三種基源冰片對不同分子量藥物促透效果的差異研究

廖玉瑤 郭淑娟 周晴 楊翠婷 石艷雙 戴幸星 史新元

冰片屬芳香開竅藥，能引藥由肌表直達(dá)腠理，是目前應(yīng)用較廣泛的中藥揮發(fā)油類促透劑之一[1-3]。根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，冰片有三種基源，包括天然冰片(右旋龍腦)、艾片(左旋龍腦)、合成冰片(合成龍腦)[4]。三者性味歸經(jīng)、功能主治、用法用量相近，因此在臨床用藥上并未嚴(yán)格區(qū)分。由于天然冰片與艾片產(chǎn)量少、成本高，在臨床應(yīng)用上主要以合成冰片為主[5]。但是三種基源冰片的旋光性不同，化學(xué)成分有差異，不同基源的冰片與待促透藥物及角質(zhì)層之間均存在相互選擇，這有可能導(dǎo)致對藥物促透效果的差異，葉惠嫻等[6]發(fā)現(xiàn)天然冰片較合成冰片對大黃素的促透效果更強(qiáng)，而陸洋等[7]發(fā)現(xiàn)合成冰片較艾片對梔子苷的促透效果更強(qiáng)。那么這三者在臨床應(yīng)用上是否可以互為替代品，不加區(qū)別呢？特別是對于低成本的合成冰片，如果可以相互替代，顯然是減少成本并保護(hù)植物資源的好選擇。因此，研究三種基源冰片對藥物促透效果的影響，可為冰片的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

藥物分子量(molecular weight，MW)是影響其經(jīng)皮吸收的主要因素之一。有研究認(rèn)為適宜的經(jīng)皮吸收藥物應(yīng)該具有較小的MW、較高的溶解度、較低的熔點(diǎn)以及合適的分配系數(shù)對數(shù)值(logP值，其在1～3范圍內(nèi)更易于透皮)[8-9]。對于MW較大的藥物而言，尋找可行的經(jīng)皮促透方法，是經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的一大挑戰(zhàn)。因此，本文選擇兩種logP值一致(logP=1.3)，但MW差異較大的藥物川芎嗪(MW=136)與秋水仙堿(MW=399)為模型藥物，考察三種基源冰片對其促透效果的差異，為冰片在中藥外用制劑中的合理應(yīng)用提供參考，也為川芎嗪和秋水仙堿經(jīng)皮給藥制劑研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康雄性SD大鼠，5～6周齡，體質(zhì)量(200±10)g，由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。

1.2 試劑與儀器

天然冰片(批號(hào)：FY24030602)、艾片(批號(hào)：FY2403WG09)、合成冰片(批號(hào)：FY2035GA01)、秋水仙堿(批號(hào)：FY15000715)純度均≥95%，購自南通飛宇生物科技有限公司；川芎嗪(批號(hào)：r03822)純度≥98%，購自百奧百樂生物科技有限公司；乙腈(色譜純，批號(hào)：175157)、甲醇(色譜純，批號(hào)：155759)，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。無水乙醇(分析純，批號(hào)：20170515)，購自北京化工廠；蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；PBS緩沖液(pH = 7.2～7.4，批號(hào)：20171120)，購自北京索萊寶科技有限公司。

高效液相色譜儀(1260，美國安捷倫科技公司)，智能透皮擴(kuò)散儀(TP-6，天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司)，電子天平(BP211D，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 川芎嗪和秋水仙堿含量測定方法的建立

1.3.1 色譜條件 川芎嗪：Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—水(40∶60)，流速1 mL/分鐘，檢測波長282 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。秋水仙堿： Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水溶液(45∶55)，流速1 mL/分鐘，檢測波長353 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對照品溶液的配制 川芎嗪：精密稱取川芎嗪對照品30.5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解并定容，即得濃度為610 μg/mL的川芎嗪對照品溶液。秋水仙堿：精密稱取秋水仙堿對照品10.3 mg，置25 mL容量瓶中，加適量甲醇使溶解并定容，即得濃度為412 μg/mL的秋水仙堿對照品溶液。

1.3.3 方法專屬性考察 分別取透皮實(shí)驗(yàn)空白接收液、川芎嗪和秋水仙堿對照品溶液、川芎嗪和秋水仙堿體外透皮實(shí)驗(yàn)接收液，按其色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示接受液中其他成分對川芎嗪和秋水仙堿的測定無干擾。

