn)移到hemin的Fe3+中心. 該系統(tǒng)可以通過選擇不同的靶序列， 對(duì)DNA、 ATP等目標(biāo)生物分子進(jìn)行特異性、 多方位的檢測， 具有較高的靈敏度. 2017年， 楊秀榮等［61］利用DNA-AgNCs和G-四鏈體/hemin絡(luò)合物間PET的距離依賴特性， 設(shè)計(jì)了檢測microRNA的熒光生物傳感器［圖5（C）］. 該熒光探針包含3個(gè)部分： DNA-AgNCs的合成模板（5'-CCCCACCCCACCCCA-3'）、 miR-21的互補(bǔ)序列（Com）及形成G-四鏈體/hemin絡(luò)合物的富G序列. 在目標(biāo)miR-21存在的情況下， 探針中最初的柔性單鏈Com變成剛性的Com/RNA異源雙鏈體， 電子供體（DNA-AgNCs）和受體（G-四鏈體/hemin復(fù)合物）之間的距離變長， PET被打斷. 因此， 可以通過監(jiān)測DNA-AgNCs的熒光恢復(fù)程度來實(shí)現(xiàn)對(duì)于miR-21的檢測. 對(duì)于不同的microRNA分析， 只需調(diào)整Com的序列即可實(shí)現(xiàn)檢測.

3.2.4熒光染料熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光光波的物質(zhì). 它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物. 以DNA-AgNCs與染料光譜重疊為前提， 可利用DNA-AgNCs作為熒光供體， 熒光染料作為受體， 基于二者間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（F?rster resonance energy transfer， FRET）設(shè)計(jì)檢測體系. 2020年， Nasirian等［62］以發(fā)射紅色熒光的DNA-AgNCs作為供體， 標(biāo)記Cy5.5的近紅外發(fā)射探針作為受體， 通過miRNA-21將三者連接為雙螺旋結(jié)構(gòu)， 使供受體拉近發(fā)生FRET［圖5（D）］. 雜交使得Cy5.5熒光強(qiáng)度與miRNA-21濃度成線性比例增加， 具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍（0.02～100.0 nmol/L）和較低的檢出限（4.0×10-3nmol/L）.

3.2.5納米材料納米材料由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及與熒光探針的相互作用， 為熒光生物傳感器的優(yōu)異性能奠定了基礎(chǔ)， 被廣泛應(yīng)用于熒光生物傳感器的構(gòu)建， 包括金納米粒子（AuNPs）、 氧化石墨烯（GO）、 碳納米管（CNTs）和二硫化鉬（MoS2）等.

金納米粒子能通過表面等離子增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)（Surface plasmon-enhanced energy transfer， SPEET）猝滅銀納米簇的熒光［63］， 屬于偶極-表面相互作用. 尹斌成等［64］基于熒光DNA-AgNCs和AuNPs之間的SPEET過程， 以及ssDNA/dsDNA與AuNPs結(jié)合特性的差異， 構(gòu)建了無標(biāo)記檢測序列特異性DNA的方法［圖6（A）］. 由ssDNA模板制備的DNA-AgNCs可以自發(fā)吸附到AuNPs表面， AuNPs作為猝滅劑猝滅DNA-AgNCs的熒光. 在目標(biāo)DNA存在的情況下， 傳感探針與目標(biāo)DNA雜交形成dsDNA， 導(dǎo)致鹽誘導(dǎo)的AuNPs聚集， 隨后減弱DNA-AgNCs與AuNP之間的SPEET， 使得熒光強(qiáng)度增加伴隨AuNPs由紅色變?yōu)樗{(lán)色， 該變化與靶DNA呈濃度依賴關(guān)系， 實(shí)現(xiàn)了無標(biāo)記的雙信號(hào)檢測.

