核酸藥物研究進(jìn)展及挑戰(zhàn)

董志輝 許小丁

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化中心（廣州 510120）

目前，大多數(shù)臨床批準(zhǔn)的藥物，包括用于癌癥的藥物，都是基于小分子或蛋白質(zhì)/抗體的生物制劑。核酸藥物作為新一代藥物，研發(fā)工作者付出了巨大努力。半個(gè)世紀(jì)前，F(xiàn)RIEDMANN 和ROBLIN［1］提出了一個(gè)概念：通過(guò)引入功能基因拷貝，可以治療功能性基因產(chǎn)物引起的遺傳性疾病。此后，核酸藥物克服各種挑戰(zhàn)，制定適當(dāng)?shù)募膊∵x擇策略，目前主要針對(duì)罕見(jiàn)疾病進(jìn)行治療。如今，核酸藥物治療仍處于全球抗擊2019 冠狀病毒?。–OVID-19）大流行努力的前沿［2-4］。

核酸類(lèi)藥物能夠根據(jù)核苷酸的序列信息調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。這些藥物發(fā)揮功能要么是基于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)，要么是通過(guò)基因調(diào)節(jié)，特別是那些具有互補(bǔ)序列的基因的調(diào)節(jié)。這些機(jī)制為核酸藥物提供了一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)，即無(wú)論目標(biāo)分子的定位或結(jié)構(gòu)如何，核酸藥物都可以被設(shè)計(jì)，用來(lái)靶向這些小分子或抗體無(wú)法達(dá)到的目標(biāo)分子。本文主要綜述了三種核酸類(lèi)藥物：DNA 藥物、信使RNA（mRNA）藥物以及小干擾RNA（siRNA）藥物的工作原理及應(yīng)用等。但是考慮到它們的大體積和負(fù)電荷的特點(diǎn)，以及基因在體內(nèi)遞送存在的生物屏障，這些大分子的遞送通常需要經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)的改性，或者需要一些遞送系統(tǒng)如納米遞送系統(tǒng)的結(jié)合來(lái)達(dá)到長(zhǎng)期有效的治療效果。

1 核酸藥物的分類(lèi)

1.1 DNA 藥物 反義寡核苷酸（ASO）作為一種常見(jiàn)的DNA 類(lèi)藥物，是長(zhǎng)度在13 ～30 堿基的單鏈短DNA 序列。ASO 通過(guò)利用與靶基因互補(bǔ)的寡核苷酸序列，在靶點(diǎn)位形成DNA/RNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因功能被抑制。ASO 除了靶向mRNA 基因外，也可以靶向Micro RNA（miRNAs），在這種情況下，靶向miRNA 的ASO 被稱(chēng)為antimir 或antagomir［5-6］。ASO 發(fā)揮作用的方式不僅可以通過(guò)形成一個(gè)強(qiáng)大的雙鏈結(jié)構(gòu)導(dǎo)致空間位阻，還可以誘導(dǎo)RNase H切割RNA 鏈。RNase H 是一種內(nèi)源性酶，能夠識(shí)別DNA/RNA 雙鏈，并特異地切割RNA 鏈。因此，ASOs形成的雙鏈可以催化RNase H的定向切割［7］。

ASOs 的研究早于其他核酸藥物。Fomivirsen是一種ASO 藥物，于1998年被批準(zhǔn)為美國(guó)第一個(gè)核酸藥物［8］。隨后批準(zhǔn)用于臨床的反義寡核苷酸藥物還有mipomersen［9］和inotersen［10］等。

1.2 mRNA 類(lèi)藥物 mRNA 類(lèi)藥物由成百上千個(gè)核苷酸組成。不同于以寡核苷酸為基礎(chǔ)的藥物類(lèi)別，mRNA 藥物能夠直接導(dǎo)入靶細(xì)胞，以蛋白質(zhì)的形式表達(dá)［11-12］。mRNA 藥物不需要細(xì)胞核定位，從而避免了基因組整合導(dǎo)致的突變，因此，這些藥物被認(rèn)為是高度安全的。WOLFF等［13］在1990年首次報(bào)道了肌內(nèi)注射mRNA 到小鼠骨骼肌誘導(dǎo)編碼蛋白的表達(dá)。從那時(shí)起，以mRNA 為基礎(chǔ)的治療方法在各種應(yīng)用中得到了研究，包括癌癥治療、傳染病疫苗、蛋白質(zhì)替代和細(xì)胞基因工程。特別是自2020年COVID-19 大流行爆發(fā)以來(lái)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）疫苗的臨床試驗(yàn)進(jìn)展迅速。例如：2021年8月23日，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）首次批準(zhǔn)的Comirnaty COVID-19疫苗以及2020年12月18日FDA 批準(zhǔn)的Moderna COVID-19 疫苗，都屬于mRNA 類(lèi)核酸藥物。

