沙眼衣原體主要外膜蛋白多肽多克隆抗體的制備與鑒定

徐青青 陳文韜 江銀波 藍銀苑 潘鈺瑩曾麗紅 楊建江 薛耀華 鄭和平，2

1安徽醫(yī)科大學(xué)廣東皮膚病臨床學(xué)院（合肥 230032）；2廣東省皮膚病醫(yī)院（廣州 510091）；3南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院（廣州 510091）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是世界范圍內(nèi)最常見的性傳播疾病病原體［1］，全球每年新發(fā)Ct 感染病例約1.27 億［2］，主要引起男性尿道炎、附睪炎、前列腺炎和女性宮頸炎、盆腔炎、異位妊娠、流產(chǎn)、死胎等［3-4］。生殖道Ct 感染不僅是臨床常見的性傳播疾病，還是人類乳頭瘤病毒致宮頸癌的協(xié)同因子［5］，以及人類免疫缺陷病毒感染的重要協(xié)同因素，嚴(yán)重威脅人類生殖健康［1，6］。

Ct 是專性細胞內(nèi)寄生的原核細胞微生物，具有獨特的雙相發(fā)育周期，胞外具有感染性的原體和胞內(nèi)代謝活躍的始體，在48 ～72 h 的生命周期內(nèi)原體和始體互相轉(zhuǎn)換，最終實現(xiàn)自身的增殖與播散［7］。沙眼衣原體主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）是存在于原體和始體外膜上的多功能蛋白，占外膜總蛋白的60%［8］，與沙眼衣原體抗原性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生長代謝調(diào)節(jié)和毒力密切相關(guān)。MOMP 由5 個保守區(qū)夾著4 個可變區(qū)（variable domains，VD）組成，基于VD 段中抗原決定簇的差異，Ct 分為（A，B，Ba，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，G，K，L1，L2，L3）15 個血清型［9］。此外VD 內(nèi)包含多個具有免疫原性的T、B 細胞表位，可作為重要的免疫原刺激機體免疫應(yīng)答［10］，因而MOMP 是目前Ct 疫苗研究的潛在候選抗原［11］。同時MOMP 作為外膜上的孔蛋白，其結(jié)構(gòu)中的二硫鍵在維持原體剛性外膜的結(jié)構(gòu)完整性中具有重要作用［12］。有研究報道MOMP 與Ct 感染宿主細胞初期的黏附作用有關(guān)，通過促進與宿主細胞的非特異性（靜電和疏水）相互作用來發(fā)揮粘附素的功能［10，13］。MOMP作為Ct 疫苗及Ct 致病機制研究的重要抗原，抗MOMP 抗體成為實驗研究的必要工具，然而，目前與多種血清型Ct 結(jié)合的商品化抗體依賴進口，因此本研究設(shè)計合成了1 條13 肽，并與鑰孔帽血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶聯(lián)，通過免疫新西蘭兔成功制備出MOMP 多克隆抗體，為后續(xù)更深入地研究MOMP 的生物學(xué)功能提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料 沙眼衣原體A，B，Ba，C，D，E，F(xiàn)，L1 型標(biāo)準(zhǔn)株和Hela 細胞由廣東省皮膚病醫(yī)院實驗室保存；雄性新西蘭兔購自廣州市花都區(qū)花東信華實驗動物養(yǎng)殖場，許可證號為：SCXK（粵）2019-0023，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心，本實驗經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會審查通過（倫理審查編號為：2020c004）；弗氏佐劑購自上海Beyotime/碧云天公司；辣根過氧化物酶底物購自美國密理博公司；細胞培養(yǎng)板購自廣州潔特公司；驢抗兔抗體和衣原體MOMP 抗體購自美國Abcam 公司；酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher 公司；激光共聚焦顯微鏡購自尼康公司；蛋白電泳儀購自Bio-Rad 公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 多肽抗原的設(shè)計和合成 通過對比15 個血清型Ct 標(biāo)準(zhǔn)株的氨基酸序列設(shè)計出13 肽DTTTLNPTIAGAG 作為抗原，同時選定9 肽TTLNPTIAG作為后期抗體效價檢測的抗原［11］。多肽的合成和偶聯(lián)血藍蛋白委托吉爾生化（上海）有限公司完成，利用反向高效液相色譜法測定多肽純度，MS 質(zhì)譜測定合成肽段的分子量，得到9 mg 免疫原KLH-Cys-DTTTLNPTIAGAG，3 mg 檢測抗原BSACys-TTLNPTIAG。