氧化石墨烯（Graphene oxide， GO）是從氧化石墨上剝離下來的單一的原子層， 可以在橫向尺寸上擴(kuò)展到數(shù)十微米， 具有很大的表面積且被含氧基團(tuán)高度功能化. GO在核酸適配體傳感領(lǐng)域的應(yīng)用主要是基于其兩大特性： 一是GO能夠通過-堆積和氫鍵等相互作用吸附ssDNA， 二是GO作為一種常用的熒光猝滅劑， 具有對(duì)熒光的高效猝滅能力. 因此， GO與DNA-AgNCs結(jié)合， 能夠吸附DNA模板， 并通過長程共振能量轉(zhuǎn)移（Long-range resonance energy transfer， LrRET）有效猝滅AgNCs的熒光. 通過 ssDNA、 dsDNA與GO間的吸附、 解吸， 已開發(fā)多種基于GO與DNA-AgNCs的生物傳感器. 任勁松等［65］利用特定的目標(biāo)DNA與銀簇探針的識(shí)別序列部分形成雙螺旋， 將DNA-AgNCs從GO上解吸， 顯示出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)， 用于檢測DNA. 該系統(tǒng)具有檢測限為1 nmol/L的高靈敏度， 出色的單堿基錯(cuò)配序列的區(qū)分能力， 避免了探針DNA或目標(biāo)DNA的復(fù)雜修飾， 具有操作簡單和低成本的優(yōu)勢. 此外， 利用不同熒光發(fā)射的DNA-AgNCs探針， 實(shí)現(xiàn)對(duì)同一溶液中多個(gè)DNA靶標(biāo)的同時(shí)檢測［圖6（B）］. 目前， 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)乙肝病毒基因（HBV）、 免疫缺陷病毒基因（HIV）和梅毒基因的分析檢測［66］. 將靶標(biāo)互補(bǔ)序列替換為ATP或凝血酶的適配體， 則可通過小分子或蛋白質(zhì)與適配體的結(jié)合使DNA-AgNCs從GO上脫附， 實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的檢測［圖6（C）］. 利用DNA-AgNCs/GO納米復(fù)合材料， 還能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）活性的熒光檢測［圖6（D）］［67］. DNA-AgNCs與GO結(jié)合時(shí)存在低熒光信號(hào). 當(dāng)DNase Ⅰ存在時(shí)， 對(duì)DNA/RNA雙鏈中的DNA進(jìn)行剪切， 釋放出與合成銀簇的DNA模板上的擴(kuò)展DNA互補(bǔ)的RNA， 進(jìn)一步將DNA-AgNCs從GO上解吸， 恢復(fù)猝滅的熒光， 呈現(xiàn)較高的熒光信號(hào). 該方法的檢出限為0.10 U/mL， 并已成功用于牛尿中DNase Ⅰ活性的檢測.

Fig.6　(A) Schematic illustration of the label?free method for specific DNA detection based on SPEET between DNA?AgNCs and AuNPs [64]. Copyright 2015, American Chemical Society.(B) Scheme for the GO?based multicolor DNA analysis [65]. Copyright 2012, The Royal Society of Chemistry.(C) Assay of the target DNAs or ATP/thrombin using DNA?AgNCs/GO system [66]. Copyright 2013, American Chemical Society.(D) Schematic illustration of the DNase I activity assay based on DNA?AgNCs/GO nanocomposite [67]. Copyright 2016, Elsevier B.V.

多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes， MWCNTs）中每層石墨烯片中的碳原子主要以2雜化方式和相鄰的3個(gè)碳原子完全鍵合， 形成六元環(huán)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 具有較大的比表面積和顯著的吸附性. 黃承志等［68］以dC12和目標(biāo)基因互補(bǔ)序列連接作為探針， 基于DNA-AgNCs與MWCNTs的FRET， 設(shè)計(jì)了檢測呼吸道合胞體病毒（RSV）基因序列的方法. MWCNTs可將DNA-AgNCs的熒光猝滅85.8%， 當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)， 互補(bǔ)片段與靶標(biāo)結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)， DNA-AgNCs熒光恢復(fù).

薄層二硫化鉬納米片（MoS2）是一種出色的過渡金屬二硫化物， 由于其優(yōu)異的機(jī)械、 電、 光熱和光催化性能而備受關(guān)注. MoS2和石墨烯的薄度近乎相同， 具有類似于GO的熒光猝滅機(jī)制， 能夠通過范德華力將DNA吸附在MoS2表面， 是一種有前景的熒光猝滅材料. 更重要的是MoS2的制備非常簡單、 省時(shí)、 經(jīng)濟(jì). 2018年， 王周平等［69］以dC12、 為減少成核與適配體序列間的空間位阻的T5和T-2毒素的適配體相連組成的Apt-AgNCs作為熒光探針， 基于Apt-AgNCs和MoS2之間的FRET效應(yīng)， 開發(fā)了用于檢測 T-2毒素的適配體傳感器， 并成功用于玉米和小麥中T-2毒素的檢測.