1.3.4 線性關(guān)系考察 川芎嗪：精密移取川芎嗪對照品溶液0.5、1、3、5、8、10 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容至10 mL，得到系列濃度的川芎嗪對照品溶液，按其色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。川芎嗪對照品回歸方程為Y= 29.34X+179.89，r= 0.9996，表明川芎嗪在30.05～610.00 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。秋水仙堿：精密移取秋水仙堿對照品溶液0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1、2 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容至10 mL，得到系列濃度的秋水仙堿對照品溶液，按其色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。秋水仙堿對照品回歸方程為Y=24.57X+6.77，r= 0.9994，表明秋水仙堿在0.41～82.40 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.3.5 精密度考察 分別取川芎嗪線性范圍內(nèi)低、中、高三個(gè)濃度(30.05、305.00、610.00 μg/mL)和秋水仙堿線性范圍內(nèi)低、中、高三個(gè)濃度(2.06、41.20、82.40 μg/mL)的對照品溶液，每個(gè)濃度1日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，按其色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算二者的日內(nèi)精密度；以上樣品連續(xù)3天內(nèi)進(jìn)樣，按其色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算二者的日間精密度。川芎嗪低、中、高三個(gè)濃度的日內(nèi)精密度分別為0.13%、0.10%、0.09%，日間精密度分別為0.37%、0.15%、1.39%，均小于2.0%；秋水仙堿低、中、高三個(gè)濃度的日內(nèi)精密度分別為0.90%、0.36%、0.15%，日間精密度分別為1.74%、0.67%、0.40%，均小于2.0%。以上結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.3.6 穩(wěn)定性考察 分別取川芎嗪和秋水仙堿體外透皮實(shí)驗(yàn)接收液，分別于0、4、8、12、24、36 小時(shí)進(jìn)樣分析，測得川芎嗪RSD為1.12%，秋水仙堿RSD為1.56%。表明川芎嗪和秋水仙堿體外透皮接收液在36小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

1.4 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

1.4.1 供試品溶液的制備 分別取三種基源冰片和藥物適量，置2 mL容量瓶中，加80%丙二醇溶液適量使溶解并定容，即得含冰片30 mg/mL(3%)和含藥物 30 mg/mL(3%)的供試品溶液。

1.4.2 體外透皮實(shí)驗(yàn) 取雄性SD大鼠處死后，剃除腹部毛發(fā)，剪取腹部正中部位皮膚，去除皮下脂肪組織，用PBS緩沖液清洗干凈，備用。將處理后的大鼠腹部皮膚固定于Franz擴(kuò)散池之間(擴(kuò)散池有效擴(kuò)散面積為3.14 cm2，接收池體積為20 mL)，供給池分別加入2 mL供試品溶液，為使接收池中藥物溶解達(dá)漏槽條件，接收池中選擇含20%乙醇的PBS緩沖液為透皮接收液。溫度設(shè)置為32℃，接收池?cái)嚢柁D(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為300 r/分鐘。分別于0、2、4、6、8、10、12小時(shí)在接收池取樣1 mL，并補(bǔ)充等體積的空白接收液，所得樣品過濾后，采用HPLC測定接收液中藥物的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

藥物的單位面積累計(jì)滲透量Qn，μg/cm2按下式計(jì)算:

其中，Cn和Ci為第n個(gè)和第i個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度，V0為擴(kuò)散池接收室體積(20 mL)，Vi為每次取樣的體積(1 mL)，A為皮膚有效面積(3.14 cm2)。

將Qn與時(shí)間作圖得到藥物經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)曲線，其中直線部分(6～12小時(shí))的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率[J，μg/(cm·h)]，直線部分反向延長線與X軸的交點(diǎn)即為滯后時(shí)間(Tlag，h)。促透效率(ER)按下式計(jì)算:

ER=Je/J0

其中，Je為加入促滲劑之后的穩(wěn)態(tài)透皮數(shù)率，J0為不加促滲劑的穩(wěn)態(tài)透皮速率。

2 結(jié)果

2.1 不同基源冰片對川芎嗪經(jīng)皮滲透的影響

三種基源冰片對川芎嗪的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)曲線及相關(guān)滲透參數(shù)見圖1和表1。結(jié)果顯示，對照組川芎嗪的12小時(shí)累計(jì)滲透量達(dá)到(2004.47±351.82) μg/cm2，川芎嗪由于自身分子量小，具有良好的經(jīng)皮滲透能力。分別加入三種冰片后，川芎嗪的累計(jì)滲透量增加到1～2倍，表明三種基源冰片對川芎嗪均有明顯的促透作用，但三者促透效果的差異不顯著。同時(shí)，相比于天然冰片與艾片，合成冰片的滯后時(shí)間小于對照組川芎嗪，表明合成冰片能縮短川芎嗪的起效時(shí)間。綜合促透效率與滯后時(shí)間，三種基源冰片促透的效果排序?yàn)椋汉铣杀?天然冰片>艾片。