1.2.2 抗體的制備 免疫前采集兔血清做對照，取多肽與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，對新西蘭兔進行兩側(cè)腹股溝和腋窩皮下注射，劑量為400 μg/只。四周后使用不完全佐劑乳化多肽進行加強免疫，一周后靜脈取血，經(jīng)ELISA 檢測效價達到預(yù)期后心臟取血，血清置-70 ℃保存。

1.2.3 抗體效價的測定 將9 肽抗原稀釋并包被酶標(biāo)板過夜，將血清從1∶100 開始2 倍梯度稀釋至1∶51 200，并設(shè)置陰性血清對照，孵育和顯色后在450 nm 波長處測量吸光度值，可檢測到陽性信號的最低稀釋倍數(shù)即為待測抗體效價。

1.2.4 純化血清 兔血清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后加入Protein A/G 純化柱，對純化前后血清進行SDSPAGE 電泳，考馬斯亮藍染色并使用Image J 分析灰度值。

1.2.5 Ct 培養(yǎng) Hela 細胞 以1 × 105個/孔接種于24 孔細胞板中，次日向孔內(nèi)加入Ct 懸液（約1 ×105IFU/孔），室溫1 500 r/min 離心60 min，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至48 h。

1.2.6 Western blot Ct 感染48 h 后收集細胞，采用10%的分離膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜后于室溫封閉1 h；TBST 稀釋純化后的血清作為一抗，室溫孵育1 h；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 孵育1 h，曝光顯影。

1.2.7 免疫熒光染色 Ct 感染細胞48 h 后，4%多聚甲醛溶液固定15 min；加入5%牛血清白蛋白封閉30 min；加入純化后血清4 ℃孵育過夜；FITC 標(biāo)記或TRITC 標(biāo)記的驢抗兔二抗孵育60 min；或FITC標(biāo)記的商品化抗體染色；含DAPI 的防熒光淬滅油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號并拍攝圖像。

2 結(jié)果

2.1 多肽抗原的純度及分子量檢測 經(jīng)RP-HPLC檢測多肽的純度為96.7%（圖1A），合成多肽的相對分子質(zhì)量為1.33 kDa（圖1B）。

圖1 多肽的純度及分子量檢測Fig.1 Determination of purity and molecular weight of polypeptide

2.2 SDS-PAGE 檢測IgG 抗體純度 免疫兔血清經(jīng)Protein A/G 抗體純化柱純化，SDS-PAGE 電泳后經(jīng)考馬斯亮藍染色檢測IgG 抗體純度（圖2），經(jīng)分析計算E4、E5 的抗體純度分別為89.6%、86.68%，表明已純化出兔IgG 抗體。

圖2 SDS-PAGE 檢測IgG 抗體純度Fig.2 Detection of the purity of IgG antibody by SDS-PAGE

2.3 間接ELISA 測定抗體效價 間接ELISA 檢測免疫前血清、免疫血清及純化抗體的效價，純化前的兔血清效價達到1：6 400，純化后抗體效價達到1∶12 800（圖3），效價較高。

圖3 間接ELISA 檢測抗體效價Fig.3 Detection of antibody titer by indirect ELISA

2.4 Western blot 檢測抗體特異性 Western blot結(jié)果顯示不同血清型Ct 均可與MOMP 多克隆抗體反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約40 kDa 處均可見條帶（圖4），由于不同血清型MOMP 分子量大小存在差異，條帶位置略有不同。

圖4 Western blot 檢測MOMP 抗體的特異性Fig.4 Detection of the specificity of MOMP antibody by Western blot

2.5 免疫熒光檢測抗體特異性 不同血清型Ct 感染細胞均可見核旁蘋果綠色熒光團塊，與MOMP 在細胞內(nèi)分布一致（圖5）。由于不同血清型Ct 生命周期不完全一致，感染48 h 時成熟度不同，各型別間熒光強度略有差異。免疫熒光結(jié)果表明MOMP抗體能夠識別不同血清型Ct，具有較好的反應(yīng)性和特異性。

圖5 間接免疫熒光染色檢測MOMP 抗體的特異性Fig.5 Detection of the specificity of MOMP antibody by indirect