1.3 siRNA 類(lèi)藥物 合成的siRNA 是雙鏈RNA，是模仿細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA 專(zhuān)一性RNA 內(nèi)切酶（Dicer 酶）將外源性雙鏈RNA（dsRNA）切割的產(chǎn)物，一般為20～30 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度［14-15］。當(dāng)外源性的siRNA 進(jìn)入細(xì)胞后，與細(xì)胞內(nèi)的解旋酶以及其他因子結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）［16］。激活的RISC 通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則定位到同源mRNA 轉(zhuǎn)錄本上，在距離siRNA 3′端12個(gè)堿基處切割mRNA，特異性地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞呈現(xiàn)出特定基因表達(dá)降低表型。siRNA 對(duì)于由基因異常表達(dá)或基因突變引起的疾病，如癌癥、病毒感染和遺傳疾病等的治療具有巨大的應(yīng)用潛力。并且由于其RNA 干擾過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，不需要穿透細(xì)胞核，這使siRNA 核酸藥物的開(kāi)發(fā)更具吸引力。Patisiran 是2018年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的第一種siRNA 藥物［17］，在此之后，2020年FDA 又相繼批準(zhǔn)三種siRNA 類(lèi)核酸藥物。

2 核酸藥物面臨的挑戰(zhàn)及解決辦法

核酸藥物具有其他藥物所沒(méi)有的優(yōu)異性能，但也面臨著諸多挑戰(zhàn)。事實(shí)上，未經(jīng)修飾的核酸根本無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，除了由于核酸本身的低穩(wěn)定性外，還包括半衰期短、容易被內(nèi)源性核酸酶降解、被腎小球過(guò)濾并經(jīng)過(guò)尿液排出體外、被細(xì)胞攝取效率低以及核酸的免疫原性等，使得核酸藥物的臨床應(yīng)用受到極大的限制［18-19］。大多數(shù)已獲批或正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)的核酸藥物，要么是局部給藥（包括鞘內(nèi)給藥），要么是通過(guò)全身循環(huán)肝臟給藥，研究者們一直在為將核酸藥物高效傳遞到其他組織（如腫瘤組織）中而努力。目前所應(yīng)用較多的提高核酸藥物遞送效率的方法包括核酸藥物化學(xué)修飾和納米遞送系統(tǒng)。

2.1 核酸藥物的化學(xué)修飾 為保證核酸藥物的成藥性，提高其抗酶解的能力等，研究者對(duì)核酸藥物進(jìn)行了各種化學(xué)修飾。此類(lèi)修飾主要包括：堿基修飾、磷酸基團(tuán)上的修飾、核糖部分的修飾、核糖-磷酸骨架修飾以及針對(duì)核酸藥物的組合修飾等。

堿基修飾中一般在嘧啶堿基的5′-位以及嘌呤堿基的8′-位引入羧基、咪唑基、芳香基以及氨基等功能基團(tuán)，來(lái)達(dá)到增強(qiáng)對(duì)靶基因的親和性、提高核酸藥物的化學(xué)活性以及穩(wěn)定性等目的；磷酸基團(tuán)的修飾作為目前使用最廣泛的修飾方法，其典型例子包括硫代磷酸化［20］，核苷酸鏈中磷酸基團(tuán)上帶雙鍵的氧原子被硫原子取代。一方面，使得修飾之后的核酸類(lèi)藥物具有抗核酸酶降解，并增強(qiáng)與血漿蛋白的結(jié)合，阻止快速的腎清除，增強(qiáng)其生物利用度。另一方面，硫代修飾序列與靶RNA形成的雜交雙螺旋片段能被RNase H 識(shí)別并降解靶RNA。但是不足之處是高濃度帶來(lái)的免疫毒性的副作用，以及對(duì)靶序列的親和性相對(duì)較低；核糖部分的修飾中較為常見(jiàn)的是在核酸中糖2′-位引入一個(gè)取代基的修飾［20］。2′-甲氧基、2′-甲氧基乙氧基和2′-氟是具有糖基的核酸最常見(jiàn)的修飾［21-22］。此外，2′-O，4′-C-亞甲基橋連核酸/鎖定核酸（2′，4′-BNA/LNA）、2′-O、4′-C-乙烯橋連核酸（ENA）等核糖部分的修飾都可以增強(qiáng)核酸酶的穩(wěn)定性和對(duì)靶標(biāo)RNA 的親和力；核糖-磷酸骨架修飾主要有兩種方式：?jiǎn)徇柞６饭丫垠w（PMO）［23］和肽核酸（PNA）［24］修飾。高親和性的PMO 具有很好的水溶性，能夠與各種RNA 結(jié)合，以達(dá)到干擾RNA 剪接和抑制mRNA 翻譯的效果，有幾種此類(lèi)核酸藥物已處于臨床試驗(yàn)階段；組合修飾的方法能夠有效避免單一修飾所帶來(lái)的弊端，例如：糖修飾的核酸由于其高的RNA 結(jié)合強(qiáng)度，有助于形成強(qiáng)大的雙鏈，然而RNase H 不能識(shí)別它們。因此，通常引入gapmer 結(jié)構(gòu)，其中糖修飾的核酸放置在ASO 的兩端，PS-DNA 修飾部分放置在中間，中間的PS-修飾部分可以被RNase H 識(shí)別，達(dá)到降解mRNA 的目的［25］。