聚吡咯納米顆粒（PPyNPs）具有-rich結(jié)構(gòu)， 可通過-堆積吸附ssDNA， 還可猝滅近表面材料的熒光， 因此， 可選擇PPyNPs作為DNA-AgNCs的熒光猝滅劑. 2020年， 王周平等［70］以C6G5C6作為AgNCs模板， 結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素A（SEA）適配體序列共同作為熒光探針， 其熒光被PPyNPs猝滅. 當(dāng)存在SEA時(shí)， 適配體與SEA結(jié)合， 從PPyNPs的表面解吸， 從而導(dǎo)致熒光恢復(fù)， 用于檢測SEA.

3.2.6其它方法除了上述常見的減弱DNA-AgNCs熒光的方法外， 研究發(fā)現(xiàn)還存在其它可使DNA-AgNCs熒光猝滅的機(jī)制， 如醌類（Quinones）、 過氧化氫（H2O2）、 一氧化氮（NO）以及超三明治結(jié)構(gòu)等. 2013年， Willner等［71］發(fā)現(xiàn)Quinones或H2O2也能夠猝滅DNA-AgNCs的熒光. 因此， AgNCs可以用來 檢測水解底物后生成Quinones或H2O2的酶， 例如酪氨酸酶、 葡萄糖氧化酶和具有催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的 雙酶（堿性磷酸酶/酪氨酸酶、 乙酰膽堿酯酶/膽堿氧化酶）等. 2014年， Lee和Park等［72］以凝血酶適配體（5'-GTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGAC-3'）作為AgNCs合成模板和K+結(jié)合探針. 利用K+誘導(dǎo)探針轉(zhuǎn)化為G四鏈體結(jié)構(gòu)， 使探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨著K+濃度的增大而降低， 從而檢測K+. 以dC12為模板合成AgNCs， 通過NO誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨， 破壞AgNCs結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)NO的檢測. 2014年， 王廣鳳等［73］以與靶標(biāo)雜交序列連接dC12為模板形成AgNCs， 結(jié)合特定的核酸靶標(biāo)雜交形成超三明治結(jié)構(gòu)， 導(dǎo)致DNA-AgNCs的熒光強(qiáng)度相對(duì)于靶標(biāo)DNA濃度線性下降.

4 總結(jié)與展望

本文介紹了近年來基于以DNA-AgNCs無標(biāo)記探針作為信號(hào)輸出， 用于熒光檢測靶標(biāo)的方法與應(yīng)用. DNA-AgNCs不需要昂貴且繁瑣的修飾， 有助于實(shí)現(xiàn)簡單且低成本的分析檢測， 通用的信號(hào)輸出模式也有利于設(shè)計(jì)各種檢測策略. 此外， 與傳統(tǒng)的無標(biāo)記熒光染料不同， 由于DNA-AgNCs可通過不同的DNA模板合成具有不同顏色熒光的AgNCs， 在響應(yīng)多個(gè)目標(biāo)時(shí)可以實(shí)現(xiàn)選擇性信號(hào)輸出， 結(jié)合納米材料降低背景信號(hào)實(shí)現(xiàn)靈敏的分析檢測， 也可以通過G堿基、 銀簇毗鄰及金屬離子等方式增強(qiáng)DNA-AgNCs熒光， 結(jié)合酶輔助或無酶擴(kuò)增策略進(jìn)一步提高檢測方法靈敏度.

雖然DNA-AgNCs的發(fā)展已經(jīng)取得了較好的進(jìn)展， 但是目前對(duì)于DNA-AgNCs的研究仍處于探索階段， 在深入研究AgNCs發(fā)光機(jī)制、 反應(yīng)機(jī)制以及可控合成方面還面臨著巨大的挑戰(zhàn)： （1） 精確原子尺寸、 高熒光量子產(chǎn)率的AgNCs合成仍是一項(xiàng)艱巨的研究任務(wù)， 對(duì)于DNA-AgNCs而言， 更是無法確認(rèn)其合成模板序列與功能之間非常明確的規(guī)律， 因此還無法按照所需功能設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的DNA-AgNCs模板；（2） 對(duì)于DNA-AgNCs的發(fā)光機(jī)制， 以及其結(jié)構(gòu)與發(fā)射波長的關(guān)系， DNA-AgNCs的熒光增強(qiáng)以及減弱 機(jī)制等還不夠清楚， 仍需對(duì)銀納米簇結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系進(jìn)行研究， 以更深入地了解AgNCs的性質(zhì)； （3） 與金納米簇相比， 銀納米簇的穩(wěn)定性相對(duì)較差， 在實(shí)際應(yīng)用過程中， pH值過高或過低、 高溫、 高鹽和存在強(qiáng)競爭配體等環(huán)境下的熒光不夠穩(wěn)定， 還存在光漂白、 易氧化和保質(zhì)期短等問題. 因此， 仍需要對(duì)合成方法、 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)的控制及配體選擇等方面做更深入的研究和探索， 做到單分散、 高效率、 高產(chǎn)率、 高穩(wěn)定性的納米團(tuán)簇的合成； （4） 雖然DNA-AgNCs在生物傳感、 生物成像等方面的應(yīng)用已有報(bào)道， 但它對(duì)人體的毒性、 環(huán)境的污染還不夠明確， 仍需深入研究其毒性機(jī)制， 為DNA-AgNCs在未來環(huán)境監(jiān)測、 疾病診斷、 生物成像等領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