注：A 天然冰片；B 艾片；C 合成冰片；D 對照組。

2.2 不同基源冰片對秋水仙堿經(jīng)皮滲透的影響

三種基源冰片對秋水仙堿的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)曲線及相關(guān)滲透參數(shù)見圖2和表2。結(jié)果顯示，對照組秋水仙堿的12小時(shí)累計(jì)滲透量為(100.15±59.85)μg/cm2，秋水仙堿由于分子量大，自身的透皮能力較差。分別加入三種冰片后，秋水仙堿的累計(jì)滲透量增加到3～6倍，表明三種冰片對秋水仙堿均有明顯的促透作用，且三者間存在顯著差異。三種冰片的滯后時(shí)間均小于對照組秋水仙堿，表明其均能縮短秋水仙堿的起效時(shí)間。綜合促透效率與滯后時(shí)間，三種基源冰片促透的效果排序?yàn)椋禾烊槐?合成冰片>艾片。

注：A 天然冰片；B 艾片；C 合成冰片；D 對照組。

滲透動(dòng)力學(xué)曲線(n=3)

2.3 不同基源冰片對兩種分子量藥物促透效率的比較

三種基源冰片對兩種分子量大小藥物的促透效果如表3所示。對于同一藥物，三種基源冰片的促透效率存在差異，盡管三種冰片對川芎嗪促透效果的差異并不顯著，但從數(shù)值上可以觀察到對于兩種藥物而言，天然冰片與合成冰片的促透效果更強(qiáng)。此外，三種基源冰片對秋水仙堿的促透效率均顯著高于川芎嗪的促透效率，表明三種冰片對大分子藥物的促透效果更佳。

表3 不同基源冰片對兩種分子量藥物的促透效率

3 討論

本文研究結(jié)果表明，對于同一藥物而言，三種基源冰片的促透效果有所差異，其中天然冰片與合成冰片均顯示出較艾片更好的促透效果。不論何種冰片，最主要的功效成份都是龍腦(2-莰醇)，但純度和旋光性有所差別，天然冰片應(yīng)含右旋龍腦96%以上，艾片應(yīng)含左旋龍腦85%以上，合成冰片中消旋龍腦含量應(yīng)在55%以上[10]，這造成了三種基源冰片在透皮吸收、黏膜滲透、體內(nèi)藥效等多方面的差異[11-13]。此外，冰片促透的主要作用部位在皮膚的角質(zhì)層，富含手性物質(zhì)神經(jīng)酰胺[14]。因此，基于三種基源冰片的旋光性與角質(zhì)層神經(jīng)酰胺的手性中心，促透劑與皮膚之間可能存在立體選擇性[15-16]，導(dǎo)致三種冰片的促透效果差異。對于不同分子量的藥物而言，三種基源冰片對秋水仙堿的促透效率均大于對川芎嗪的促透效率，表明冰片對分子量較大的藥物比對分子量較小的藥物促透效果更顯著。角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮吸收的主要屏障，其脂質(zhì)排列緊密， 間隙小[17]， 分子量較大的藥物不易穿透角質(zhì)層脂質(zhì)，滲透能力弱。已有研究表明，冰片的促透機(jī)制包括擾亂角質(zhì)層類脂與誘導(dǎo)瞬時(shí)孔等[18]，從而能有效地促進(jìn)大分子量藥物的經(jīng)皮滲透[19]。

表1 不同基源冰片對川芎嗪的相關(guān)滲透參數(shù)

表2 不同基源冰片對秋水仙堿的相關(guān)滲透參數(shù)

受資源與成本的限制，目前市場上以合成冰片為主，但有研究認(rèn)為合成冰片在很大程度上效果不及天然冰片[5]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，三種基源冰片均能顯著提高兩種分子量藥物的體外經(jīng)皮滲透率。對小分子藥物，合成冰片有較好的促透效果；對于難以透皮吸收大分子藥物，三種冰片均具有高于小分子的促透效果，合成冰片的促透效果雖不及天然冰片，但高于艾片。因此，從來源與成本角度考慮，在以冰片為促透劑的現(xiàn)代中藥外用制劑研發(fā)中，合成冰片是可行的選擇。