2.2 納米遞送系統(tǒng) 病毒載體是應(yīng)用最早的核酸藥物體內(nèi)遞送的載體，但是由于其本身難以大規(guī)模制備、具有潛在的免疫原性和致突變性等缺點(diǎn)［26］，目前已經(jīng)不是核酸藥物體內(nèi)遞送的首選。理想的核酸藥物遞送系統(tǒng)通常需要具備五個(gè)條件：（1）生物相容性較好，不引起機(jī)體的免疫反應(yīng)；（2）體內(nèi)血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，不被核酸酶降解；（3）靶向性較好，在病灶部位富集量高；（4）細(xì)胞攝取量高；（5）被細(xì)胞攝取之后能夠快速高效地從內(nèi)涵體中逃逸出來(lái)。因此，非病毒載體尤其是納米載體，由于其較好的生物相容性、低的免疫原性以及容易被大規(guī)模制備等特點(diǎn)，成為核酸載體選擇的新起之秀［27］。

以惡性腫瘤為例，研究者們基于實(shí)體瘤組織特殊的生理微環(huán)境［28-29］，如：弱酸、缺氧環(huán)境、特定酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的過(guò)度表達(dá)、腫瘤細(xì)胞中存在高水平的反應(yīng)活性氧（ROS）以及高濃度的還原性物質(zhì)如谷胱甘肽（GSH）等特點(diǎn)，構(gòu)建了一系列腫瘤微環(huán)境響應(yīng)型納米載體。例如：本團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成的一種包含酸響應(yīng)基團(tuán)的腫瘤組織弱酸性響應(yīng)納米材料Meo-PEG-b-PHMEMA［30］，該材料的pKa為6.9接近腫瘤組織pH（6.5～6.8）。該納米載體上的親水性的PEG 外殼能夠大大延長(zhǎng)siRNA的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間［31］，當(dāng)納米載體利用腫瘤組織的高滯留效應(yīng)（EPR 效應(yīng)）富集到腫瘤組織后，PHMEMA 鏈被質(zhì)子化導(dǎo)致納米結(jié)構(gòu)的解散［32］，疏水性的內(nèi)殼siRNA 與兩親性功能肽TCPA 復(fù)合物釋放出來(lái)，隨后TCPA 一方面利用其結(jié)構(gòu)中的RGD肽序列攜帶siRNA 靶向腫瘤細(xì)胞，另一方面利用其結(jié)構(gòu)中具有膜穿透功能的寡聚精氨酸序列協(xié)助siRNA 的內(nèi)涵體逃逸，達(dá)到基因沉默從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的；除此之外研究者還利用乏氧響應(yīng)基團(tuán)2-硝基咪唑［33］、偶氮苯基團(tuán)［34］設(shè)計(jì)了一系列乏氧響應(yīng)型納米載體；由于腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性較高，WANG 等［35］設(shè)計(jì)合成了一種基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9（MMP-2/9）響應(yīng)的兩親型高分子材料聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PEG-PCL）向腫瘤部位遞送siRNA；依據(jù)苯硼酸或苯硼酸酯的ROS響應(yīng)性，LI 等［36］設(shè)計(jì)制備了一種苯硼酸修飾的ROS 響應(yīng)的納米載體用于siRNA 的體內(nèi)遞送和結(jié)腸癌治療；同時(shí)基于腫瘤細(xì)胞內(nèi)一些抗氧化物質(zhì)（如GSH）表達(dá)較高［37］，本團(tuán)隊(duì)［38-39］設(shè)計(jì)合成一種GSH 響應(yīng)的Cys-PDSA 納米載體，用于MYC siRNA（siMYC）或Kinesin family member 11 siRNA（siKIF11）的體內(nèi)遞送和前列腺癌治療。

3 總結(jié)與展望

將核酸藥物安全高效的遞送入細(xì)胞并發(fā)揮其編輯、剪接、替換或抑制的功能，實(shí)現(xiàn)致病基因的長(zhǎng)期抑制以及抑病基因的過(guò)表達(dá)，是一種理想的治療方案。從1990年第一次將基因?qū)爰?xì)胞并成功表達(dá)，到如今已經(jīng)有多種核酸藥物經(jīng)過(guò)審批并應(yīng)用于臨床治療。核酸藥物在化學(xué)修飾、遞送載體等方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，除小分子藥物和抗體藥物外，核酸藥物正在被建立成為第三種治療模式。利用核酸藥物不同于常規(guī)藥物的特點(diǎn)，能夠針對(duì)性選擇靶點(diǎn)，對(duì)一些不存在治療藥物的罕見(jiàn)疾病開(kāi)發(fā)出核酸藥物。但是到目前為止，核酸藥物依然沒(méi)有被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)疾病的治療。希望研究者們對(duì)生物學(xué)的進(jìn)一步了解能夠幫助克服與核酸藥物相關(guān)的挑戰(zhàn)，并在不久的將來(lái)增加新的治療選擇。