對(duì)于DNA-AgNCs的未來改進(jìn)和新應(yīng)用可以進(jìn)行如下嘗試： （1） 有必要進(jìn)一步研究銀納米簇的精確形成過程和發(fā)光機(jī)制等基礎(chǔ)理論， 探索AgNCs結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系， 為更好地構(gòu)建DNA-AgNCs熒光生物傳感器提供理論指導(dǎo)； （2） 通過引入空間DNA模板， 引入化學(xué)修飾以及加入抗氧化劑等方法， 提高DNA-AgNCs的穩(wěn)定性； （3） 充分利用銀納米簇發(fā)射波長可調(diào)的優(yōu)點(diǎn)， 設(shè)計(jì)出多色輻射的DNA-AgNCs用于靶標(biāo)的多路檢測是有發(fā)展?jié)摿Φ模?（4） 結(jié)合新型納米材料、 復(fù)合納米材料等物質(zhì)， 賦予DNA-AgNCs更優(yōu)良的性質(zhì)， 開發(fā)富有創(chuàng)新性的傳感策略； （5） 在已有研究成果的基礎(chǔ)上， 建立通用有效的DNA-AgNCs功能核酸熒光生物傳感器的設(shè)計(jì)策略. 總之， DNA-AgNCs作為一種具有優(yōu)良性能的新型功能性材料， 在其研究道路上機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存. 相信隨著研究者們對(duì)DNA-AgNCs更加深入的研究， 將會(huì)應(yīng)用于生物分析、 細(xì)胞成像、 環(huán)境監(jiān)測以及電子器件等諸多領(lǐng)域， 其未來發(fā)展前景非常值得期待.

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［73］ Wang G. F.， Zhu Y. H.， Chen L.， Wang L.， Zhang X. J.，， 2014，（1）， 165―169

Application of DNA Silver Nanoclusters in the Fluorescence Biosensors based on Functional Nucleic Acids

WANGJunyang， LIUZheng， ZHANGQian， SUNChunyan*， LIHongxia*

（，，130062，）

DNA silver nanoclusters（DNA-AgNCs） are a kind of fluorescent nanoprobes obtained by reducing Ag+with NaBH4using DNA as template， because the N atoms on the base heterocyclic are combined with Ag+. Due to the advantages of simple synthesis method， good biocompatibility and adjustable fluorescence emission wavelength， DNA-AgNCs have been widely used in the fields of analysis and detection. In this paper， the application of DNA-AgNCs as label-free fluorescent probes in functional nucleic acids biosensing detection is classified and summarized. In addition， conclusive views on the deficiencies and application potential are put forward， which provide references for future research and application.

DNA silver nanocluster； Functional nucleic acid； Fluorescence； Biosensor

O657.3

A

10.7503/cjcu20220010

2022-01-06

2022-02-08.

孫春燕, 女, 博士, 教授, 主要從事食品營養(yǎng)與安全檢測技術(shù)方面的研究. E?mail: sunchuny@jlu.edu.cn

李紅霞, 女, 博士, 副教授, 主要從事生物傳感分析方法建立與食品安全檢測方面的研究. E-mail: hxiali@jlu.edu.cn

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 20200201218JC)、 吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): JJKH20201010KJ)和吉林大學(xué)杰出青年教師培育項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 2132020KJC020).

Supported by the Science and Technology Development Program of Jilin Province, China(No.20200201218JC), the “Thirteenth Five-Year” Science and Technology Project of Education Department of Jilin Province, China(No.JJKH20201010KJ) and the Outstanding Young Teachers Training Program of Jilin University, China(No.2132020KJC020).

（Ed.： N， K）