2.6 比較MOMP抗體與商品化抗體作用效果 對Ct 感染的Hela 細胞進行MOMP 抗體與商品化抗體混合染色，可見Ct MOMP 多克隆抗體染色后紅色熒光廣泛分布于Ct 膜表面（圖6），與商品化抗體的綠色熒光發(fā)生明顯的共定位，熒光強度相當(dāng)。

圖6 MOMP 抗體與商品化抗體免疫熒光染色作用效果Fig.6 The functional comparison of MOMP antibody and commercial antibody by immunofluorescence staining

3 討論

Ct 目前已鑒定出15 個血清型，其中A-C 型常引起沙眼，D-K 型易引起泌尿生殖道感染，L1-L3型常造成性病淋巴肉芽腫［9］。MOMP 包含Ct 血清型抗原決定簇，不僅是Ct 血清型分型的基礎(chǔ)，還與Ct 毒力、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及免疫防御密切相關(guān)。目前國外商品化MOMP 抗體價格昂貴，國內(nèi)研究以A、E、L2 型MOMP 蛋白為抗原免疫動物獲得相關(guān)抗體，但所制備的抗體并未對其他血清型Ct 進行鑒定［14］，因此本研究制備能與多種血清型Ct 結(jié)合的MOMP 多克隆抗體，為Ct 疫苗及Ct 致病機制研究奠定基礎(chǔ)。

目前以特異性抗原免疫動物制備相應(yīng)的多克隆抗血清是免疫學(xué)研究的常用方法，但大腸桿菌原核表達系統(tǒng)純化表達蛋白或肽段抗原存在實驗周期長、蛋白溶解度差、產(chǎn)量少和純度低等問題［15］。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展和高通量篩查技術(shù)在抗原表位預(yù)測中的普遍應(yīng)用，人工合成多肽作為抗原的潛力逐漸受到關(guān)注［16］，制備的抗體既保持序列特異性，又因其生產(chǎn)成本低、標(biāo)準(zhǔn)化高、特異性好和安全性強等特點，廣泛應(yīng)用于病毒［17］、細菌［18］、寄生蟲［19］和癌癥［20］等領(lǐng)域相關(guān)抗體制備。本研究在分析MOMP 序列的基礎(chǔ)上設(shè)計合成1 條13 肽抗原，既縮短了構(gòu)建載體和純化蛋白的時間，又提高了抗原的純度。由于肽段分子量小，免疫原性不強，可能在體內(nèi)降解而不能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗體，為了解決多肽抗原穩(wěn)定性和免疫原性問題，筆者在設(shè)計多肽時在N 端添加一個半胱氨酸與血藍蛋白偶聯(lián)。由于載體蛋白自身也能引發(fā)免疫反應(yīng)，抗血清中會產(chǎn)生針對KLH 的抗體［21］，因此在間接ELISA 試驗中采用BSA 與多肽偶聯(lián)作為包被原，排除血清中針對KLH 抗體的干擾。

本研究制備的兔多克隆抗體ELISA 效價達1∶12 800，顯示MOMP 抗體具有良好的反應(yīng)性。Western blot 和免疫熒光試驗證實其對8 個血清型Ct（A，B，Ba，C，D，E，F(xiàn)，L1）均具有良好的結(jié)合能力，且與進口商品化抗體發(fā)生明顯共定位，熒光強度相近、效果相當(dāng)。進口MOMP 抗體價格昂貴且貨期長，本研究MOMP 多克隆抗體易于制備，經(jīng)濟實惠。MOMP 抗體可用于免疫熒光染色、免疫印跡、免疫組化等實驗，為后續(xù)MOMP 蛋白的功能及作用機制研究提供有效的工具。

本研究證實MOMP 抗體能與8 個血清型Ct 發(fā)生特異性結(jié)合，這8 個血清型Ct 可導(dǎo)致沙眼、生殖道感染和性病淋巴肉芽腫，但仍有幾個血清型Ct尚未進行Western blot 和免疫熒光試驗，MOMP 抗體能否與所有血清型Ct 特異性結(jié)合，還需要進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究成功制備出效價高、特異性好的多克隆抗體，能與多種血清型Ct 結(jié)合，為后續(xù)進一步研究MOMP 蛋白的功能及作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。